測定富集於腫瘤反興性細胞中的淋巴結的方法

2024-01-28 05:18:15

專利名稱：測定富集於腫瘤反興性細胞中的淋巴結的方法
技術領域：
本發明涉及測定富集於腫瘤反應性細胞中的淋巴結的方法，和這些淋巴結的增殖及其在適於採用的細胞治療中的應用。
本發明中將使用下列縮寫LNL 淋巴結淋巴細胞PBL 外周血淋巴細胞TIL 腫瘤侵潤性淋巴細胞LAK 淋巴因子激活的殺傷細胞IL-2 白細胞介素-2抗-CD3抗-CD3單克隆抗體CC49 CC49單克隆抗體TAG 腫瘤相關性糖蛋白Auto 自體的Allo 異源的Glio 人工培養的人神經膠質瘤細胞系CAR1 人類癌瘤腫瘤
CEA 癌胚抗原MoAB 單克隆抗體BSM 牛下頜粘液PBMC 外周血單核細胞WD124 人工培養的人結腸癌細胞系大約有50%的確診為結腸直腸癌的患者將發展為結腸或直腸外的轉移性疾病。這些患者中大多數人在進行輔助外科手術後不能痊癒，因為疾病不僅是肝內的也是肝外的。需要其它的治療方法以提高患有這種疾病的病人的存活性。
適於採用的免疫治療法為癌症治療提供了一種吸引人的治療模式。Rosenberg等人利用淋巴因子如白細胞介素2(IL-2)以及來源於患者外周血的淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)證明，佔少量但卻是重要的百分比的患有黑素瘤和腎細胞癌的患者獲得了長期持久的反應。Rosenberg等人，「Adoptive Cellular TherapyClinical Applications」，Biologic Therapy of Cancer，Devita，etal.(Eds.)，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，Pa.，1991。第二種適於採用的免疫治療的途徑是從人工培養腫瘤擴展淋巴細胞。Rosenberg，「Adoptive Cellular TherapyClinical Applications」，Biologic Therapy of Cancer，Devita，et al.，(Eds)，J.B.Lippincott Compary，Philadelphia，Pa.，P.241(1991);Topalian，et al.「Tumor Infiltrating LymphocytesEvidence of Specific Immune Reactions Against Growing Cancers in Mice and Human」，Important Advances in Oncology 1990，DeVita，et al，(Eds)，J.B.Lippincott Company，Philadelphia，Pa.，P.19(1990)，and Rosenberg;et al.，「Use of Tumor-Infiltrating Lymphocytes and Interleukin-2 in the Immuno-therapy of Patients with Metastatic Melanoma」，N.Engl.J.Med.，251671，1988。利用這些腫瘤侵潤性淋巴細胞(TIL)，幾個研究者已提供文件證明這些TIL細胞比LAK細胞具更優越的腫瘤細胞裂解活性以及更好地運輸到腫瘤。Rosenberg et al.，N.Engl.J.Med.，id.;Dillman，et al.，「Continuous Interleukin-2 and Tumor-Infiltrating Lymphocytes as Treatment of Advanced Melanoma」，Cancer，68∶1，1991;Kradin，et al.，「Tumor-Infiltrating Lymphocytes in Interleukin-2 in Treatment of Advanced Cancer」，Lancet，33∶577，1989;and Bukowski，et al.，「Clinical Results and Characterization of Tumor-Infiltrating Lymphocytes with or without Recombinant Interleu-kin-2 in Human Metastatic Renal Cell Carcinoma」，Cancer Res.51∶4199，1991。總之，這些TIL細胞對患有黑素瘤的病人顯示有治療效果。已從許多固態腫瘤，包括結腸和乳腺癌中繁殖出腫瘤侵潤性淋巴細胞;但是，在體外這些細胞並不顯示出傳遞腫瘤特異性細胞裂解活性，並且這些細胞是否在適於採用的免疫治療模型中有效還有待測定。Rosenberg，「Gene Therapy of Cancer」，Important Advances in Oncology，1992，DeVita，et al.(Eds)，J.B.Lippincott Co.，New York，NY，pp 17-18，1992。
另一條用腫瘤特異性淋巴細胞進行腫瘤治療的令人振奮的途徑是替代能夠定點地將細胞因子釋放到腫瘤上的細胞中的細胞因子基因。Kasid，et al.，「Human Gene TransferCharacterizationof Human Tumor Infiltrating Lymphocytes as Vehicles for Retroviral-Mediated Gene Transfer in Man」，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87∶473-477，1990;and Rosenberg，et al.，「Gene Transfer into HumansImmunotherapy of Patients with Advanced Melanoma Using Tumor Infiltrating Lymphocytes Modified by Retroviral Gene Transduction」，New Engl.J.Med.，323∶570-578，1990。已在幾個模型系統中證實，已感染了各種細胞因子基因包括IL-2、γ-幹擾素以及腫瘤壞死因子(TNF)的腫瘤細胞比沒有產生細胞因子的親本細胞更具免疫原性以及更小的致瘤性。Gansbacher，et al.，「Retroviral Vector-Mediated Gamma Interferon Gene Transfer into Tumor Cells Generates Potent and Long Lasting Antitumor Immunity」，Cancer Res.50∶7820-7825，1990;Gansbacher，et al.，「Interleukin 2 Gene Transfer into Tumor Cells Abrogates Tumorigenecity and Induces Protective Immunity」，J，Exp.Med.，172∶1217-1224，1990;and Blankenstein，et al.，「Tumor Suppression after Tumor Cell-Targeted Tumor Necrosis Factor-Alpha Gene Transfer」，J.Exp.Med.173∶1047-1052，1991。這將暗示在腫瘤細胞附近定位地產生細胞因子對抑制腫瘤生長和刺激免疫應答產生有利的影響。的確，發現能識別腫瘤的並且能分泌各種應答腫瘤的細胞因子的淋巴細胞，並將這些細胞用於適於採用的免疫治療中將是十分有用的。最後，已證明，儘管某些TIL細胞在體外並不顯示有直接的腫瘤細胞毒性作用，但這些能分泌γ-幹擾素和TNF-α的TIL細胞在體內能介導使腫瘤退化的作用。Barth et al.，「Inerferon-Gamma andTumor Necrosis Factor Have a Role in Tumor Regression Mediated by Murine CD8+Tumor-Infiltrating Lymphocytes」，J.Exp.Med.，173∶647，1991。
