過表達RimL的大腸桿菌及其在製備N-乙醯化胸腺素α中的應用的製作方法

2024-01-20 16:40:15

專利名稱：：過表達RimL的大腸桿菌及其在製備N-乙醯化胸腺素α中的應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物
技術領域：
，尤其涉及一種過表達RimL的大腸桿菌及其在製備N-乙醯化胸腺素α中的應用。
背景技術：
：蛋白和多肽的N-末端乙醯化修飾是真核細胞中普遍存在的一種修飾，50%以上的真核細胞胞漿蛋白都有這種修飾。初步的功能研究表明N-末端乙醯化可通過改變N-端的電荷性，封閉N端等方式，對許多蛋白和多肽的空間結構、配體識別、抗降解等特性產生重要影響。如小分子GIPaes-Arl3P蛋白的N-末端乙醯化修飾促進了其與膜受體Syslp/hSysl的識別，並使其定位到膜上。胎兒血紅蛋白的N-末端乙醯化可以使其四聚體的解聚能力提高30倍。胸腺素α1(thymosinα1，Tα1)的Ν_末端乙醯化對其在血漿中的穩定性具有重要作用。除了Τα1外，還有如黑色素細胞刺激素(Melanocyte-MimulatingHormones,a-MSH)、胸腺素β4(Thymosinβ4，Tβ4)等一批在臨床上具有重要應用的多肽也需要N-末端乙醯化修飾。與真核生物中的普遍存在現象明顯不同的是，原核生物的N-末端乙醯化修飾非常罕見。在大腸桿菌內源蛋白中已知發生N-末端乙醯化修飾的只有核糖體亞基L7、S5、S18、延長因子EF-Tu和伴侶蛋白kcB等為數不多的幾種蛋白。大腸桿菌中已經發現的參與蛋白和多肽的N-末端乙醯化修飾的乙醯基轉移酶只有負責核糖體亞基S5乙醯化修飾的RimI，核糖體亞基S18乙醯化修飾的RimJ，和核糖體亞基L7乙醯化修飾的RimL。這些乙醯基轉移酶有很強的底物專一性。除上述每個酶對應的特異性底物外，未知其能修飾大腸桿菌的其它蛋白或多肽。胸腺素α是一族具有相同或相似的N-端序列的免疫調節多肽，它們包括胸腺素α原、胸腺素a1、胸腺素a11及其各種融合蛋白等。胸腺素a1和胸腺素a11是胸腺素α原在體內降解的產物，它們分別包括了胸腺素α原的化端觀和35個胺基酸。不同物種的胸腺素α具有很高的保守性。胸腺素α的胺基酸序列上某些位點存在多態性，如其N-端第13位胺基酸殘基，有的是蘇氨酸，有的是異亮氨酸，它們具有相同或相似的功能。胸腺肽是一類動物胸腺中提取的包含各種胸腺素α及其它胸腺來源肽類的免疫製劑，已廣泛用於病毒性肝炎、腫瘤等的治療。但動物提取的胸腺肽存在成分複雜，純度低，其中混有動物來源的汙染物，易產生過敏反應等問題。化學合成的N-乙醯化胸腺素al，是一種採用多肽化學合成方法製備的N-乙醯化胸腺素a1，此種方法獲得的Ta1純度高、活性高、沒有明顯的副反應，如kiClone公司的「日達仙」，已被包括我國在內的多個國家批准用於病毒性肝炎的治療獲作為免疫調節藥物；但化學合成N-乙醯化胸腺素a1這樣一個觀個胺基酸的多肽，合成和純化工藝複雜，得率較低，因此製品價格高，限制了該藥的廣泛應用。
發明內容本發明的一個目的是提供一種重組菌。本發明提供的重組菌，為如下1)或2)1)將RimL的編碼基因和胸腺素α的編碼基因導入宿主菌中得到的重組菌；所述宿主菌為基因組中含有RimL編碼基因的宿主菌；2)將胸腺素α的編碼基因導入如下所述的重組菌中得到的重組菌；所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述胸腺素α為一種多肽或蛋白，其N末端的觀個胺基酸殘基與序列表中序列3的N末端的觀個胺基酸相同或其N末端的觀個胺基酸殘基與序列表中序列3的N末端的28個胺基酸至少具有90%同源性。所述一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為10個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。