一種建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法

2024-02-23 10:54:15

一種建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法
【專利摘要】本發明公開了一種建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法，包括：步驟1，建立衝擊傷小鼠動物模型固定裝置，該裝置包括底座、支撐架、及多個帶有皮套的金屬夾構成，且底座、支撐架及帶有皮套的金屬夾連為一體；步驟2，利用固定裝置的金屬夾將小鼠固定，並將固定後的小鼠分成不同的組，使用5g炸藥用作爆炸源，使不同組的小鼠分別距離爆炸源43cm、53cm和63cm,確定重度衝擊傷小鼠距離為43cm，中度衝擊傷小鼠距離為53cm，輕度衝擊傷小鼠距離為63cm；步驟3，在爆炸源爆炸後立即將中度衝擊傷小鼠背部脫毛區域置入90℃水中持續9s，致25%總體表面積Ⅲ°燒傷，構建燒衝複合傷小鼠。本發明重複性好，燒衝複合傷臨床症狀明顯，操作方法簡單、安全、有效，造模成功率100%。
【專利說明】一種建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種疾病動物模型的製作方法，更具體地是一種燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的製造方法。
【背景技術】
[0002]動物疾病模型主要用於實驗生物學、實驗病理學和實驗治療學的研究。人類疾病的發展過程十分複雜，若以人本身作為研究對象來深入探討疾病的發生機制在時間、空間上都存在局限性，同時也受到倫理學的限制；然而，藉助動物模型進行間接研究，避免了人體試驗造成的風險和倫理問題，有針對性地改變那些在自然條件下不可能或不易排出的因素，同時有利於了解疾病的發病機制和研究防治措施。
[0003]燒衝複合傷是軍事衝突、恐怖襲擊、交通事故等突發事件中最常見的創傷類型之一。燒衝複合傷後肺臟損傷導致即時死亡的發生率高達47%。急性肺損傷(ALI)和急性呼吸窘迫綜合症(ARDS)是燒衝複合傷早期死亡的主要原因之一，燒衝複合傷後即刻引起低血容量性休克與炎症級聯反應。傷後3~24小時出現肺組織水腫，同時細胞免疫與體液免疫功能紊亂，肺組織氣體交換功能受損，肺組織與胸廓順應性降低，導致ALI/ARDS。然而，目前大多數關於燒衝複合傷的信息，都是將其作為爆炸傷與傷害事件進行報導，因此利用動物實驗來進行燒衝複合傷的機制研究十分重要，迫切需要製作一種燒衝複合傷動物模型，據此，可對燒衝複合傷的機制從生物化學、分子生物學、組織學、病理學、影像學等方面進行研究。 [0004]目前，現有技術中已經報導了多種製作燒衝複合傷動物模型的方法，例如採用凝固汽油致大鼠背部25%體表面積ΙΙ 燒傷後，用BST-1型生物激波管致成中度衝擊傷。又如以5kW溴鎢燈致15%體表面積ΙΙ 光輻射燒傷後，用BST-1型生物激波管致成中度衝擊傷。總之，這些燒衝複合傷動物模型均未從整體受到衝擊傷後，對某一器官或組織的作用進行研究，而是孤立的進行單一器官損傷的研究。因此，到目前為止，仍缺乏理想的、接近於臨床病理狀態的燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型。

【發明內容】

[0005]針對上述現有技術的不足，本發明提供了一種製作燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法，客服了由於現有技術的局限性和缺點導致的問題，可以用於燒衝複合傷小鼠肺損傷發病機制與治療等領域。
