一種非注射用的基因治療藥物及其藥盒的製作方法

2024-01-21 17:49:15

專利名稱：一種非注射用的基因治療藥物及其藥盒的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因治療領域，具體地說，是涉及一種非注射用的基因治 療藥物給藥途徑及其藥盒，更具體地說，是涉及一種以重組腺相關病毒為 載體製備的水劑、油劑或水油混合劑給藥途徑及其藥盒。
背景技術：
基因療法是指將正常基因植入靶細胞代替病人細胞中的遺傳缺陷基 因，或關閉、抑制異常表達的基因，以達到預防和醫療疾病目的的一種臨
床醫療技術。在治療遺傳性疾病、惡性腫瘤、癌症、愛滋病病毒(HIV)、 關節炎、糖尿病、腺苷脫氫酶(ADA)缺陷症、神經系統紊亂、心臟病等疾 病方面，基因療法發揮著越來越重要的作用。
基因治療的最早提出是針對單基因缺陷的遺傳病，其原理是用一個正 常的基因來置換缺陷的基因或補救缺陷基因。1990年美國國家衛生院 (NIH)研究的Blas6RM禾卩Anderson WF用ADA (腺苷酸脫氨酶)基因 治癒了一位因ADA基因缺陷導致嚴重免疫缺失(SCID)的4歲女孩，使 世界各國掀起研究基因的熱潮。至今，基因治療的研究內容也從單基因的 遺傳病擴大到多基因的腫瘤、愛滋病、心血管病、神經系統疾病、自身免 疫性疾病、內分泌以及老年性疾病上。近來，基因載體的技術，外源基因 的表達調控等研究的突破性進展，使基因治療在人體內應用的安全性和靶 向性大大提高。從2005年7月以來，已有1076項基因試驗在全世界20 多個國家開展，治療病例6000多例。
基因治療是一把雙刃劍，基因治療中最重要的一個環節是選擇適當的 基因載體(Vector)。基因治療載體一般分為病毒性載體和非病毒性載體。目 前在基因治療研究或臨床試驗上，85%是使用病毒載體，2000年時，美國 賓州大學有病人在基因治療中死亡，2003年法國又發生先天免疫不全症，
3基因治療臨床試驗發生類白血病的副作用。這兩種失敗的案例，被歸於病 毒載體的安全性低，據了解，均是由於逆轉錄病毒作為基因載體所引起的。 因此，逆轉錄病毒載體逐漸被淘汰。而今用腺病毒和腺相關病毒，腺病毒 的缺點是表達外源基因時間短，免疫性強，可引發機體產生強烈的炎症反 應和免疫反應，毒性大，免疫反應重， 一次使用後產生抗原抗體反應，重 復使用無效。
目前，被看好的基因治療載體是腺相關病毒AAV，它具有病毒基因組 小，如2型腺相關病毒是4681核苷酸組成的單鏈DNA，可感染分裂靜止 期細胞，當輔助病毒不存在時，AAV能整合到宿主細胞基因組的特定區域， 無致病性，免疫原性弱，可以感染宿主組織細胞肝、肺、腎、腦、胃腸 道黏膜、視網膜、皮膚、肌肉等組織，在猴子的實驗中，六年持續表達目 的蛋白，它無毒高效，是目前理想的基因治療載體。構建重組AAV(rAAV) 涉及到用一個目的基因替換病毒基因組的大部分，然後將這個重組基因組 包裝到一個有感染性的病毒顆粒裡。
我國的預防科學院病毒研究所與本元正陽基因技術公司和國內多個單 位合作，用重組腺相關病毒(rAAV)載體開展腫瘤和遺傳病的基因治療項 目。復旦大學遺傳所和本元正陽基因技術公司合作重組AAV (攜帶凝血因 子)的血液病治療項目已進入臨床2期。第一軍醫大學南方醫院腫瘤中心 採用腺相關病毒為載體，將人乳頭狀病毒的E-6和E-7及GM-CSF病毒轉 染DC用於宮頸癌的治療。可以預見在近幾年，國外和國內將會有很多的 基因治療方案採用AAV做載體。由於基囟治療針對的臟器和疾病的不同， 特別是深部器官內的靶向性的問題至今無突破，使基因治療效果受到影響。 一味採用肌肉注射或靜脈注射可能影響治療效果，如胃腸道或直腸疾病(消 化器官癌症或其他疾病)，可能使用胃腸道給藥藥效會更好；如皮膚疾病或 其他疾病，可能經皮轉錄目的基因，比常規肌肉注射和靜脈注射會發揮更 好的治療作用；如生發類的基因治療藥物如果可以直接塗抹在頭皮表面， 局部用藥濃度更高；治療ED基因藥物採用尿道或皮膚給藥比陰頸注射方 便多，上述用藥有非常重要的臨床意義。將注射類藥物改為口服劑或塗 抹劑，將會使基因治療藥物更易進入臨床以及降低諸多生產成本和測試成本。
因此，本發明旨在提供一種非注射用的基因治療藥物。本發明還提供 包括上述藥物的藥盒。

