同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)及同型半胱氨酸濃度測定方法
2024-02-03 10:24:15
專利名稱：同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)及同型半胱氨酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定同型
半胱氨酸濃度的方法，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
測定血漿中同型半胱氨酸的方法有很多種，包括高效液相色譜法(HPLC)、胺基酸 分析儀測定法、離子色譜法、酶聯免疫分析法(EIA)、毛細管氣相色譜_質譜，螢光偏振免疫 分析(FPIA)、電化學法及酶法等等。 1.高效液相色譜法(HPLC):是經典的參考方法，但其有操作比較複雜，試驗耗時 比較長，試驗數據變異比較大的缺點，在臨床應用方面逐漸被酶聯免疫分析法、螢光偏振分 析法和酶法所取代。高效液相色譜法是先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸 轉變成還原形式，然後與螢光劑進行衍生生成同型半胱氨酸_螢光物質複合物，將衍生後 的樣品進行色譜分析。因色譜固定相對不同物質的吸附力不同，因此流動相將其洗脫下來 的次序也不同，根據這一原理將樣品中的不同物質分開，以螢光檢測器檢測洗脫下同型半 胱氨酸-螢光物質複合物的螢光強度，將其與標準品/內標的比值進行比較和計算，就可以 測定血總同型半胱氨酸的水平。 2.酶聯免疫分析法(EIA):是臨床上測定同型半胱氨酸水平的常用方法，其特點 是操作比較方便、快捷，重複性好，方法穩定可靠。缺點是大部分操作還是手工操作，比較耗 時等。酶聯免疫分析法其基本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變 成S-腺苷-L-同型半胱氨酸，然後加入酶標的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單克隆或多 克隆抗體，採用競爭結合的原理，將不同水平的標準品與酶標抗體競爭結合，然後以顯色試 劑和終止試劑分別進行顯色和終止，製作出同型半胱氨酸濃度與發色強度的標準曲線。樣 品也按相同步驟處理，在標準曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。 3.離子色譜法主要用於實驗研究，臨床上較少使用。其基本分析原理是色譜分 析的一種，主要是其固定相採用離子交換物質，根據其對不同離子的吸附力不同可將同型 半胱氨酸與其它物質分開進行測定。 4.毛細電泳法主要用於實驗研究，有在臨床使用的報導。其特點與高效液相色 譜方法相似，如其有操作比較複雜、試驗耗時較長和試驗數據變異比較大的缺點。基本分析 原理先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成還原形式，然後與螢光試劑 進行衍生生成同型半胱氨酸_螢光物質複合物，將衍生後的樣品進行毛細電泳分析。將樣 品放置於10千伏左右的高壓電場中，因為各種物質所帶電荷不同，其等電點也不相同，因 此其在電場中的遷移速度也就不同，根據這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質 分開，再以螢光檢測器檢測同型半胱氨酸_螢光物質複合物的螢光強度，將其與標準品/內 標的比值進行比較和計算，就可以測定總同型半胱氨酸的水平。
5.螢光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法，該方法完全自
4動化儀器分析，具有快速、準確、方便的優點。其基本分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和 抗單克隆抗體相結合的同型半胱氨酸的螢光偏振強度不同，將樣品、標準品與標抗體競爭 結合，採用競爭結合的原理製作出同型半胱氨酸濃度與螢光偏振強度的標準曲線，在標準 曲線上就可以查出其同型半胱氨酸的濃度。 6.酶法是因應市場需求而新開發出來的測試方法，目前國內有多項專利申請 CN98807531. 8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半胱氨酸含量；CN200410016789. 6 利用同型半胱氨酸轉甲基酶(E. C. 2. 1. 1. 10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E. C. 3. 3. 1. 1)的循
環擴增作用，再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶等，或腺苷 脫氨酶、羥丁酸脫氫酶等顯色反應測定同型半胱氨酸含量；CN200510053210. 8利用L-蛋氨 酸y-裂解酶作用於同型半胱氨酸使之產生硫化氫後再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產生
螢光，該方法使用全自動螢光分析儀測試，具有快速、準確、方便的優點。其基本分析原理 用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產物再與螢光顯色劑發生化學反應形
成可測量之螢光化合物。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法(EnzymaticColorimetric
Method)及酶(偶)聯法(Couple Reaction)技術，監測還原型煙醯胺輔酶(還原型輔酶)
在340nm波長處吸光度的變化，得以測定同型半胱氨酸濃度的方法，同時，本發明還將給出
用以實現該方法的同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，採用該試劑不僅可以在紫外/可見
光分析儀或半、全自動生化分析儀上進行同型半胱氨酸濃度測定，而且測定速度快、準確度
高，因而可以得到切實的推廣應用。 本發明同型半胱氨酸濃度測定方法如下 同型半胱氨酸+三甲基銨基醋酸鹽甜萊鹼_同型半胱氨酸甲基轉移酶
二甲基甘氨酸+蛋氨酸
蛋氨酸+水蛋氨酸y-裂解酶甲硫醇+氨+2-氧代丁酸
氨,+2-酮戊二酸+還原型輔酶穀氨酸脫氫酶穀氨酸+輔酶+水