[0006]本發明提出了一種建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法，該方法包括步驟:步驟1，建立衝擊傷小鼠動物模型固定裝置，該裝置包括底座、支撐架、及多個帶有皮套的金屬夾構成，且底座、支撐架及帶有皮套的金屬夾連為一體；步驟2，利用固定裝置的金屬夾將小鼠固定，並將固定後的小鼠分成不同的組，使用5g8701炸藥用作爆炸源，使不同組的小鼠分別距離爆炸源43cm、53cm和63cm，確定重度衝擊傷小鼠距離為43cm，中度衝擊傷小鼠距離為53cm，輕度衝擊傷小鼠距離為63cm ;步驟3，在爆炸源爆炸後立即將中度衝擊傷小鼠背部脫毛區域置入90°C水中持續9s，致25%總體表面積IIF燒傷，構建燒衝複合傷小鼠。
[0007]優選地，該方法進一步包括:步驟4，將傷後24小時的燒衝複合傷組與正常對照組的小鼠處死。
[0008]優選地，小鼠為雄性C57BL/6小鼠。
[0009]優選地，動物模型製備前12小時禁食，自由飲水，於小鼠腹腔內注射氯胺酮麻醉，背部備皮。
[0010]優選地，所述固定裝置的底座包括底部以及與底部相連的側部形成，其中底部是直接與地面接觸的矩形框架，側部是以底部矩形的兩條寬為底的三角形框架，該三角形框架構成的平面與底部平面是垂直關係，其中三角形框架為等腰三角形。
[0011]優選地，所述固定裝置的支撐架由五根管構成，其中包括豎直方向固定的兩根管，作為豎直支撐架，以及在兩根豎直管之間橫向固定的上下平行的三根管，作為橫向支撐架。
[0012]優選地，所述固定裝置的豎直支撐架通過底座的側部三角形框架固定，豎直支撐架的一端固定在三角形框架的底邊中心，方向垂直於底座的底部，底座的側部三角形框架的頂點與豎直支撐架固定在一起。
[0013]優選地，所述固定裝置的支撐架還進一步包括平行設置在豎直支撐架之間的橫向支撐架，橫向支撐架是三根。
[0014]優選地，在靠近底部的兩根橫向支撐架上分別固`定兩個帶有皮套的金屬夾，用戶固定衝擊傷小鼠動物模型。
[0015]優選地，橫向支撐架能夠通過定位螺釘上下移動。
[0016]本發明公開的燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的製作方法，其操作簡便，獲得的各項檢測指標與燒衝複合傷患者的臨床表現類似。因此，為深入研究燒衝複合傷後肺損傷提供了一種具有科學性與重複性好的動物模型。該模型具有重要的實用價值和理論價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1是根據操作本發明建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法的現場示意圖；
[0018]圖2是53cm中度衝擊傷壓力值示意圖；
[0019]圖3是不同實驗組小鼠肺組織HE染色圖，其中圖a表示正常對照組，圖b表示燒衝複合傷組；
[0020]圖4是不同實驗組小鼠肺組織透射電鏡觀察圖，其中圖a表示正常對照組，圖b表示燒衝複合傷組；
[0021]圖5是不同實驗組小鼠肺組織micro-CT觀察圖，其中圖a表示正常對照組，圖b表示燒衝複合傷組；
[0022]圖6是不同實驗組小鼠肺組織MPO表達圖,其中圖a表示正常對照組，圖b表示燒衝複合傷組；
[0023]圖7是本發明使用的固定小鼠的固定裝置的結構立體圖。
【具體實施方式】[0024]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚明白，以下結合具體實施例，並參照附圖，對本發明進一步詳細說明。
[0025]圖1為本發明建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法的實際操作照片。