由於存在著包括從大多數固體腫瘤如乳腺和結腸直腸癌獲得TIL細胞的難度，在這些條件下擴展的淋巴細胞類型，以及產生TIL細胞所需的培養時間長几個問題，使得該途徑不能廣泛地應用於抑制大多數的腫瘤。腫瘤淋巴細胞的另一個來源是淋巴結。在幾個實驗室中已證明在來自患有胸腺、頭和頸，胰和結腸的癌症患者的局部淋巴結中的腫瘤特異性免疫應答。Hoover，et al.，「Activation and In Vitro Expansion of Tumor-Reactive T Lymphocytes from Lymph Nodes Draining Human Prinmary Breast Cancers」，J.Surg.Oncol.，46∶117，1991;Cozzolino，et al.，「Characterization of Cells from Invaded Lymph Nodes in Patients with Solid Tumors，Lymphokine Requirement for Tumor-Specific Lymphoproliferative Response」，J.Exp.Med.，166∶303，1987;Barnd，et al.，「Specific，Major Histocompatibility Complex-Unrestricted Recognition of Tumor-Associated Mucins by Human Cytotoxic T-Cells」，Proc.Nat.Acad.Sci，USA，867159-7163，1989;and Vose，et al.，「Tumor Reacting Lymphocytes Stimulated in Mixed Lymphocyte and Tumor Culture」，Cancer Immunol.and Immunother.，15∶227-236(1983)。在試驗動物模型中，已證明局部淋巴結含有腫瘤特異性前效應子細胞，當體外擴展這些細胞時，它們能清除試驗轉移瘤。Yoshizawa，et al.，「Activation by Anti-CD3of Tumor-Draining LymphNode Cells for Specific Adoptive Immunotherapy」，Cell Immunol.，134∶473，1991;and Yoshizawa et al.，「Specific Adoptive Immunotherapy Mediated by Tumor-Draining Lymph Node Cells Sequentially Activated by Anti-CD3and IL-2」，J.Immunol∶147∶729，1991。在動物模型中，淋巴結移走的時間的選擇以及原始腫瘤的大小是關係到能否檢測前效應子淋巴細胞的關鍵因素。Yoshizawa，et al.，「Activation by Anti-CD3of Tumor-Draining Lymph Node Cells for Specific Adoptive Immunotherapy，見上文and Sakai，et al.，「Phenotype Analysis in Cellular Mechanisms of Pre-Effector T-Lymphoctye Resp-onse to a Progressive Syngeneic Murine Sarcoma」，Cancer Res.，50∶4371-4376，1990。在沒有刺激腫瘤情況下通過利用抗-CD3和IL-2也可以在體外擴展這些淋巴細胞。如果在人體中鑑別，前效應淋巴細胞可能是潛在地用於適於採用的免疫治療的有價值的細胞。在人體中，選擇可靠的含有腫瘤特異性免疫應答的淋巴結是困難的，因此限制了將淋巴結淋巴細胞(LNL)用作為腫瘤特異性適於採用的免疫治療源的能力。
上述的參考說明書僅引入本文作參考。
廣泛地講，本發明的一個方面是涉及可靠地測定富集在腫瘤反應性細胞，例如CD4+腫瘤特異性淋巴細胞，常稱為T-輔助細胞或T-輔助淋巴細胞中的淋巴結的方法。該方法包括給患者施用有效量的放射性標記的定位器的步驟，該定位器能特異性地結合一個由瘤組織如癌產生或與之相關的一個標記物。然後，給予一段在給藥後放射性標記的定位器優先在瘤組織中聚集的時間以及清除未結合的放射性標記的定位器的時間，以便增加患者瘤組織的光發射與背景光發射的比例。在這一時間過去後，用一放射性檢測探針檢測淋巴結位點中放射的增加量，而測定出顯示有合生了放射標記的定位器的淋巴結位點，從而對患者進行評估(例如，較好的是，通過外科手術;注意，使用Laproscope是不切實際的，儘管這種儀器的使用不排除於本發明中)。然後移走發射量顯示出增加的淋巴結位點，並且進行粗略的肉眼觀察分析，儘管可將這些位點換另一種可選擇方法或再用另一方法進行組織學分析，例如蘇木精和曙紅(HE)組織學估價。
然後篩選那些經過測定並且移走了的淋巴結，所述淋巴結也已經通過粗略的觀察測定是沒有腫瘤的或沒有粗略的瘤疾病的(即，肉眼觀察正常，但可以攝取抗體的那些淋巴結)，培養它們以增殖腫瘤反應性細胞，例如本文中腫瘤特異性T淋巴細胞。如果將這些淋巴結位點進行組織學分析，篩選出那些經HE測定是組織學陰性的位點進行擴展。然後將選出淋巴結進行促有絲分裂刺激。然後較好的是在例如白細胞介素-2(IL-2)和抗-CD3單克隆抗體，以及選擇性地採用自體或異源腫瘤的瘤組織存在下培養淋巴結。然後根據適於採用的免疫治療制度可將經過增殖的腫瘤反應性細胞例如，T淋巴細胞用於緩和(減輕)腫瘤的級別。在癌症的治療中經過擴展或增殖的腫瘤反應性細胞，例如T淋巴細胞，是有效的治療劑。
最近，有人認為CD4+腫瘤特異性淋巴細胞與由有創造力的治療劑顯示的治療效果相關，儘管這並沒有被證明。被移走的淋巴結其特點一定在於CD4+腫瘤特異性淋巴細胞含量，不論這些淋巴細胞是否能顯著地減輕腫瘤級別。選擇「腫瘤反應性細胞」術語用於描述在擴展的移走的淋巴結中存在的活性細胞(在減輕腫瘤級別中的活性)。儘管這些「活性細胞」被認為含有CD4+腫瘤特異性淋巴細胞，但本發明並不限於此。
本發明的優點包括用確實在膽瘤反應性細胞例如，CD4腫瘤特異性淋巴細胞中富集的特定的淋巴結進行選擇的能力。另一優點是通過淋巴結切除術從患者中除去病變組織的能力。本發明的另一優點是擴增包括T淋巴細胞的腫瘤反應性細胞，以便利地形成一種體內減輕腫瘤級別的治療劑。根據本發明中公開的說明書本領域技術人員很容易明白這些和其它優點。


圖1圖示出在IL-2和由[3H]胸腺嘧啶摻入法測定的各種濃度的抗-CD3存在下在加了自體(輻射的)腫瘤的混合性腫瘤淋巴細胞培養物中擴增Ⅰ型LNL。該數據顯示於表2中。在96孔平板上用從新生腫瘤分離出的自體(Auto)或異源(Allo)結腸癌細胞，或自體或異源PBL(5×103個細胞，用4000拉德輻射過)培養的LNL(104個細胞)。四天後加入[3H]胸腺嘧啶(1μCi/孔)並且在18小時後收集平板，利用液體閃爍計數器測定胸腺嘧啶摻入量。所有培養孔含有20μ/ml IL-2。單獨用腫瘤培養LNL，用僅帶有生長因子的腫瘤細胞培養LNL，或僅培養LNL不發生增殖。
圖2圖示出IL-2和抗CD3與IL-2對Ⅰ型LNL在混合的腫瘤淋巴細胞培養中的刺激作用的比較結果。該數據顯示於表3中。在各種濃度的單獨IL-2，或IL-2(20μ/ml)和抗-CD3(50ng/ml)存在下將Ⅰ型LNL(104個細胞)與經輻射的自體腫瘤(5×103)一起培養。在96小時後用[3H]胸腺嘧啶使培養物博動，18小時後收穫。通過液體閃爍計數器測定細胞數。