這種方法應用甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶(betaine-homocysteine S-methyltransf erase ;EC 2. 1. 1. 5)酶(偶)聯蛋氨酸y-裂解酶(methionine y-lyase ; EC 4. 4. 1. 11)、穀氨酸脫氫酶(Glutamate Dehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 2 ;EC 1. 4. 1. 3 ;EC 1. 4. 1. 4)酶促反應比色終點法。甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶酶解同型半胱氨酸反應 產生蛋氨酸，再通過(偶)聯合蛋氨酸y-裂解酶、穀氨酸脫氫酶的作用，最終將還原型輔 酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型 輔酶在340nm處吸光度下降的程度，通過測量340nm處吸光度下降的程度，可以測算同型半 胱氨酸的濃度大小。 實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考慮，無論是單 劑、雙劑還是三劑，如下成分關係的本發明同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)較為理想
緩衝液 100mmol/L
穩定劑 500mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L
甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶 蛋氨酸Y-裂解酶 穀氨酸脫氫酶 三甲基銨基醋酸鹽 2_酮戊二酸
10000U/L 9000U/L 10000U/L 5mmol/L 12mmol/L 本發明的同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、甜菜鹼_同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解
酶、穀氨酸脫氫酶、三甲基銨基醋酸鹽、2_酮戊二酸。 試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、三甲基銨基醋酸鹽、2_酮戊二酸。
試劑2 緩衝液、穩定劑、甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫 氫酶。 還原型輔酶、甜菜鹼_同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫氫 酶、三甲基銨基醋酸鹽、2-酮戊二酸在試劑l或試劑2中的位置可以不限。試劑(盒)可以 是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑1 緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、三甲基銨基醋酸鹽、2_酮戊二酸。
試劑2 緩衝液、穩定劑、蛋氨酸Y _裂解酶、穀氨酸脫氫酶。
試劑3 緩衝液、穩定劑、甜菜鹼_同型半胱氨酸甲基轉移酶。 還原型輔酶、甜菜鹼_同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫氫 酶、三甲基銨基醋酸鹽、2_酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。試劑 (盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
無論是單劑、雙劑還是三劑，本發明測定同型半胱氨酸濃度的方法，其還原型輔酶 可以是NADPH、 NADH或thio-NADH中的一種。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一 本實施例的同型半胱氨酸診斷/測定試劑為單試劑，包括 三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 500mmol/L 還原型輔酶 0. 25mmol/L
甜菜鹼_同型半胱氨酸甲基轉移酶 蛋氨酸Y-
三甲基銨基醋酸鹽 2-酮戊二酸
10000U/L 9000U/L 10000U/L 5mmol/L 12mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑；使用前，加入純淨 水，復溶後使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的體積比例為1/25， 反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。
實施例二
本實施例的同型半胱氨酸診斷/測定試劑為雙試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 穩定劑 還原型輔酶 三甲基銨基醋酸鹽 2-酮戊二酸 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 穩定劑
甜菜鹼_同型半胱氨酸甲基轉移酶 蛋氨酸Y-
100,1/L 50mmol/L 0. 25,1/L 5mmol/L 12mmol/L
100,1/L 500,1/L 10000U/L 9000U/L 10000U/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間IO分鐘，起始吸光度I. 8±0. 7， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑1、試劑2的體積比例 為2/20/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。
實施例三 本實施例的同型半胱氨酸診斷/測定試劑為三試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 lOOmmol/L
穩定劑 50mmol/L
還原型輔酶 0. 25mmol/L
7
三甲基銨基醋酸鹽 5mmol/L
2-酮戊二酸 12mmol/L
試劑2三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑 500mmol/L
蛋氨酸Y -裂解酶 9000U/L
穀氨酸脫氫酶 10000U/L
試劑3三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩衝液 lOOmmol/L 穩定劑 500mmol/L 甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶 10000U/L 試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 測定同型半胱氨酸濃度時，在全自動生化分析儀上設定溫度37t:，反應時間10