[0026]根據本發明的建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法包括以下各步驟:
[0027]步驟1，建立衝擊傷小鼠動物模型固定裝置。該裝置包括底座、支撐架、及多個帶有皮套的金屬夾構成，且底座、支撐架及帶有皮套的金屬夾連為一體。
[0028]其中底座的結構為由根管組成的硬山兩坡屋頂型結構，其中管可以是鋼管，該底座包括底部以及與底部相連的側部形成，其中底部是直接與地面接觸的矩形框架，側部是以底部矩形的兩條寬為底的三角形框架，該三角形框架構成的平面與底部平面是垂直關係，其中三角形框架為等腰三角形。
[0029]支撐架由五根管構成，其中包括豎直方向固定的兩根管，作為豎直支撐架，以及在兩根豎直管之間橫向固定的上下平行的三根管，作為橫向支撐架。豎直支撐架分別設置在底座兩側，可調節高度，豎直支撐架通過底座的側部三角形框架固定，即豎直支撐架的一端固定在三角形框架的底邊中心，方向垂直於底座的底部，底座的側部三角形框架的頂點與該豎直支撐架固定在一起。支撐架還進一步包括平行設置在兩個豎直支撐架之間的三個平行支撐架。支撐架使用空心或實心的管。
[0030]在靠近底部的兩個橫向支撐架上分別固定2個帶有皮套的金屬夾，可減輕金屬夾對小鼠皮膚與四肢的損傷，分別在支撐架上金屬夾固定處有與金屬夾軸銷相同距離的兩個孔，當把金屬夾夾在軸上時，同時將金屬夾軸銷與橫梁上的孔對準插入即可軸向定位。
[0031]在使用過程中，將小鼠背部皮膚固定在中間的橫向支撐架上帶有皮套的金屬夾中，小鼠四肢固定在相對應的下面的橫向支撐架上的帶有皮套的金屬夾中，每個動物固定裝置可固定2隻C57BL/6小鼠，並可以通過豎直支撐架上的定位螺釘上下移動定位，調整小鼠距離地面的高度。待上述步驟完成後，可手提支撐架將固定裝置放置於不同程度衝擊傷的致傷距離。
[0032]橫向支撐架與豎直兩側支撐架是一整體框架，豎直支撐架是一空心管，管外側有螺孔，定位螺釘擰入螺孔，將上述框架立柱插入豎直支撐架，即可調節整體框架的高度，也即調節了小鼠的距離地面的高度。
[0033]步驟2，選擇健康雄性C57BL/6小鼠一隻或多隻，將小鼠固定到步驟I中建立的固定裝置上。確定重度衝擊傷距離為43cm,中度衝擊傷距離為53cm,輕度衝擊傷距離為63cm。
[0034]在該步驟，將C57BL/6小鼠隨機分為燒衝複合傷組與正常對照組，採用5g8701炸藥為爆炸源，將小鼠固定到固定裝置上(小鼠距離地面IOcm)，針對燒衝複合傷組的小鼠，使固定後的小鼠左側胸壁分別距離爆炸源43cm、53cm、63cm,建立衝擊傷小鼠,依據《2002國家衝擊傷的傷情分度》確定小鼠中度衝擊傷距離為53cm。針對正常對照組的小鼠，將麻醉後的C57BL/6小鼠放置於衝擊波範圍外，即距爆炸源25m處。
[0035]在本發明，爆炸源選擇高2cm、直徑1.5cm、藥量5g的8701混合壓縮炸藥，爆炸源距離地面高度為10cm。壓力傳感器(例如美國PCB，M102A07)，分別固定在小鼠固定裝置的兩側；數據採集器(例如美國Nicolet, Odyssey),分別固定在小鼠固定裝置的底部,分別記錄5g8701混合壓縮炸藥爆炸瞬間,距離爆炸源43cm、53cm、63cm產生衝擊波的壓力值。
[0036]步驟3，在爆炸源爆炸後立即將中度衝擊傷小鼠背部脫毛區域置入90°C水中持續9s，致25%總體表面積IIF燒傷，構建燒衝複合傷小鼠；中度衝擊傷小鼠依據《2002國家衝擊傷的傷情分度》標準，確定53cm衝擊傷小鼠為中度衝擊傷。針對正常對照組的小鼠，傷後即刻將鼠背部浸入37°C溫水中6s。