1)所示的重組菌中，所述將RimL的編碼基因和胸腺素α的編碼基因導入宿主菌的方法包括如下步驟a)將所述RimL的編碼基因通過重組載體2導入所述宿主菌，得到重組菌A；b)將所述胸腺素α的編碼基因通過重組載體1導入步驟a)得到的所述重組菌A，得到重組菌；所述重組載體1為所述胸腺素α編碼基因插入表達載體1中，得到表達胸腺素α的重組載體1；所述表達載體1優選為PBV220；所述重組載體1具體為將所述胸腺素α編碼基因插入PBV220的BamHI和EcoRI酶切位點間，得到表達胸腺素α的重組載體1；所述重組菌A為將所述RimL的編碼基因通過重組載體2導入宿主菌中，得到的重組菌A；所述表達載體2優選為pOKBV；所述重組載體2具體為將所述RimL的編碼基因插入pOKBV載體中的EcoRI和MlI酶切位點間中，得到表達RimL的重組載體2。1)所示的重組菌中，所述宿主菌為大腸桿菌；所述RimL編碼基因是如下1)或2)任一所示的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)與1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；所述胸腺素α編碼基因為一種多核苷酸，其核苷酸序列與序列表中的序列4的5』末端起84位核苷酸相同或者與序列表中的序列4的5』末端起84位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子。本發明的另一個目的是提供一種重組菌Α。本發明提供的重組菌Α，為將所述RimL的編碼基因通過重組載體導入宿主菌中，得到的重組菌A；所述重組載體為將所述RimL的編碼基因插入表達載體中，得到表達RimL的重組載體，所述表達載體是通過誘導型啟動子控制RimL的編碼基因表達的。所述誘導型啟動子為乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、鹼性磷酸酯酶啟動子、色氨酸啟動子、噬菌體T7、PL,Pe啟動子或含有這些啟動子部分元件的雜合啟動子Tac、PJV所述表達載體優選為P0KBV。本發明的第三個目的是提供一種重組菌。本發明提供的重組菌，為將外源誘導型啟動子插入宿主菌的乙醯基轉移酶編碼基因的上遊，用於啟動所述乙醯基轉移酶編碼基因的表達，得到的重組菌。所述誘導型啟動子為乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、鹼性磷酸酯酶啟動子、色氨酸啟動子、噬菌體T7、PL,Pe啟動子或含有這些啟動子部分元件的雜合啟動子Tac、PJV所述宿主菌為大腸桿菌；所述的誘導型啟動子為噬菌體T7啟動子，其核苷酸序列為序列表中序列5的自5』末端第1119-1135位核苷酸；所述乙醯基轉移酶為RimL，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的胺基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。上述重組菌按照如下方法製備1)將pKD46質粒導入宿主菌中，得到重組菌1；2)將含有T7啟動子的DNA分子導入步驟1)得到的重組菌1中，得到重組菌2；3)將步驟2、得到的重組菌2分別在含氯黴素的培養基和含氨苄青黴素的培養基中培養，若能在含氯黴素的培養基上生長，但不在含氨苄青黴素的培養基生長的即為重組菌；所述含有T7啟動子的DNA分子的核苷酸序列為序列表中的序列5的1119-1135位核苷酸。所述的重組菌在製備N-乙醯化胸腺素α中的應用也是本發明保護的範圍。本發明的第四個目的是提供一種製備N-乙醯化胸腺素α的方法。本發明提供的方法，包括如下步驟發酵所述的重組菌，收集發酵產物，即得到N-乙醯化胸腺素α；所述發酵的溫度為42°C，所述發酵時間為12h。本發明的實驗證明，本發明構建了N-乙醯基轉移酶RimL和胸腺素α的編碼基因進行共表達得到的重組菌，發酵該重組菌，得到胸腺素α均大多為N-乙醯化胸腺素α，不僅可以提高N-乙醯化胸腺素α的產率，而且可以通過減少非乙醯化胸腺素α的比例，方便N-乙醯化胸腺素α的分離，具有明顯的應用前景。