圖3圖示出Ⅲ型LNL的混合腫瘤淋巴細胞培養物。該數據也顯示於表4。LNL(104個細胞)是在自體或異源(5×103，4000拉德)的人結腸癌細胞和IL-2(20μ/ml)以及各種濃度的抗-CD3存在下培養96小時。在加入[3H]胸腺嘧啶(1μCi/孔)後18小時收集細胞，並且通過液體閃爍計數器測定胸腺嘧啶的摻入量。
圖4圖示出O型LNL的混合腫瘤淋巴細胞培養。該數據也顯示於表5中。LNL(104/孔)分別與自體或異源人結腸癌細胞(5×103/孔，4000拉德)，以及與20μ/ml IL-2和各種濃度的抗-CD3一起培養96小時。96小時後加入[3H]胸腺嘧啶(1μCi/孔)，並且在18小時後收集平板，通過液體閃爍計數器測定胸腺嘧啶的摻入量。
圖5圖示出來自同一患有結腸直腸癌的患者的Ⅰ型LNL和O型LNL的比較。該相同的數據也圖示於表4中。Ⅰ型和O型LNL(104/孔)都是在自體結腸癌細胞(5×103/孔，4000拉德)以及20μ/ml IL-2以及抗-CD3(50ng/ml)存在下培養96小時。96小時後加入[3H]胸腺嘧啶1μCi/孔並在18小時後收集平板。
圖6圖示出Ⅰ型和Ⅲ型脾細胞的混合腫瘤淋巴細胞培養物。該同樣數據也顯示於表6中。脾細胞(104個細胞/孔)是在自體或異源結腸癌細胞(5×103個/孔，經輻射的細胞)存在下培養96小時。至於Ⅲ型脾細胞情況，使用兩種異源腫瘤。所有培養物都含有20μ/ml IL-2以及各種濃度抗-CD3。在96小時後，加入[3H]胸腺嘧啶1μCi/孔，並且在18小時後收集平板，測定胸腺嘧啶的摻入量。
圖7圖示出各種腫瘤對Ⅰ型LNL在混合腫瘤淋巴細胞培養中的刺激作用的比較結果。該同樣數據也顯示於表6。在幾種腫瘤(5×103/孔，經輻射的細胞)，包括自體結腸癌細胞，人工培養的人神經膠質瘤(Glio)細胞系，從進行肝移植的患者中新鮮收集的人類癌(CAR1)腫瘤，人工培養的結腸癌細胞系(WD 124)，以及含有IL-220μ/ml和抗-CD3(50 ng/ml)的自體PBL＇s存在下複合培養來自Ⅰ型淋巴結的LNL(104/孔)。96小時後加入[3H]胸腺嘧啶(1μCi/孔)並且在18小時後收集細胞。通過液體閃爍計數法測定[3H]胸腺嘧啶的摻入量。沒有生長因子的腫瘤培養的LNL，或只有生長因子的腫瘤培養物並不刺激增殖。LNLs是僅用IL-2(20μ/ml)和抗-CD3(50ng/ml)培養的Ⅰ型。
圖8圖示出由在兩套不同的促有絲分裂刺激條件下培養的經擴增的LNL細胞或在自體腫瘤或異源腫瘤存在時培養的經擴增的LNL細胞產生的腫瘤壞死因子(TNF)。
圖9圖示出第10天時在IL-2(100U/ml)加抗-CD3抗體(0.1μg/ml)存在時定位培養的細胞因子mRNA的表達。通過逆轉錄以及用聚合酶鏈反應(PCR)擴增cDNA而分析細胞因子mRNA。道M＝123bp分子量梯(Gibco/BRL)。
圖10圖解顯示在已經接收了新的治療劑後存活的患者的百分數相對於治療劑給藥後時間(月數)的關係。
圖表中報導的試驗結果將在下面詳細討論。
直到最近，對患病(例如攜帶腫瘤)的淋巴結的體內篩選只限於外科醫生的肉眼觀察選擇以及病理學家的診斷。Nieroda，etal.，「Radioimmunoguided Surgery(RIGS)in Recurrent Colorectal Cancer」，Cancer Detection and Prevention，Vol.14，Issue 6，pages 651-656(1990)，以及「Radioimmunoguided Surgery in Primary Colon Cancer」，Cancer Detection and Prevention，Vol.15，Issue 3，Pages 225-229(1991)公開了探查患有瘤組織的病人的方法，該方法是採用Radioimmunoguided SurgeryTM系統，利用Neoprobe ROGS γ檢測探針(Radioimmunoguided Surg-eryTM是商標，Neoprobe 和RIGS 是Neoprobe公司，Columbus，Ohio的註冊商標)進行的。由該系統測定的淋巴結含量使外科醫生和/或腫瘤學家可能大約地估測患者的發病期，例如著重地對患者進行輔助的化學治療。
這種分析階段方法的產生是基於美國專利4，782，840(該公開內容全部引入本文作參考)，該專利公開了一種更加改善的用於定位測定、分化和切除腫瘤的方法。該技術利用放射性標記的抗體和外科醫生可以在手術中利用的可移動的放射檢測探針，從而檢測出放射性增加的位點。該方法被稱作RIGS 系統，並且是成功的，因為認識到腫瘤檢測應該延遲到參與循環的放射性標記的抗體的血庫背景有機會從體內清除，以便使腫瘤發射出的光發射或輻射與環境組織相比得到增強。幸運的是，4，782，840號專利公開了放射性標記的抗體能夠保留束縛至或結合至瘤組織上更長的時期，在該時期內仍束縛著放射性殘跡。並且，即使腫瘤位點的放射活性在整個時期內降低，血庫背景和環境組織(相對於腫瘤位點)也會以更大的速率降低，從而可以利用手操作探針，如一種Neoprobe RIGS 1000放射性檢測器容易地測定放射性位點。
使用帶有Neoprobe RIGS 1000放射性檢測器和125ⅠCC49單克隆抗體的＇840專利的RIGS 系統，已經鑑定了淋巴結並且有獨創性地將它分為五個類別。最近的工作表明為了篩選出適於擴增和形成能減輕腫瘤級別的治療劑並不必需要這種外延的分類。如果下列的某些討論涉及這種有獨創性的淋巴結的分類，應理解實施本發明並不必需要使用這樣一種分類系統。早期產生的分類系統列於下面表1中。
表1淋巴結類別O型 RIGS 探針(-),組織學(-)I型 RIGS 探針(+),組織學(-)II型 RIGS 探針(+),顯示有隱藏腫瘤III型 RIGS 探針(+),常規組織學(+)(肉眼觀察)IV型 RIGS 探針(-),常規組織學(+)(肉眼觀察)O型淋巴結沒有可檢測的放射性活性，也沒有腫瘤的組織學特徵。Ⅰ型淋巴結呈放射性陽性，但常規HE組織學檢測為陰性;Ⅱ型淋巴結呈放射性陽性，並且含有隱藏腫瘤的跡象。Ⅲ型淋巴結呈放射性陽性並且含有腫瘤的組織學跡象。Ⅳ型淋巴結呈放射性陰性並且含有腫瘤跡象。
從解剖學上說，大多數Ⅰ型淋巴結存在於外周淋巴結、腹腔淋巴結以及胰上的主動脈淋巴結。在患有初發的結腸直腸癌的患者中，約30%的引流局部結腸的腸繫膜的結是Ⅰ型。大部分的Ⅲ型和Ⅳ型淋巴結存在於腫瘤附近的結腸腸繫膜。如果採用一系列切片法或細胞角蛋白抗體進一步分析Ⅰ型淋巴結，發現約40%的Ⅰ型淋巴結有腫瘤跡象，因此它們實際上是Ⅱ型淋巴結。為了達到本發明目的，採用HE組織學法測定Ⅰ型淋巴結，篩選這些淋巴結進行培養以增殖腫瘤反應性細胞，例如，CD4+T淋巴細胞。但是較好的是，將明顯的Ⅰ型淋巴結進行一系列切片分析或細胞角蛋白抗體分析以重新確定組織學分析為陽性並且因而含有隱藏腫瘤的那些淋巴結的類型，實際上這樣的淋巴結屬於Ⅱ型。因此，用幾乎不帶有或完全不帶有腫瘤的LNL進行培養以增殖CD4+腫瘤特異性淋巴細胞。對涉及淋巴結類別的進一步的討論見於Arnold等人，「Radioimmunoguided Surgery Challenges Traditional Decision Making in Patients with Primary Colorectal Cancer」，Surgery.Vol.112，No.4，pp 624-630(October 1992);and Arnold等人，「Intraoperative Detection of Colorectal Cancer with Radioimmunoguided Surgery and CC49，a Second-Generation Monoclonal Antibody」，Annals of Surgery，Nol.216，No.6，627-632(December 1992)，所有公開內容引入本文作為參考。