發明內容
為實現本發明的目的，本發明的技術方案如下-
本發明提供一種非注射用的基因治療藥物，所述的藥物是目的基因-腺相關病毒重組體製備的水劑、油劑或水油混合劑。
根據本發明所述的基因治療藥物，其中較好地是，所述的藥物重組體 的目的基因包括各種對癌症、心腦血管、老年性疾病、內分泌疾病、自身 免疫性疫病、血液性疾病或遺傳性疾病有治療作用的基因。
根據本發明所述的基因治療藥物，其中較好地是，所述的腺相關病毒 包括所有血清型的腺相關病毒。
本發明還提供一種藥盒，所述的藥盒包括如上所述的基因治療藥物和 說明書。
根據本發明所述的藥盒，其中較好地是，所述的基因治療藥物重組體 的目的基因包括各種對癌症、心腦血管、老年性疾病、內分泌疾病、自身 免疫性疫病、血液性疾病或遺傳性疾病有治療作用的基因。
根據本發明所述的藥盒，其中較好地是，所述的藥物為水劑、油劑或 水油混合劑。口服首選水劑，藥物通過胃腸道、直腸黏膜轉染導入體內， 水劑更利於疾病的治療，也可使用油劑或水油混合劑；皮膚塗抹首選油劑， 在表皮、頭髮、陰莖龜頭、尿道口內黏膜、陰道內膜等皮膚塗抹，也可使 用水劑或水油混合劑。
根據本發明所述的藥盒，其中較好地是，所述的基因治療藥物還包含 調整胃腸道、直腸pH值的溶劑(選自細胞培養液、細胞保護液、酸性水 溶液或鹼性水溶液)。藥物口服後通過胃腸道、直腸黏膜轉染導入，為配合 腺相關病毒在最佳pH值8中得到最高轉染率，要隨時改變胃腸道、直腸 的pH值，本發明使用的溶劑是培養條件的pH值，不影響腺相關病毒導入 體內的生物活性功能。根據本發明所述的藥盒，其中較好地是，所述的說明書記載的內容如下
(1) 基因治療藥物採用口服或皮膚塗抹的方法給藥。
(2) 調整胃腸道、直腸pH值的細胞培養液、細胞保護液、酸性水溶 液或鹼性水溶液單獨在用藥前使用。
(3) 調整胃腸道、直腸pH值的細胞培養液、細胞保護液、酸性水溶 液或鹼性水溶液混合在含有目的基因的腺相關病毒載體中使用。
本發明與現有技術相比，具有如下有益效果
(1) 本發明藥物選用腺相關病毒為載體，安全無毒副作用；
(2) 本發明藥物成本與注射劑相比較低，根據不同病情選擇適用的劑 型，可達到更好的治療效果；
(3) 本發明的藥物給藥方便、可多次重複，病人易於接受，給病人帶 來方便的同時亦有相當大的實用價值。
具體實施例方式
下面參照實施例，更具體地說明本發明內容。應當理解，下面的實施 例用於說明本發明的內容，而非限定本發明的內容，任何形式上的變動和/ 或變通，將落入本發明的保護範圍。 實施例1
本發明基因治療藥物——水劑的生產工藝如下 一、細胞種子擴大
取50L發酵罐所要的HEK293細胞庫的種子細胞，接種HEK293至專 用發酵罐中，發酵罐培養基在接種前預熱至37。C，用二氧化碳來平衡培養 液的pH，發酵罐在發酵培養中能自動檢測各項參數指標(如氧分壓、二 氧化碳分壓、pH值、溫度、葡萄糖濃度、氨濃度、呼吸比等)，細胞在發 酵罐中培養至所需的培養密度約需3-4天的時間，每天檢測細胞生長的密 度，中間的培養液更換和補充以程控儀表顯示參數為依據，培養液為無血 清培養液。培養工藝中本發明改由轉瓶到發酵罐大容量懸浮培養和無血清 培養，用懸浮培養方法代替貼壁培養，使大規模培養更易操作，也降低了 培養液自身帶來的動物源性汙染，提高產品的安全性。二、 質粒轉染(符合GMP標準的三質粒共轉染技術) 重組Maxi-K基因的腺相關病毒(rAAV)載體包括ITRs攜帶目的基因
功能區；AAV的Rep啟動子和轉錄子系統Cap;腺相關病毒的輔助系統質 粒是腺病毒的表面蛋白的基因，整個轉染過程是包裝質粒與HEK293共轉 染。當HEK293細胞培養到適當的密度，約佔培養密度的80%左右，歷時 5天時間，將適量的rAAV質粒加入發酵罐中，進行轉染培養。質粒行將 轉染時，發酵罐暫時停止轉動，加入質粒後作輕微攪拌後，再停止一小時， 再輕微攪拌幾次，再停止一小時，在約5-6小時內，每小時作相同動作， 使rAAV與HEK293細胞能很好地受到轉染，直至大部分細胞受到轉染。 值得一提的是HEK293在發酵罐中培養的基本條件，儘量提供與體內生活 條件相接近的培養環境，培養環境應具備以下幾個因素所有與細胞接觸 的設備、器材、溶液等，其中包括種子庫細胞培養和放大培養及生產培養 過程，都必須保持絕對無菌，避免細胞外微生物的汙染，必須有充足的營 養供應，絕對不能含有有害的物質，甚至極微量有害離子；保證有適量的 氧氣供應；及時清除細胞代謝產生的有害物質；有良好的適宜細胞生存的 外界環境，包括滲透壓、離子濃度、胺基酸濃度、氧分壓、二氧化碳分壓、 葡萄糖濃度、pH值等，保持合適的細胞密度。
