同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度測定方法
2024-02-03 11:44:15
專利名稱：同型半胱氨酸診斷試劑盒及同型半胱氨酸濃度測定方法
技術領域：
本發明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時本發明還涉及測 定同型半胱氨酸濃度的方法，屬於醫學檢驗測定技術領域。
背景技術：
測定血漿中同型半胱氨酸的方法有很多種，包括高效液相色
譜法(HPLC)、胺基酸分析儀測定法、離子色譜法、酶聯免疫分析法 (EIA)、毛細管氣相色譜-質譜，螢光偏振免疫分析(FPIA)、電化學 法及酶法等等。
1.高效液相色譜法(HPLC):是經典的參考方法，但其有操作比較 複雜，試驗耗時比較長，試驗數據變異比較大的缺點，在臨床應用方 面逐漸被酶聯免疫分析法、螢光偏振分析法和酶法所取代。高效液相 色譜法是先使用還原劑使血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成還 原形式，然後與螢光劑進行衍生生成同型半胱氨酸-螢光物質複合物， 將衍生後的樣品進行色譜分析。因色譜固定相對不同物質的吸附力不 同，因此流動相將其洗脫下來的次序也不同，根據這一原理將樣品中 的不同物質分開，以螢光檢測器檢測洗脫下同型半胱氨酸-螢光物質復 合物的螢光強度，將其與標準品/內標的比值進行比較和計算，就可以 測定血總同型半胱氨酸的水平。 2. 酶聯免疫分析法(EIA):是臨床上測定同型半胱氨酸水平的
常用方法，其特點是操作比較方便、快捷，重複性好，方法穩定可靠。 缺點是大部分操作還是手工操作，比較耗時等。酶聯免疫分析法其基
本分析原理先使用酶將血樣中所有形式的同型半胱氨酸轉變成S-腺
苷-L-同型半胱氨酸，然後加入酶標的抗S-腺苷-L-同型半胱氨酸的單
克隆或多克隆抗體，採用競爭結合的原理，將不同水平的標準品與酶 標抗體競爭結合，然後以顯色試劑和終止試劑分別進行顯色和終止， 製作出同型半胱氨酸濃度與發色強度的標準曲線。樣品也按相同步驟 處理，在標準曲線上就可以査出其同型半胱氨酸的濃度。
3. 離子色譜法主要用於實驗研究，臨床上較少使用。其基本分
析原理是色譜分析的一種，主要是其固定相採用離子交換物質，根據 其對不同離子的吸附力不同可將同型半胱氨酸與其它物質分開進行測 定。
4. 毛細電泳法主要用於實驗研究，有在臨床使用的報導。其特 點與高效液相色譜方法相似，如其有操作比較複雜、試驗耗時較長和 試驗數據變異比較大的缺點。基本分析原理先使用還原劑使血樣中 所有形式的同型半胱氨酸轉變成還原形式，然後與螢光試劑進行衍生 生成同型半胱氨酸-螢光物質複合物，將衍生後的樣品進行毛細電泳分
析。將樣品放置於io千伏左右的高壓電場中，因為各種物質所帶電荷
不同，其等電點也不相同，因此其在電場中的遷移速度也就不同，根 據這一原理可將同型半胱氨酸與樣品中的其它物質分開，再以螢光檢
測器檢測同型半胱氨酸-螢光物質複合物的螢光強度，將其與標準品/ 內標的比值進行比較和計算，就可以測定總同型半胱氨酸的水平。
5. 螢光偏振法是臨床上測定同型半胱氨酸水平的比較好的方法， 該方法完全自動化儀器分析，具有快速、準確、方便的優點。其基本 分析原理樣品中游離同型半胱氨酸和抗單克隆抗體相結合的同型半 胱氨酸的螢光偏振強度不同，將樣品、標準品與標抗體競爭結合，採 用競爭結合的原理製作出同型半胱氨酸濃度與螢光偏振強度的標準曲 線，在標準曲線上就可以査出其同型半胱氨酸的濃度。
6. 酶法是因應市場需求而新開發出來的測試方法，目前國內有多 項專利申請CN98807531.8利用同型半胱氨酸酶來測量樣品中同型半 胱氨酸含量；CN200410016789.6利用同型半胱氨酸轉甲基酶
(E.C2丄1.10)及腺苷同型半胱氨酸酶(E.C.3.3丄1)的循環擴增作用， 再加上腺苷脫氨酶、嘌呤核苷磷酸化酶、黃嘌呤氧化酶、過氧化物酶 等，或腺苷脫氨酶、穀氨酸脫氫酶等顯色反應測定同型半胱氨酸含量; CN200510053210.8利用L-蛋氨酸Y-裂解酶作用於同型半胱氨酸使之 產生硫化氫後再與瑩光化合物DMPD2HC1作用產生螢光，該方法使用 全自動螢光分析儀測試，具有快速、準確、方便的優點。其基本分析 原理用基因重組酶將同型半胱氨酸分解，所形成之硫化氫產物再與 螢光顯色劑發生化學反應形成可測量之螢光化合物。
發明內容
本發明要解決的技術問題是提出一種利用酶比色法
(Enzymatic Colorimetric Method)、酶聯法(Couple Reaction)偶聯化 學反應技術技術，計量通過酶聯及化學反應生成亞甲基蘭(Methylene blue)所導致在660nm波長處吸光度的上升，得以測定同型半胱氨酸 濃度的方法，同時，本發明還將給出用以實現該方法的同型半胱氨酸 診斷試劑盒，採用該試劑盒不僅可以在可見光分析儀或半、全自動生 化分析儀上進行同型半胱氨酸濃度測定，而且測定速度快、靈敏度大、 準確度高，因而可以得到切實的推廣應用。
本發明同型半胱氨酸濃度測定方法原理如下
同型半胱氨酸+腺苷基蛋氨酸同型半胱氨酸甲基轉移酶
腺苷基同型半胱氨酸+蛋氨酸 腺苷基同型半胱氨酸+氧+水胺基酸氧化酶腺苷基硫代丁酮酸
+氨+過氧化氫 蛋氨酸+氧+水胺基酸氧化酶含氧酸+氨+過氧化氫 2過氧化氫+2 10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
—"^ 2亞甲基蘭
'這種方法應用同型半胱氨酸甲基轉移酶(偶)聯合胺基酸氧化酶及化 學反應終點比色法。同型半胱氨酸甲基轉移酶酶解同型半胱氨酸反應 產生腺苷基同型半胱氨酸及蛋氨酸二個胺基酸，二個胺基酸再通過 (偶)聯合胺基酸氧化酶及10-(羧甲基-氮乙醯基).-3,7-雙(二甲胺 基)吩噻嗪的作用，最終生成亞甲基蘭，從而可以通過可見光分析儀 器，在660nm波長處，測定生成亞甲基蘭含量高低的光吸收大小，通 過測量660nrn處吸光度上升的程度，得出同型半胱氨酸濃度大小測定 結果。
實驗表明，從測定結果的準確性和配製成本的經濟性兩方面綜合考
慮，如下成分關係的本發明同型半胱氨酸診斷試劑盒較為理想 緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
同型半胱氨酸甲基轉移！
胺基酸氧化酶
S-腺苷基蛋氨酸
8000 U/L
12000 U/L
20 mmol/L
10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
6 mmol/L