本發明方法的第一個步驟包括給患者施用有效量的放射性標記的定位器，該定位器特異性地結合一種由瘤組織產生或與瘤組織相關的標誌物。如上所述，該「定位器」包括一種物質，該物質通過與一種由瘤組織或腫瘤產生的或與之相關的標誌物(例如癌細胞或癌細胞的產物)相結合而優先在腫瘤位點聚集。如今合適的定位器主要包括抗體(完全和單克隆)、抗體片段、完全抗體與抗體片段的嵌合形式，以及其人性化形式。但是，應該意識到已經產生了的單鏈抗體(SCAs，如在美國專利4，946，778中公開的)及其類似物質，同樣可以證明是有效的。利用生物化學和遺傳工程技術還可以產生能模擬抗體的選擇性地聚集在瘤組織位點處的功能的物質(可能是激素，肽以及其它蛋白質等)，儘管不能把這些物質歸入傳統定義的「抗體」一類。選擇「定位器」術語包括本發明的抗體及其類似物，以及那些在本發明公開的方法中被測定的具有模擬抗體功能的物質。
目前，在本發明中使用的抗體包括抗-TAG抗體，例如B72.3(一種抗-TAG 72抗體，Dr.Jeffrey Schlom，National Cancer Institute)，CC49(一種第二代B72.3抗體，參見Arnold等人，「Intra-operative Detection of Colorectal Cancer with Radioimmuno-guided SurgeryTM(RIGS )and CC49 a Second-Generation Monoclonal Antibody (Mab)」Ann Surg.，accepted for publication，Cancer Res.50，6987-6994，Nov.1，1990;Cancer Res.48，4597-4603，Aug.15，1987;J.Clin.Lab.Analysis 3∶369-369(1989);Biol.Chem，Hoppe-Seyler，1989，370∶21-26;Cancer Res.，50∶4885-4890，Aug.15，1990;Cancer Res.，48∶4588-4596，1988;Cancer Res.，50∶4872-2879，Aug.15，1990;Cancer 67∶2880-2886，1991;Cancer Res.50∶1291-1298，1990;Biotech-nology，3∶378-384，1985;Proc.Nat'l Acad.Sci.USA，78∶3199-3203，1981;Cancer Res.，48∶6811-6818，1988;Cancer Res.，48∶2214-2220，1988;J.Nat'l Canc.Inst.1986∶6666)∶995-1003;Int'l J.Cancer 1982∶29∶539-545;Int'l J.Cancer 1983∶31∶543-551;Cancer Res.，50∶6987-6994，1990;Cancer Res.，51∶2889-2896，1991;J.Clin.Lab.Anal.，4∶465-473，1990;Cancer Res.，51，6363-6371，Dec.1，1991;J.Nat'l Cancer Inst.82∶1191-1197，1990;Cancer Res.51，5378-5383，Oct.1，1991);CC83，another second generation B72.3 antiTAG antibody;CEA antibodies such as A5B7monoclonalantibody(Cancer Research Campaign Technology，Ltd，London，England)(see Int.J.Cancer，47∶597-602，1991;Br.J.Cancer，54∶75-82，1986;Br.J.Cancer，61∶891-894，1990;Int.J.Cancer，Supplement 3，34-37，1988;Eur.J.Nucl.Med，13∶197-202，1987;Br.J.Cancer，60∶549-554，1989;and Br.J.Cancer，61∶659-662，1990);單克隆抗體B17-1A以及它的F(ab')2片段(Wistar Institute，Philadelphia，Pa.);以及單克隆抗體19-9和它的F(ab')2片段(Centocor，Inc.Philadelphia，Pa.)。
關於放射性標記的選擇，能夠使用一種可置於與淋巴結緊密相連處的放射性檢測探針意味著低水平能量的同位素是優選的，尤其是那些其光子發射能量水平低於550kev，優選的是低於約300kev，更優選的是低於約150kev的同位素。儘管出於必要，並令人滿意或方便考慮，也可以使用在'840號專利中公開的其它的低能量同位素，但目前125Ⅰ是優選的同位素。更高能量的放射性同位素(例如，131Ⅰ)也可以使用，儘管必須使用合適視準的放射性檢測探針，而這妨礙了易為外科醫生使用的儀器並限制了體腔內適於檢查的區域。
除了發射γ射線的放射性同位素，也可以將另外地顯示有β射線的放射性同位素與能檢測β射線或質子的探針結合起來。在美國專利5，008，546中公開了手術中β發射的檢查，該說明書引入本文作為參考。
經標記的定位器的劑量是保證能夠利用放射性檢查探針測出顯示有合生了放射性標記的定位器的淋巴結位點。該劑量依賴於特定類型的標記物，定位器的類型，以及類似的可以影響到如本領域內技術人員認識到的劑量需求的因子。
對於顯示出合生了放射性標記的定位器的淋巴結位點的檢出，可以參考下列專利，這些專利提供了用於檢測γ發射的優選的手操作探針美國專利4，801，803、4，889，991和5，070，878，所有公開內容引入本文作為參考。如上所述，美國專利5，008，546公開了適於檢查β-發射物的探針。如果必要，並令人滿意或方便，也可以使用其它的發射檢測裝置。關於這一點，應該意識到為了測定相關的淋巴結而進行的病人的手術中估評僅僅是本發明實施的另一可選擇途徑。另外，可將探針用作為腹腔鏡、縱隔鏡或類似的特定儀器的一部分，該特定儀器適於裝備小型放射檢測裝置，可將該裝置置於與淋巴結的緊密連接處，以便檢測連生的放射活性。不管使用的儀器或技術，本發明包括所有各種稱號的這樣的儀器和技術。
如在＇840號專利中報導的，用放射性檢測探針對病人進行直接評估是不適當的。優選的是在施用放射性標記的定位器後等待一段時間以便從檢查的淋巴結周圍組織中清除掉未結合的放射性標記的定位器。合適的放射性檢測探針的功能在於檢測除存在於正被檢查的患者所處位置(例如手術室)的正常背景放射性以外以及除血庫背景(在血液中循環的放射性標記的定位器)和可能含有未結合的放射性標記的定位器周圍組織以外的放射活性水平。該時間可能短至幾分鐘，直到幾個星期，依據患者體內清除(經過代謝)該放射性標記的定位器的速度而定。重要之處是認識到在這段時間消逝後，放射性標記的定位器仍將與帶有完整放射性標記的腫瘤細胞位點結合，儘管其以降低的水平。重要地，按照外來的閃爍法和外來的典型技術的傳統教條，基於放射性標記的定位器的最大的腫瘤攝取量檢查淋巴結是不合適的。
一旦合適的時間間隔消逝後，用放射性檢測探針評估患者，並通過用該探針檢測淋巴結位點處增加的放射水平而決定放射性標記的定位器的連生從而用該探針監測淋巴結位點。除了＇840號專利中公開的可改變外科手術治療進程的微小轉移性組織的測定外，本發明現在使內科醫師能測定在CD4+淋巴細胞中富集的淋巴結，以用於製備減輕瘤組織(癌)的治療劑。
然後以一定方式擴增或增殖經過檢測的淋巴細胞，該方式與在前面的免疫治療程序中介紹的常規細胞擴增法完全相背離。簡而言之，細胞擴增包括下列步驟從淋巴結組織中分離開LNL;體外活化並開始細胞擴增;更換培養基，將細胞培養物分離開，斷絕外源細胞因子;收集細胞，製備施用給患者的最終產品。