[0037]步驟4，將傷後24小時的燒衝複合傷組與正常對照組的小鼠處死，取燒衝複合傷組小鼠傷側肺組織進行病理學觀察，肉眼觀察可見肺組織明顯充血，可見約5處斑點狀出血，光鏡下顯示大面積肺泡內出血，透射電鏡下顯示肺泡II型細胞板層小體空化，核濃縮。micro-CT提示燒衝複合傷組左側肺組織可見中度毛玻璃樣區域。進一步免疫組化染色顯示肺組織髓過氧化物酶(myeloperoxidase, MP0)表達明顯升高,與正常對照組相比具有顯著性差異。
[0038]在利用本發明進行的一具體實驗中，選用雄性野生型C57BL/6小鼠，周齡6~8W，體重分別為19~21g，購於中國醫學科學院。動物模型製備前12h禁食，自由飲水。於小鼠腹腔內注射氯胺酮(160mg/kg)麻醉，背部備皮。 [0039]C57BL/6小鼠50隻，以隨機數字表法分為5組，每組10隻，分別命名為:正常對照組、43cm衝擊傷組、53cm衝擊傷組、63cm衝擊傷組、燒衝複合傷組。以5g8701壓縮炸藥柱為爆炸源，將麻醉後小鼠固定於鼠架，以小鼠左側胸壁距爆炸源43Cm、53Cm、63Cm距離進行爆炸，建立衝擊傷模型，依據《2002國家衝擊傷的傷情分度》標準確定中度衝擊傷小鼠距離是53cm。傷後立即將53cm組的中度衝擊小鼠背部脫毛區域置入90°C水中持續9s，致25%總體表面積IIF燒傷，傷後立即腹腔注射林格液lml。正常對照組將麻醉後的C57BL/6小鼠放置於距爆炸源衝擊波範圍外25m處，傷後即刻將鼠背部浸入37°C溫水中6s，傷後補液同燒衝複合傷組。
[0040]該實驗的觀測指標如下:
[0041]1、肺組織病理:傷後24h麻醉處死各實驗組小鼠,取傷側肺5mmX 5mmX 5mm大小的組織，將組織置於10%的中性福馬林緩衝液中固定72h後，轉移至70%乙醇脫水，石蠟包埋。5mm切片進行HE染色。
[0042]2、超微結構透射電鏡觀察
[0043]傷後24h取各實驗組小鼠傷側肺組織ImmX ImmX Imm,立即放入2.5%戊二醛固定2h, 1%鋨酸後固定2h,梯度乙醇和丙酮脫水，Epon812包埋,半薄切片定位後,製作超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色，Philip-CM120型透射電鏡觀察。
[0044]3、Micro_CT檢測:傷後24h各實驗組小鼠麻醉後平放於Micro-CT系統掃描床上，保持仰臥姿勢，膠帶固定胸部，設置完各掃描參數後行小鼠肺組織掃描。各掃描參數如下:管電壓80kV p，管電流200 iiA，掃描模式360°，曝光時間800ms。
[0045]4免疫組織化學染色:免疫組化SP法檢測肺組織MPO的表達，實驗步驟參照試劑盒說明書，兔多克隆MPO抗體(武漢博士德生物工程有限公司，濃度為1:150)。用PBS代替一抗作陰性對照。
[0046]5統計分析:計量資料用均數土標準差表示；組間比較採用方差分析及LSD-t檢驗。
[0047]根據上述實驗步驟，依據《2002國家衝擊傷的傷情分度》標準，對不同組別的小鼠進行分析對比，實驗結果證明，以5g8701炸藥為爆炸源,距離爆炸源43cm, 53cm, 63cm建立衝擊傷動物模型(如圖1所示)，確定重度衝擊傷距離為43cm，中度衝擊傷距離為53cm，壓力值為94Kpa (圖2)，輕度衝擊傷距離為63cm。
[0048]肉眼觀察顯示正常對照組小鼠肺組織未見病變，燒衝複合傷組小鼠肺組織明顯充血，可見約5處斑點狀出血；HE染色結果表明正常對照組小鼠肺組織結構正常，燒衝複合傷組小鼠大面積肺泡內出血(圖3)。此外，透射電鏡觀察發現正常對照組小鼠肺組織結構正常，燒衝複合傷組小鼠肺泡II型細胞板層小體空化，核濃縮(圖4)。肺組織的病理學觀察證實與正常對照組小鼠相比，燒衝複合傷組小鼠肺組織損傷嚴重。