本發明的同型半胱氨酸含量診斷試劑盒可以是單劑，包括 緩衝液、穩定劑、S-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉移酶、氨基 酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪。 試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液 體試劑，直接使用。
'也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑，更有利於消除內外源氨 基酸汙染
試劑l
緩衝液、穩定劑、胺基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪。 試劑2
緩衝液、穩定劑、同型半胱氨酸甲基轉移酶、S-腺苷基蛋氨酸。
s-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉移酶、胺基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1或試劑2中 的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用； 也可以配製成液體試劑，直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑，不但有利於消除內外 源胺基酸汙染，還有利於試劑的穩定
試劑1
緩衝液、穩定劑、10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪。 試劑2
緩衝液、穩定劑、胺基酸氧化酶。 試劑3
緩衝液、穩定劑、同型半胱氨酸甲基轉移酶、S-腺苷基蛋氨酸。 S-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉移酶、胺基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1、試劑2或 試劑3中的位置可以不限。試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶 解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
具體實施例方式
下面結合實施例子對本發明作進一步的說明。 實施例一
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液100mmol/L
穩定劑 50 mmol/L
同型半胱氨酸甲基轉移酶 6000 U/L
胺基酸氧化酶 10000 U/L
S-腺苷基蛋氨酸 20 mmol/L
10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
2 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，進行冷凍乾燥，製成乾粉試劑; 使用前，加入純淨水，復溶後使用。
在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間IO分鐘，測
試主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑 的體積比例為1/25，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點 法，延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於 生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同 型半胱氨酸的濃度大小。 實'施例二
本實施例的同型半胱氨酸診斷試劑為雙試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
胺基酸氧化酶 15000 U/L
10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
3 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲垸一鹽酸緩衝液100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
同型半胱氨酸甲基轉移酶 10000 U/L
S-腺苷基蛋氨酸 20 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37。C，反應時間10分鐘，測試 主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的 體積比例為1/20，反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點法， 延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於生化 分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同型半 胱氨酸的濃度大小。
實施例三同型半胱氨酸診斷試劑為三試劑，包括 ' 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50 mmol/L
10-(羧甲基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪
2 mmol/L
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L
穩定劑 50 mmol/L
胺基酸氧化酶 14000 U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷一鹽酸緩衝液 100mmol/L 穩定劑 50鵬ol/L
同型半胱氨酸甲基轉移酶 8000 U/L
S-腺苷基蛋氨酸 20 mmol/L
試劑全部溶解配好後，分裝入瓶，製成液體三試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設定溫度37X:，反應時間10分鐘，測試 主波長660nm，測試副波長800nm，被測同型半胱氨酸樣品與試劑的 體積比例為1/30,反應方向為正反應(上升反應)，檢測方法為終點法， 延遲時間大約O分鐘左右，檢測時間5分鐘左右。