採用常規方法如通過離心將細胞和組織分離開以收集LNLs。細胞擴增的啟動包括開始使用無血清的巨噬細胞SFM培養基，該培養基是該細胞擴增方式的獨特之處。另外，最優選的促有絲分裂刺激是用IL-2和同時加入的可溶性抗-CD3細胞(而不是如本領域內已知的依次加入並使用平板束縛的抗-CD3細胞)。在細胞生長期間定期地向培養物中加入等量新鮮培養基和細胞因子。重要的是，通過只加入新鮮培養基而使IL-2量降低，就是說低於每ml培養物為20個鯨魚星座單位，從而將細胞與外源細胞因子(例如，IL-2)分離開。據認為將細胞與外源細胞因子分離開，排除了將其它的細胞因子與LNL細胞一起供藥給患者的可能性，並且有數據將會證實這一點。
典型的細胞擴增方式詳細過程描述於下文0天將含有50μg/ml慶大黴素的無血清巨噬細胞SFM培養基10L預分裝到配藥袋中，無菌製備體外細胞生長培養基。將裝有細胞和組織分離步驟中得到的經過洗滌的淋巴結淋巴細胞的圓錐形試管緩慢地倒轉數次以混合細胞。將細胞混合後，移走1ml樣品進行計數。基於細胞濃縮法，將IL-3和抗-CD3加入到細胞懸液中，其量為達到在加入的培養基中的濃度為每106個細胞含100鯨魚座單位的IL-2(Chiron Corp.，Emeryville，CA)和每106個細胞含100ng抗-CD3(OKT3，Johnson and Johnson，Raritan，NJ)。
用一個60CC的無菌注射器將含有IL-2和OKT3的細胞懸液轉移到含有完全培養基的1升無菌的氣體可滲透的培養袋中以便最後細胞濃度為1×106個細胞/ml。現在細胞置於密封的培養系統中並且一直留在該密封系統中直到10天培養期結束。
用病人的鑑別標誌標記細胞培養袋，然後置於含7%CO2的一個37℃溼潤培養箱中。
第4天培養時期起動4天後，從培養箱中移走細胞培養袋。緩慢地揉捏培養袋以使細胞分散於溶液中。將一個無菌注射器刺入培養袋的取樣部位，取出5ml試樣進行計數、存活性檢測及形態學分析。
基於每袋中最後濃度應為0.25×106個細胞/ml而計算出加入到各種新鮮的1升培養袋中的新鮮完全培養基和細胞懸浮液的最終體積。向含有細胞懸液的培養袋中按每106個細胞含300鯨魚座單位的IL-2濃度加入IL-2，以便使在每個新鮮1升培養袋中IL-2的終濃度達到100鯨魚座單位/ml。
為了轉移到新鮮培養基和新鮮無菌的氣體可滲透的培養袋中現在製備細胞培養袋。利用一個DuPont SCD無菌管形焊機，在無菌泵管道裝置，含有細胞懸液的培養袋，新鮮的完全培養袋，以及無菌袋之間建立一條封閉的轉移線，培養基和細胞將被轉移到無菌袋中。將泵管道穿過蠕動泵的凸輪，配置懸浮液的和添加的新鮮完全培養基的量。開啟泵並且將細胞懸液袋內含物和新鮮培養基分配到預定數目的新鮮培養袋中。
一旦完成轉移後，將每個袋的無菌的管道封口焊上。用患者的鑑別標誌標記每個袋。將所有袋移回到37℃，7%CO2的溼潤培養箱中。根據醫用廢物處理的慣例指南丟棄所有原始的培養袋。
第7天從培養時間起始7天後，再次通過緩慢揉捏混合細胞，從一個培養袋中移出5ml樣品，並分析其細胞數及存活性和形態特徵。根據細胞計數結果，計算出新鮮培養基和細胞懸液體積以達到在新鮮的1升培養袋中最終濃度為0.5×106個細胞/ml。向新鮮完全培養基中加入40鯨魚座單位IL-2/106個細胞，以便在轉入了培養基和細胞懸液的每個培養袋中最終濃度達到20鯨魚座單位IL-2/ml。
利用前面描述的蠕動泵和無菌管道焊接裝置將細胞和新鮮培養基轉移到新鮮的氣體可滲透的袋中。一旦轉移和封閉完成後，標記該袋並置於37℃、7%CO2溼潤培養箱中。
第9天在製備用於輸往患者的細胞前24小時，從10%的培養袋中各取出10ml試樣進行厭氧和需氧微生物學分析。
給患者輸入製劑第10天在培養時期的第10天，從培養箱中取出培養袋以除去培養基，將每個培養袋中細胞集中在一起並濃縮細胞。根據培養袋數目，該過程將花費45分鐘到2小時。利用Stericell處理機和收集碗，每個1L培養袋的處理速率為250ml/分鐘培養袋的管道穿過處理機的凸輪並開啟泵和離心機。在處理機碗中濃縮細胞並排出培養廢液，丟棄。
在將所有培養袋集中並除去培養基後，用大約950ml的1.25% USP人白蛋白的無菌鹽水液洗滌細胞以除去剩留的培養基。逆轉Stericell泵的流動方向將大約270ml的細胞泵到一個無菌的500ml轉移容器中。使用50ml的白蛋白和鹽水混合物將處理機碗浸於轉移容器中。該輸液製劑的最後細胞濃度為1～5×1010個細胞。用合適的病人鑑別標誌標記該製劑。
用一個無菌注射器從輸血袋中取出1ml試樣用於質量控制(QC)試驗。然後將輸液貯存於2～8℃直到完成所有的QC試驗。在QC試驗得到了滿意結果後將患者輸液製劑交給護理醫師。
製備過程控制整個QC程序將質量控制程序設計為能保證在製造中所用的材料的質量以及最終產物的質量。
其它的控制包括保證整個製備過程中患者細胞的確認。將一個給定患者的所有細胞培養容器與其它患者細胞隔離開，並且用特定的患者鑑別標誌清楚地標記。給每個患者指定一個培養箱，在10天的培養時期內該培養箱專用於該患者的細胞而不是與其它患者共用。
開放的細胞培養操作是極少見的，並且如果需要，在起始培養準備期間，該操作可在層流罩中無菌條件下完成。包括細胞培養物分離及轉移等大多數處理過程是在密閉的培養系統中完成的以防止汙染。
細胞培養物QC檢測在0天、第4天、第7天和第10天無菌收集細胞培養物並分析其存活性，細胞數和形態特徵。用藍色染色技術估測存活性及細胞數。用Wrights-Giemsa染色法，用顯微鏡觀察細胞自旋製劑而完成形態學觀察。
在患者輸液前24小時，用BACTec血液培養試劑進行好氧和厭氧細菌培養。在患者輸液前即時進行革蘭染色以及用FDA許可的商品檢測法進行內毒素測試試驗。
經過擴增的活化的細胞的輸液製劑必須是革蘭染色陰性的，表明細胞存活性≥70%，並且其具有的經檢測的LAL水平為＜1.0EU/ml。
根據需要，製備約1010個細胞用於施藥給患者。目前自體擴增細胞優選用於供給已取走淋巴結的患者。優選的是，也可將由外科醫生判斷的可切除的瘤組織與確定的淋巴結一起切除。此後供給治療劑。對於那些其包含的瘤組織是不可切除的病人，僅切除其確定的淋巴結並進行擴增，最後供給治療劑。
下面的試驗方案匯聚了本文中產生及報導的初始資料。
實施例1起始的試驗步驟患者的選擇及RIGS 探針系統患者的選擇以及RIGS 探針系統合適的患者已為結腸直腸癌，再發性疾病或初生癌提供了證明材料。所有被研究的患者經歷了廣泛的外科手術前的評估，以便可能的話消除那些患者的額外的腹腔腫瘤。外科手術前的評估包括胸部、腹部和骨盆的CT掃描，以及如果的確必要的話進行骨掃描。CEA檢測以及結腸鏡檢測也是外科手術前評估的部分。所有患者籤署一個慣常的覆審部門書面同意書。在放射性標記抗體給藥前2天，患者開始用碘化鉀的口服液(每天二次10滴SSKI，或者每天二次500mgKI)治療以阻止甲狀腺吸取放射性標記的CC49的單克隆抗體，這一過程繼續三星期或直到外科手術。用Ohio州大學(OSU)醫學中心核藥店進行的生碘學方法將CC49MoAb進行放射性碘標記。一旦證實用未標記的抗體皮膚試驗呈陰性，即給患者靜脈注射用1mCi的碘-125(125Ⅰ)標記的並在4ml磷酸緩衝鹽水中稀釋的0.1mg的CC49 MoAb並輸注5分鐘。注射後對所有患者觀察1小時，並在這1小時內每隔15分鐘記錄重要的信號。當由γ檢測探針(GDP)，Neoprobe RIGS 1000儀器測定的心前區的點數在每2秒內小於20點時給病人安排外科手術。在外科手術注射前獲得血清樣品。
手術程序包括利用Neoprobe RIGS 1000儀器進行的徹底的剖腹術，其詳細方法已在前面描述過。在外科手術期間，在胃肝炎胸膜、門靜脈周區、腹腔結、上胰區以及腸繫膜結中檢測淋巴結以找到RIGS 檢測陽性的淋巴結。根據一種組織與背景比例大於1.5∶1可決定它是RIGS 檢測陽性組織。從患者以及腫瘤組織樣品中收集各種淋巴結。立即將這些材料浸於緩衝鹽水中送到病理診室。所有這些材料由病理學家檢測。無菌處理這些組織。
將所有這些淋巴結縱向剖開並將其中一半送到淋巴結實驗室中並且保持另一半用於進行蘇術素和曙紅(HE)組織學評估。該病理學家檢測所有被解剖的結。由病理學家檢查該腫瘤組織，取走小於幾釐米的小片段，並置於無菌鹽水中，轉運到淋巴結實驗室。對所有收到的患者材料進行常規病理學包括蘇木素和曙紅染色檢測。