分鐘，起始吸光度1. 8±0. 7，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測同型半胱氨酸樣品
與試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應方向為負反應(下降反應)，延遲時
間大約0分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。 加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。
申請人:經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他測定方法均能達到本發明 的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明採用本發明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時間反應曲線應呈下 降曲線直至終點；試劑可測有效(R > 0. 99)線形範圍可達600 y mol/L ;試劑測試的不準確 度，其相對偏差不超過±4%;試劑測試的精密度(重複性)的變異係數(CV)《2%;試劑的 靈敏度可達O. 0004±0. 0002AA/iimol/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩定一年；—— 本發明靈敏度高、精確度好，線形範圍寬廣，穩定期長，足以便於推廣應用。
權利要求
一種利用酶比色法及酶聯法技術的同型半胱氨酸濃度測定方法，其方法如下同型半胱氨酸+三甲基銨基醋酸鹽 甜萊鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶二甲基甘氨酸+蛋氨酸蛋氨酸+水 蛋氨酸γ-裂解酶 甲硫醇+氨+2-氧代丁酸氨+2-酮戊二酸+還原型輔酶 穀氨酸脫氫酶 穀氨酸+輔酶+水將最終反應物置於紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度下降的程度，測算出同型半胱氨酸的濃度大小測定結果。
2. —種同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，主要成分包括緩衝液 穩定劑 還原型輔酶甜菜鹼_同型半胱氨酸甲基轉移酶 蛋氨酸Y-裂解酶-500,1/L三甲基銨基醋酸鹽 2_酮戊二酸20——1-4000mmol/L0. 1-0. 35,1/L1000-80000U/L1000-80000U/L1000-80000U/L1-50mmol/L1--50mmol/L試劑成分的濃度不一定只限於上述範圍；在此範圍內效果較好，在此範圍外，試劑仍會 反應作用。其特徵在於試劑(盒)可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液 體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫氫酶、三甲基銨基醋酸鹽、2_酮戊二酸組成單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫氫酶、三甲基銨基醋酸鹽、2-酮戊二酸組成雙劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩 定劑、還原型輔酶、三甲基銨基醋酸鹽、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、甜菜 鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫氫酶組成。還原型輔酶、甜菜 鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫氫酶、三甲基銨基醋酸鹽、2-酮 戊二酸在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、還原型輔酶、甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫氫酶、三甲基銨基醋酸鹽、2-酮戊二酸組成多劑試劑；試劑1，由緩衝液、穩定 劑、還原型輔酶、三甲基銨基醋酸鹽、2-酮戊二酸組成；試劑2，由緩衝液、穩定劑、蛋氨酸 Y-裂解酶、穀氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移 酶組成。還原型輔酶、甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸Y-裂解酶、穀氨酸脫氫 酶、三甲基銨基醋酸鹽、2-酮戊二酸在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，其特徵在於還包括穩 定劑1——4000mmol/L或0. 1% _100%體積比。所述穩定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發明涉及一種利用酶比色法及酶聯法技術的同型半胱氨酸診斷/測定試劑(盒)，同時本發明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法、試劑的組成及成分，屬於醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑(盒)主要成分包括緩衝液、還原型輔酶、三甲基銨基醋酸鹽、2-酮戊二酸、甜菜鹼-同型半胱氨酸甲基轉移酶、蛋氨酸γ-裂解酶、穀氨酸脫氫酶及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生一系列的酶促反應，再將反應物置於紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度下降的程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度大小。
文檔編號G01N33/48GK101750388SQ20081024428
公開日2010年6月23日 申請日期2008年12月10日 優先權日2008年12月10日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司