加入樣品和試劑後，使之混合併發生反應，最終將反應物置於 生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的程度，從而測算出同 型半胱氨酸的濃度大小。
'申請人經過實驗驗證，採用以上發明內容中記載的其他各種還原 型色原體組合均能達到本發明的目的，鑑於測定步驟等情況與以上實 施例類同，不另一一例舉。
總之，實驗證明，採用本發明的測定方法完全可以通過可見光分 析儀器得出所需的測定結果，並且靈敏度高、精確度好，不受內外源 物質量汙染。
權利要求
1.一種同型半胱氨酸濃度測定方法，其方法原理如下同型半胱氨酸+腺苷基蛋氨酸 同型半胱氨酸甲基轉移酶腺苷基同型半胱氨酸+蛋氨酸腺苷基同型半胱氨酸+氧+水 胺基酸氧化酶 腺苷基硫代丁酸+氨+過氧化氫蛋氨酸+氧+水 胺基酸氧化酶 含氧酸+氨+過氧化氫2過氧化氫+2 10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪-→2亞甲基蘭腺苷基硫代丁酸(S-adenosyl-γ-thio-ketobutyrate)含氧酸(oxo-acid)將最終反應物亞甲基蘭(Methylene blue)置於可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長660nm吸光度上升的大小程度，測算出同型半胱氨酸濃度大小測定結果。
2. —種同型半胱氨酸診斷試劑盒，主要成分包括緩衝液 穩定劑同型半胱氨酸甲基轉移酶 胺基酸氧化酶 S-腺苷基蛋氨酸20-500畫ol/L1- 50mmol/L200——500000 U/L200-500000 U/L0.1-20mmol/L10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪0.1-20mmol/L 其特徵在於試劑盒可以是乾粉狀態，在使用前加水溶解後使用；也可以配製成液體試劑，直接使用。
3. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、S-腺苷基蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine)、 同型半胱氨酸甲基轉移酶(homocysteine S"-methyltransferase EC 2.1.1.10)、胺基酸氧化酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙醯基)腸3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成 單劑試劑。
4. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特徵在於 由緩衝液、穩定劑、S-腺苷基蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine)、 同型半胱氨酸甲基轉移酶(homocysteine S-methyltransferase EC 2.1.1.10)、胺基酸氧化酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成 雙劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、胺基酸氧化酶、10-(羧甲 基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成；試劑2,由緩衝液、'穩定劑、同型半胱氨酸甲基轉移酶、S-腺苷基蛋氨酸組成。S-腺苷 基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉移酶、胺基酸氧化酶、10-(羧甲基 -氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪在試劑1或試劑2中的位置 可以不限。
5. 根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特徵在於由緩衝液、穩定劑、S-腺苷基蛋氨酸(S-adenosyl-L-methionine)、 同型半胱氨酸甲基轉移酶(homocysteine S-methyltransferase EC 2.1.1.10)、胺基酸氧化酶(Amino Acid Oxidase EC 1.4.3.2、 EC 1.4.3.3)、 10-(羧甲基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基)吩噻嗪組成多劑試劑；試劑l，由緩衝液、穩定劑、胺基酸氧化酶組成；試劑 2,由緩衝液、穩定劑、10-(羧甲基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪組成；試劑3，由緩衝液、穩定劑、同型半胱氨酸甲基轉移 酶、S-腺苷基蛋氨酸組成。S-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉 移酶、胺基酸氧化酶及10-(羧甲基-氮乙醯基)-3,7-雙(二甲胺基) 吩噻嗪在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6.根據權利要求2所述同型半胱氨酸診斷試劑盒，其特徵在 於還包括穩定劑1一000 mmol/L或0.in/。-100。/。體積比。所述穩 定劑為硫酸銨(Ammonia Sulfate)、甘油(Glycerol)、丙二醇 (Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少 一種。
全文摘要
本發明涉及一種同型半胱氨酸診斷試劑盒，同時本發明還涉及測定同型半胱氨酸濃度的方法原理、試劑的組成及成分，屬於醫學檢驗測定技術領域。本發明的試劑盒主要成分包括緩衝液、S-腺苷基蛋氨酸、同型半胱氨酸甲基轉移酶、胺基酸氧化酶、10-(羧甲基-氮乙醯基)-3，7-雙(二甲胺基)吩噻嗪(DA-67)及穩定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發生酶促反應，再將反應物置於可見光分析儀下，檢測主波長660nm處吸光度上升的大小程度，從而測算出同型半胱氨酸的濃度。
文檔編號C12Q1/00GK101097191SQ200610085578
公開日2008年1月2日 申請日期2006年6月26日 優先權日2006年6月26日
發明者王爾中 申請人:蘇州艾傑生物科技有限公司