淋巴細胞的製備在進行手術的那天，取患者的血並進行Ficoll-Hypaque(Pharmacia)分離以獲得外周血單核細胞(PBMC)。洗滌這些細胞並重懸於RPMI 1640中，該RPMI 1640中加入了青黴素(100單位/ml)、鏈黴素(100μg/ml)和10%人血清AB型(GIBCO，檢測支原體)。這是完整的RPMI(RPMIc)。如果將要使用脾細胞，緩慢地將脾組織切碎置於RPMIc中。按上面描述的Ficoll-Hypaque分離法處理得到細胞懸液。如果這些淋巴細胞將要用作為刺激細胞，將這些細胞用4000拉德(銫源)照射，然後置於混合的淋巴細胞培養物平板上培養。
將淋巴結置於冰上的無菌培養基中直到進行處理，並且通過緩慢地將淋巴結切碎到RPMIc中而製備淋巴細胞。將細胞懸液離心並在RPMIc中洗滌沉澱。在進行各種檢測前先完成藍色排除試驗以測定存活性。通常存活性大於95%。利用來自Coulter的Epics ELITE流式細胞計數器分析CD4+和CD8+淋巴細胞。將LNLs用雙重的染色試劑T4-FITC/T8-PE(Olympus)染色。將細胞重懸於0.1ml PBS(1%胎牛血清)(5×105/管)並在10μl T4/T8染色試劑中室溫下黑暗中保溫20分鐘。在其它的PBS中將細胞洗滌二次，用0.5ml PBS緩衝的1%甲醛固定，並貯存於4℃，黑暗中直到利用流式細胞計數器分析。
腫瘤樣品的製備將切下的腫瘤貯存於冰上的無菌鹽水中以維持其存活。在移走進行病理學檢測所必要的組織後，將該腫瘤在無血清的RPMI(RPM-Iic)中洗滌，並將其切成1～1.5mm片段大小置於培養皿中。將經切碎的腫瘤轉移到50ml圓錐形離心管中，其中組織浸於另外的RPMIic中。移走大約5ml至10ml的培養基，並向試管中加入等體積的在PBS中製備的0.4%Ⅰ型膠原酶(SIGMA)。該消化過程在37℃保溫1小時。每隔15分鐘旋轉一下試管以幫助細胞分散。在保溫之後，加入RPMIc至相當於45ml的試樣。使未消化的腫瘤沉澱下來並且小心地從試管的頂部移走細胞懸液。以400×g將細胞離心15分鐘。將得到的腫瘤留在試管中，然後進行其它的消化步驟。在將腫瘤細胞沉澱用RPMIc洗滌2次後，用藍色排除法測定存活性。假如這些腫瘤細胞用於擴增分析，則將其用3000拉德(銫源)照射，然後平板培養。保存留下的活腫瘤懸液作為冰凍的腫瘤庫以在未來的試驗中用作為異源細胞。
腫瘤細胞系將這些腫瘤細胞培養於添加了伊格爾氏鹽的基本必需培養基中，該培養基中加入了L-穀氨醯胺2mM、非必需胺基酸、丙酮酸鈉0.1mM、MEM維生素溶液，以及15%胎牛血清(所有這些來自GIBCO)。Glio是人體神經膠質瘤細胞系。CAR-1是從由於轉移性類癌而進行肝移植的患者中獲得的類癌腫瘤，並用相同於處理結腸癌細胞的方法處理之。在RIGS 步驟期間從患有再發性結腸癌的患者中分離出WD124(一種結腸癌細胞系)。如果這些傳遞的細胞系用於混合的淋巴細胞/腫瘤分析，則將其置於30，000拉德(銫源)下照射，然後平板培養。
混合的腫瘤淋巴細胞分析使用20μ/ml濃度的IL-2。抗-CD3是一種鼠抗-人抗體(參見Yoshizawa，et al.「Activation of Anti-CD3of Tumor-Draining Lymph Node Cells for Specific Adoptive Immunotherapy」，Cellular Immunology，134，473-479，1991)。在96孔圓底組織培養平板進行混合的腫瘤淋巴細胞培養試驗。在整個分析中利用RPMIc作為稀釋劑，最後的細胞體積為每孔0.2ml。所有組都包括對照，對照包括僅淋巴細胞或腫瘤細胞、淋巴細胞和腫瘤細胞。上述每一種都含有IL-2，並將培養物與IL-2以及一劑量效應的抗-CD3混合。以每孔1×106密度平板培養淋巴細胞，而腫瘤以每孔5×103的密度培養。將平板在溼潤CO2培養箱(5%CO2)37℃保溫96小時。在這段時期後，向每孔中加入1μCi的[3H]胸腺嘧啶(ICN，比活性6.7Ci/mmol)維持18小時。用一個細胞收集器結合玻璃纖維濾紙條一起收集孔中細胞。將打孔後得到的濾紙片浸於小試管中在用Bec-kman 1801閃爍計數器計數前加入水相閃爍夾層。將學生試驗中使用的統計分析法用於測定顯著性。
起始實驗結果當在IL-2和抗-CD3存在下將Ⅰ型LNL和自體(輻射過的)腫瘤在混合的腫瘤淋巴細胞培養物中共培養時，經[3H]胸腺嘧啶摻入法測定淋巴細胞的擴增有3～10倍增加，如在示意性圖1和下面表2中看到的。
表2細胞系培養類型抗-CD3每分鐘編號 (ng/ml) 細胞數10 LNL+IL-2+Anti-CD31 97710 LNL+IL-2+Anti-CD310 241410 LNL+IL-2+Anti-CD350 321710 LNL+IL-2+Anti-CD3100 267512 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD31 182712 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD310 805112 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD350 941212 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD3100 892014 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD31 184314 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD310 580214 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD350 580314 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD3100 578916 Auto PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD31 99616 Auto PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD310 193716 Auto PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD350 320116 Auto PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD3100 327018 Allo PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD31 131718 Allo PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD310 232418 Allo PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD350 2665
表2(續)細胞系培養類型抗-CD3每分鐘編號 (ng/ml) 細胞數18 Allo PBLs+LNL+IL-2+Anti-CD3100 3729隻有用抗-CD3和低濃度的IL-2(20U/ml)活化淋巴細胞時才出現增殖。如上述數據可證明這些LNL與自體人結腸癌細胞有各種程度的響應。在僅IL-2存在下，LNL僅有節制地激增腫瘤細胞，並且使用IL-2時沒有看到出現顯著增殖，腫瘤細胞數僅相當於用IL-2和抗-CD3時看到的擴增。