圖1為過表達RimL的SDS-PAGE分析圖2為大腸桿菌中過表達RimL對α乙醯化水平的影響(橫坐標表示洗脫時間(min)，縱坐標代表紫外吸收值(mAU))圖3為red同源DNA分子結構示意4為大腸桿菌中T7誘導表達基因組中RimL對α乙醯化水平的影響(橫坐標表示洗脫時間(min)，縱坐標代表紫外吸收值(mAU))具體實施例方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述的序列均可人工合成。實施例1、表達胸腺素α的RimL過表達的大腸桿菌的構建一、N-乙醯基轉移酶RimL過表達的大腸桿菌的構建1、pOKBV質粒的構建因要共表達RimL和胸腺素α，考慮到質粒不相容性，遂將pBV220(購自上海閃晶分子生物科技有限公司。)的複製子和氨苄青黴素抗性基因替換為質粒P0K12(JeffreyVieiraandJoachimMessing.NewpUC-derivedcloningvectorswithdifferentselectablemarkersandDNAreplicationorigins·Gene，1991，100:189_194，可從該文獻提供的信息中構建，載體的構建方法已在許多文獻公開(如j.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1995；p0K12載體Genbank號為AF223639，根據已經公開的序列資料庫，如美國國立衛生研究院(NIH)的基因庫(Genbank)等中找到，因此可以利用基因全合成的方式獲得。)的P15A複製子和卡那黴素抗性基因，具體如下以質粒pBV220為模板，用引物220-5』SphI(AAAAGCATGCAGAGCGCCCTTATCTTTCCCTTTAT)及220-3，SacI(AAAAGAGCTCATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGG)擴增，得到1.8k的PCR產物，即為PBV220的溫敏操縱子。用SphI及Mel酶切上述得到的PBV220的溫敏操縱子，得到酶切產物，將酶切產物與經過同樣酶切得到質粒P0K12載體片段連接，得到的連接產物轉入DH5α感受態細胞，挑取單克隆，提取質粒送去測序，結果為該質粒為將PBV220的溫敏操縱子插入質粒Ρ0Κ12的SphI及Mel酶切位點間得到的質粒，將該質粒命名為pOKBV，將含有該質粒的菌命名為DH5α/pOKBVο2、RimL基因的克隆提取大腸桿菌DH5ci(購自北京全式金生物技術有限公司，目錄號⑶201)的基因組DNA為模板(方法見J.薩姆布魯克等，《分子克隆實驗指南》第二版，科學出版社，1995)，用引物L5』-EcoRI(AAAAGAATTCATGACTGAAACGATAAAAGTAAGCGAA)禾ΠL3，-SalI(AAAAGTCGACTTATTGTGAATCGATAATACGCGCGTA)進行PCR擴增，得到540bp的PCR產物，經過測序，該PCR產物具有序列表中序列1所示的核苷酸，其胺基酸序列為序列2，經過比對為N-乙醯基轉移酶RimL。表1為RimL胺基酸序列的網上比對部分結果權利要求1.一種重組菌，為如下1)或2)1)將RimL的編碼基因和胸腺素α的編碼基因導入宿主菌中得到的重組菌；所述宿主菌為基因組中含有RimL編碼基因的宿主菌；2)將胸腺素α的編碼基因導入如下權利要求6-8中任一所述的重組菌中得到的重組菌；所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的DNA序列至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白；所述胸腺素α為一種多肽或蛋白，其N末端的觀個胺基酸殘基與序列表中序列3的N末端的觀個胺基酸相同或其N末端的觀個胺基酸殘基與序列表中序列3的N末端的觀個胺基酸至少具有90%同源性。