[0049]同樣，傷後24h micro-CT檢查，發現正常對照組小鼠肺組織未見病變，燒衝複合傷組左側肺組織可見中度毛玻璃樣區域(圖5)。進一步免疫組化染色提示燒衝複合傷組小鼠肺組織MPO表達明顯升高，與正常對照組相比具有顯著性差異(圖6)。總之，以上結果提示成功的構建一種燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型。
[0050]以上所述的具體實施例，對本發明的目的、技術方案和有益效果進行了進一步詳細說明，應理解的是，以上所述僅為本發明的具體實施例而已，並不用於限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所做的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種建立燒衝複合傷小鼠肺損傷動物模型的方法，該方法包括步驟: 步驟1，建立衝擊傷小鼠動物模型固定裝置，該裝置包括底座、支撐架、及多個帶有皮套的金屬夾構成，且底座、支撐架及帶有皮套的金屬夾連為一體； 步驟2，利用固定裝置的金屬夾將小鼠固定，並將固定後的小鼠分成不同的組，使用5g炸藥用作爆炸源，使不同組的小鼠分別距離爆炸源43cm、53cm和63cm，確定重度衝擊傷小鼠距離為43cm,中度衝擊傷小鼠距離為53cm,輕度衝擊傷小鼠距離為63cm ； 步驟3，在爆炸源爆炸後立即將中度衝擊傷小鼠背部脫毛區域置入90°C水中持續9s，致25%總體表面積IIF燒傷，構建燒衝複合傷小鼠。
2.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，該方法進一步包括: 步驟4，將傷後24小時的燒衝複合傷組與正常對照組的小鼠處死。
3.根據權利要求1或2所述的方法，其特徵在於，小鼠為雄性C57BL/6小鼠，使用的炸藥是8701炸藥。
4.根據權利要求3所述的方法，其特徵在於，動物模型製備前12小時禁食，自由飲水，於小鼠腹腔內注射氯胺酮麻醉，背部備皮。
5.根據權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述固定裝置的底座包括底部以及與底部相連的側部形成，其中底部是直接與地面接觸的矩形框架，側部是以底部矩形的兩條寬為底的三角形框架，該三角形框架構成的平面與底部平面是垂直關係，其中三角形框架為等腰三角形。
6.根據權利要求5所`述的方法，其特徵在於，所述固定裝置的支撐架由五根管構成，其中包括豎直方向固定的兩根管，作為豎直支撐架，以及在兩根豎直管之間橫向固定的上下平行的三根管，作為橫向支撐架。
7.根據權利要求6所述的方法，其特徵在於，所述固定裝置的豎直支撐架通過底座的側部三角形框架固定，豎直支撐架的一端固定在三角形框架的底邊中心，方向垂直於底座的底部，底座的側部三角形框架的頂點與豎直支撐架固定在一起。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述固定裝置的支撐架還進一步包括平行設置在豎直支撐架之間的橫向支撐架，橫向支撐架是三根。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，在靠近底部的兩根橫向支撐架上分別固定兩個帶有皮套的金屬夾，用戶固定衝擊傷小鼠動物模型。
10.根據權利要求9所述的方法，其特徵在於，橫向支撐架能夠通過定位螺釘上下移動。
【文檔編號】A61D1/00GK103654990SQ201310711558
【公開日】2014年3月26日 申請日期:2013年12月20日 優先權日:2013年12月20日
【發明者】柴家科, 樊軍, 尹會男, 段紅傑, 張海軍, 馮瑞, 劉玲英, 張旭龍 申請人:柴家科