表3細胞系培養類型 IL-2 抗-CD3每分鐘編號 (μ/ml) (ng/ml) 細胞數20 LNL+IL-2 20 0 55822 LNL+IL-2+Anti-CD320 50 179324 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD320 50 539826 Auto+LNL+IL-2 20 0 107028 Auto+LNL+IL-2 100 0 98630 Auto+LNL+IL-2 500 0 277
Ⅰ型淋巴結含有約40%至70%之間的CD4+淋巴細胞以及約80%至15%的CD8+淋巴細胞。用PBL已證明IL-2和抗-CD3能刺激CD4+和CD8+淋巴細胞的擴增，但單獨IL-2不刺激CD4+淋巴細胞擴增。Nishimura，et al.，「Generation，Propagation，and Targeting of Human CD4+ Helper/Killer T-cells Induced by Anti-CD3Monoclonal Antibody Plus Recombinant IL-2，An Efficient Strategy for Adoptive Tumor Immunotherapy」，J.Immunol.，148∶285-291，1992。也可能是在Ⅰ型結中使用高百分數的CD4+淋巴細胞，抗-CD3和IL-2可刺激那些單獨用IL-2不能刺激的細胞。
與Ⅰ型淋巴結相反，Ⅲ型LNL在自體腫瘤、異源腫瘤或IL-2和抗-CD3都存在時沒有擴增應答，如參照圖3和下面表4能看到的。
表4細胞系培養類型抗-CD3每分鐘編號 (ng/ml) 細胞數32 LNL+IL-2+Anti-CD31 19232 LNL+IL-2+Anti-CD310 310.832 LNL+IL-2+Anti-CD350 308.632 LNL+IL-2+Anti-CD3100 31134 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD31 270.934 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD310 279.534 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD350 246.734 Auto+LNL+IL-2+Anti-CD3100 286.7
表4(續)細胞系培養類型抗-CD3每分鐘編號 (ng/ml) 細胞數36 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD31 439.736 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD310 382.436 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD350 470.536 Allo+LNL+IL-2+Anti-CD3100 446.3由於腫瘤含有的淋巴結已是TIL細胞的一種來源，因此腫瘤免疫活性喪失及擴增喪失的原因不清楚。Schwartzentruber，et al.，「Specific Release of Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor，Tumor Necrosis Factor Alpha，and Gamma Int-erferon by Human Tumor-Infiltrating Lymphocytes After Autologous Stimulations」，J.Immunol.，146∶3674-3681，1991。但是，TIL細胞生長的分析需要長期培養和高濃度的IL-2，在本文中報導的LNL分析是短期的僅在新鮮培養基中培養4天的分析。
O型淋巴結淋巴細胞的應答是不同的。大多數在IL-2和抗-CD3存在下對異體或自體腫瘤顯示非常低的腫瘤特異性擴增，參照圖4和下面表5可見。
表5細胞系培養類型抗-CD3每分鐘編號 (ng/ml) 計數38 LNL+IL-2+抗-CD31 359.138 LNL+IL-2+抗-CD310 42138 LNL+IL-2+抗-CD350 40638 LNL+IL-2+抗-CD3100 376.240 Auto+LNL+IL-2+抗-CD31 327.640 Auto+LNL+IL-2+抗-CD310 357.240 Auto+LNL+IL-2+抗-CD350 32140 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3100 321.542 Allo+LNL+IL-2+抗-CD31 476.742 Allo+LNL+IL-2+抗-CD310 491.142 Allo+LNL+IL-2+抗-CD350 563.442 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3100 504.8與大於90%以上的Ⅰ型結的顯著增殖相比較，僅有25%至30%的選擇出的O型結顯著地激增腫瘤。曾有從具有Ⅰ型結但並不顯示腫瘤特異性擴增的患者中獲取O型結的情況，但是，基於一個細胞得到的擴增數總是比在Ⅰ型淋巴結中看到的擴增量小得多，如參照圖5和下文表6可看到的。
表6細胞系編號 培養類型 結類型 每分鐘計數44 LNL+IL-2 O 36446 LNL+IL-2+抗-CD3O 34548 LNL+Auto+IL-2+抗-CD3O 239850 LNL+IL-2 I 91252 LNL+IL-2+抗-CD3I 321754 LNL+Auto+IL-2+抗-CD3I 9412該結果暗示本發明可用於篩選具腫瘤特異活性的淋巴結。
使用LNL時脾淋巴細胞有同樣的應答，即Ⅰ型脾淋巴細胞響應結腸腫瘤擴增，Ⅲ型脾淋巴細胞不擴增，如參照圖6A和6B以及下文表7所看到的。
表7細胞系培養類型脾類型 CD3每分鐘編號 (ng/ml) 計數56 LNL+IL-2+抗-CD3I 1 42556 LNL+IL-2+抗-CD3I 10 99056 LNL+IL-2+抗-CD3I 50 128556 LNL+IL-2+抗-CD3I 100 183158 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3I 1 426
表7(續)細胞系培養類型脾類型 CD3每分鐘編號 (ng/ml) 計數58 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3I 10 139658 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3I 50 159858 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3I 100 212260 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3I 1 150460 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3I 10 374460 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3I 50 527860 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3I 100 438762 LNL+IL-2+抗-CD3III 1 215.662 LNL+IL-2+抗-CD3III 10 412.362 LNL+IL-2+抗-CD3III 50 435.562 LNL+IL-2+抗-CD3III 100 405.564 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3III 1 19764 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3III 10 34164 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3III 50 34364 Auto+LNL+IL-2+抗-CD3III 100 38566 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3III 1 526.766 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3III 10 502.266 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3III 50 101266 Allo+LNL+IL-2+抗-CD3III 100 1145.22