2.根據權利要求1所述的重組菌，其特徵在於1)所示的重組菌中，所述將RimL的編碼基因和所述胸腺素α的編碼基因導入宿主菌的方法包括如下步驟a)將所述RimL的編碼基因通過重組載體2導入所述宿主菌，得到重組菌A；b)將所述胸腺素α的編碼基因通過重組載體1導入步驟a)得到的所述重組菌A，得到重組菌；所述重組載體1為所述胸腺素α編碼基因插入表達載體1中，得到表達胸腺素α的重組載體1；所述表達載體1優選為PBV220；所述重組載體2為將所述RimL的編碼基因插入表達載體2中，得到表達RimL的重組載體2，所述表達載體2優選為pOKBV。3.根據權利要求1或2所述的重組菌，其特徵在於1)所示的重組菌中，所述宿主菌為大腸桿菌；所述RimL編碼基因是如下1)或2)所示的DNA分子1)序列表中序列1所示的DNA分子；2)與1)限定的DNA序列至少具有90%同源性且編碼具有相同功能的蛋白的DNA分子；所述胸腺素α編碼基因為一種多核苷酸，其核苷酸序列與序列表中的序列4的5』末端起84位核苷酸相同或者與序列表中的序列4的5』末端起84位核苷酸同源性至少具有90%的DNA分子。4.一種重組菌Α，為將所述RimL的編碼基因通過重組載體導入宿主菌中，得到的重組菌A；所述重組載體為將所述RimL的編碼基因插入表達載體中，得到表達RimL的重組載體，所述表達載體是通過誘導型啟動子控制RimL的編碼基因表達的。5.根據權利要求4所述的重組載體，其特徵在於所述誘導型啟動子為乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、鹼性磷酸酯酶啟動子、色氨酸啟動子、噬菌體T7、h、PK啟動子或含有這些啟動子部分元件的雜合啟動子Tac、PJV所述表達載體優選為P0KBV。6.一種重組菌，為將外源誘導型啟動子插入宿主菌的乙醯基轉移酶編碼基因的上遊，用於啟動所述乙醯基轉移酶編碼基因的表達，得到的重組菌。7.根據權利要求6所述的重組菌，其特徵在於所述誘導型啟動子為乳糖啟動子、阿拉伯糖啟動子、鹼性磷酸酯酶啟動子、色氨酸啟動子、噬菌體17、&、&啟動子或含有這些啟動子部分元件的雜合啟動子Tac、PJV8.根據權利要求6或7所述的重組菌，其特徵在於所述宿主菌為大腸桿菌；所述誘導型啟動子為噬菌體T7啟動子，其核苷酸序列為序列表中序列5的自5』末端第1119-1135位核苷酸；所述乙醯基轉移酶為RimL，所述RimL為如下(a)、(b)或(c)所示的蛋白(a)由序列表中序列2所示的胺基酸序列組成的蛋白質；(b)將序列表中序列2所示的胺基酸序列經過一個或幾個胺基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的蛋白；(c)與a)或b)限定的胺基酸至少具有90%同源性且具有相同功能的蛋白。9.權利要求1-8中任一所述的重組菌在製備N-乙醯化胸腺素α中的應用。10.一種製備N-乙醯化胸腺素的方法，包括如下步驟發酵權利要求1-3中任一所述的重組菌，收集發酵產物，即得到N-乙醯化胸腺素α；所述發酵的溫度為42°C，所述發酵時間為12h。全文摘要本發明公開了一種過表達RimL的大腸桿菌及其在製備N-乙醯化胸腺素α中的應用。本發明提供了一種重組菌，為將RimL的編碼基因和胸腺素α的編碼基因導入宿主菌中得到的重組菌。本發明的實驗證明，本發明構建了N-乙醯基轉移酶RimL和胸腺素α的編碼基因進行共表達得到的重組菌，發酵該重組菌，得到胸腺素α均大多為N-乙醯化胸腺素α，具有明顯的應用前景。文檔編號C12R1/19GK102277327SQ20111022141公開日2011年12月14日申請日期2011年8月3日優先權日2011年8月3日發明者劉波,吳軍,唱韶紅,鞏新,馬清鈞申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院生物工程研究所