三、 營養更新(介質更新) 細胞在培養過程中由於細胞自我的代謝需要，將吸取營養物質，排出
代謝產物，在大容量的培養過程中，要及時補充各種營養物質和氧氣等， 也要及時清除代謝產物如二氧化碳、氨等，特別在質粒轉染前，要先更新 和補充培養液，使質粒轉染過程中，細胞能大多受到轉染，增加轉染率， 進一步提高產量。
四、 細胞收集
當HEK293與rAAV質粒轉染時，達到收集的時候時，將細胞全部收 集。可收集程度的指標，依照抽樣經顯微鏡下觀察已有大量細胞產生報告 基因Lacz比例，或肉眼觀察，見大量細胞呈簇狀，此時也可以收集細胞。 將收集的細胞和培養液進行過濾或離心，富集細胞。
五、 細胞破壁和純化富集的細胞經勻漿機(或超聲波)破壁，然後離心除去細胞碎片，作 過柱的預處理，在快速純化儀中快速過柱純化，最後將病毒液轉移至透析
袋，在40C下透析，後經安全性和生物活性檢測，即得到所需的GMP條
件下重組腺相關病毒載體的產品。
六、包裝和儲存
收集到重組基因治療藥物產品後，在4QC包裝，加入保護液5%山梨 醇或5%甘露醇，包裝為所需的水劑，在4。C或-2GC低溫保存。
實施例2
除步驟六加入甘油包裝為油劑外。 其他操作同實施例1。
實施例3
自願受試者三人，男性，年齡分別為47、 55、 65歲，有ED症狀，使 用本發明製備的水劑，從陰莖尿道口滴入1毫升水劑，每天一次，連續使 用二周。五個月後陰莖勃起功能明顯改變，性交時間延長。受試者非常滿 思。
權利要求
1、一種非注射用的基因治療藥物，其特徵在於，所述的藥物是目的基因--腺相關病毒重組體製備的水劑、油劑或水油混合劑。
2、 如權利要求1所述的基因治療藥物，其特徵在於，所述基因治療 藥物的目的基因是與癌症、心腦血管疾病、老年性疾病、內分泌疾病、 自身免疫性疫病、血液性疾病或遺傳性疾病相關的基因。
3、 如權利要求1所述的基因治療藥物，其特徵在於，所述的腺相關 病毒包括所有血清型的腺相關病毒。
4、 一種非注射用的基因治療藥物藥盒，其特徵在於，所述的藥盒包 括如權利要求1所述的基因治療藥物和說明書。
5、 如權利要求4所述的藥盒，其特徵在於，所述的基因治療藥物的 目的基因是與癌症、心腦血管疾病、老年性疾病、內分泌疾病、自身免 疫性疫病、血液性疾病或遺傳性疾病相關的基因。
6、 如權利要求4所述的藥盒，其特徵在於，所述的藥物為水劑、油 劑或水油混合劑。
7、 如權利要求6所述的藥盒，其特徵在於，所述的基因治療藥物還 包含調整胃腸道、直腸pH值的細胞培養液、細胞保護液、酸性水溶液 或鹼性水溶液。
8、 如權利要求4所述的藥盒，其特徵在於，所述的說明書記載內容 如下(1) 基因治療藥物採用口服、呼吸道、尿道或皮膚塗抹的方法給藥；(2) 調整胃腸道、直腸pH值的細胞培養液、細胞保護液、酸性水 溶液或鹼性水溶液單獨在用藥前使用；(3) 調整胃腸道、直腸pH值的細胞培養液、細胞保護液、酸性水 溶液或鹼性水溶液混合在含有目的基因的腺相關病毒載體中使用。
全文摘要
本發明公開一種非注射用基因治療藥物，該藥物是以重組腺相關病毒(rAAV)為載體製備的水劑、油劑或水油混合劑；該藥物重組體的目的基因包括各種對疾病有治療作用的基因。本發明還公開了包含上述藥物的藥盒，藥盒還包括說明書，說明書記載該藥物通過口服、呼吸道、尿道、肛腸注入或皮膚塗抹使用。目前，rAAV載體基因治療藥物的給藥途徑都採取注射方法，本發明與現有技術相比，給藥更加簡單方便，並可多次重複，病人更容易接受，在給病人帶來很大方便的同時，亦具有相當大的實用價值。
文檔編號A61K48/00GK101444629SQ200810177470
公開日2009年6月3日 申請日期2008年11月25日 優先權日2007年11月30日
發明者張雲福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(上海)有限公司