大多數脾臟顯示出與腫瘤細胞存在相應的探針放射性;但是，由於僅切除了很少幾個脾臟，關於脾淋巴細胞的數據目前還很少。
來自Ⅰ型淋巴結的LNL對自體和異體腫瘤有擴增應答。這些LNL對來自同樣供體如異體結腸癌的異體PBL不進行應答擴增，它們對自體PBL(見圖1)，人膠質神經瘤細胞，或人類癌腫瘤細胞不進行應答擴增，如參照圖7和下文表8可看到的。
表8細胞系類型 腫瘤類型 CPM70 非 123972 自體 749674 Glio 234076 WD124 220878 CAR1 203680 PBL 2002最近研究已證明IL-2和抗-CD3能共同刺激CD4+外周血淋巴細胞的擴增而單獨IL-2不能。Nishimura et al.，「Generation，Propagation，and Targeting of Human CD4+Helper/Killer T Cells Induced by Anti-CD3Monoclonal Antibody Plus Reconbinant IL-2」，見上文。由於Ⅰ型LNL含有多於50%以上的CD4+淋巴細胞，抗-CD3和IL-2的使用可刺激CD4+淋巴細胞以及CD8+淋巴細胞的擴增。於是，CD4+和CD8+淋巴細胞的分離以及對生長因子和腫瘤的擴增響應似乎是令人滿意的。
與在下面實施例Ⅲ中報導的治療步驟相聯繫，在IL-2(20μ/ml)和抗-CD3中培養前和培養後用流式細胞計數器分析淋巴細胞而完成本發明測定的淋巴結的表型分析，獲得下面記錄的結果表9患者淋巴 天數1 天數12～16結類型SMC8-046 CD4 63.2% CD4 68.3%淋巴結 CD8 19% CD8 35.4%CD3 79% CD3 82.1%CD19 11.3% CD19 4.4%RG154 CD4 51% CD4 62.3%淋巴結 CD8 6% CD8 29.4%CD3 61.7% CD3 97.7%CD19 1% CD19 1%JG192 CD4 67.3% CD4 43.5%腸膜淋巴結 CD8 8.9% CD8 41.6%CD3 84.8% CD3 96.9%CD19 3% CD19 1%
表9(續)患者淋巴 天數1 天數12～16結類型JG196 CD4 61.4% CD4 36.2%periportal CD8 8.3% CD8 45.8%LnodeCD3 79.6% CD3 96.3%CD19 3.9% CD19 1%這些結果證明在培養後T細胞群(CD3)增加。這些結果還證明在整個培養期間CD19細胞(B細胞)減少。應該注意到，在其它的研究中通過加入抗-Ⅰ級組織相容性抗體(MHC)以及抗-Ⅱ級HMC抗體可抑制LNL擴增。
在不同的促有絲分裂刺激條件下長期培養淋巴結淋巴細胞，這種擴增相當於使用在前面的數據中報導的抗-CD3。以1×106LNL/mlRPMIc中開始培養1天(其中RPMI 1640培養基補充了HEPES緩衝液，25mM;青黴素，100單位/ml;鏈黴素，0.1mg/ml以及重新鈣化、熱失活的人血漿，10%)。在4天後，將細胞分離開成0.25×106/ml，然後以這種方式繼續傳代。按照說明添加下列物質IL-2，20單位/ml;抗-CD3，50ng/ml;佛波醇，12-肉豆蔻酸鹽，13-乙酸鹽(PMA)，2ng/ml，以及Ionomycin 50ng/ml。記錄指定的添加以及細胞擴增。
表10患者天數 IL-2+抗-CD3擴增倍數 IL-2+PMA+擴增倍數JK196Pperiportal Lnode5 1 1.77 4 10.211 15 8215 16.2 114.8KM098periportal Lnode4 1 16 1.6 68 2.9 3611 12 13013 20.6 223.6其它特徵包括將單獨培養的由患者JG196 LNL＇S樣品分泌的和與自體腫瘤、異源腫瘤或抗-CD3一起培養的患者JG196 LNL＇s樣品分泌的腫瘤壞死因子(TNF)α進行比較。記錄了下列結果並顯示於圖8中。
表11TNFα(pg/ml/106LNL)患者JG196 IL-2+抗-CD3IL-2+PMA+Ionomycin培養細胞(項目82) 培養細胞(項目84)僅LNL 15 15LNL+自體腫瘤 428 305LNL+異體腫瘤 75 75LNL+IL-2+抗-CD380 45這些結果證明在自體腫瘤存在下LNL細胞產生細胞因子。再者，經擴增的LNL細胞產生應答自體腫瘤的細胞因子，從而支持了它們的確是腫瘤活性淋巴細胞的觀點。
實施例Ⅱ後期的實驗程序在包括將上文中提出的方案進行微小變化的本發明的發展過程中進行後期試驗工作。患者的選擇和外科手術基本上相同於上文中描述的起始試驗步驟。再者，待切除並用於細胞擴增的淋巴結的測定包括檢測無肉眼可見腫瘤證據(通過肉眼觀察和觸診)的放射性標記的抗體的存在。這些資料原來是由Triozzi等人，Cancer，Vol.73，No.3，February 1，1994報導的，其全部公開內容引入本文作為參考。
細胞由一位病理學家從解剖開的標本中獲得不需論斷的淋巴結和腫瘤樣品。將每個淋巴結的一半用於組織病理學檢測，另一半用於免疫學研究。在層流罩中無菌條件下解離組織。將組織浸於離心管中的RPMI、抗生素以及抗真菌劑(GIBCO，Grand Island，NY)中，並轉移到冰上的培養皿中。用解剖刀切除外部組織，並將該組織切割為直徑約為2～3mm的小片。用一個5ml注射器的鈍端緩慢地分散而分離開細胞，然後用Hank＇s緩衝鹽溶液洗滌二次。在所有分離步驟中用藍色排除法檢測到細胞的存活性大於80%。利用標準的梯度離心技術，以及Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)的肝素化的外周血，從被研究的患者中分離出外周血淋巴細胞。將所有不必需的細胞立即低溫貯存於加5%自體血清的二甲基亞碸中。
螢光激活的細胞分類器分析用0.5mg的MoAb將在0.1ml培養基中的106細胞在4℃處理1小時。在兩次洗滌後，根據製造商的推薦加入以1/40稀釋的二級發螢光的單抗鼠IgG(Becton Dickinson，Mountain View，CA)。將細胞標記1小時，洗滌兩次後使用細胞螢光體照相術和流式細胞計數器分析。使用下列MoAb's一般性T-細胞(Leu4;抗-CD3)，細胞溶解性/抑制器T-細胞(Leu2a;抗-CD8)，輔助者/誘導物T-細胞(Leu19;抗-CD56)(所有都來自於Becton Dickinson);「真」T-細胞(2H4;抗-CD45RA)以及「記憶」T-細胞(UCHL1;抗-CD45RO)兩者來自AMAC，Westbrook，ME);以及抗-HLA-DR(HB103，ATCC，Rockville，MD)。
細胞溶解活性用100μCi/5×106個細胞/0.5ml和鉻酸鈉在37℃標記腫瘤細胞1小時。將腫瘤細胞(104/100μl)加入到三個重複的6-mm圓底平板中。用天然的殺傷者-抗性Daudi細胞靶作為分析試驗中的陽性對照。向同樣的培養基(100μl)中加入按上面描述產生的效應器細胞以使效應器與靶的比例達到40∶1、20∶1、5∶1和1.5∶1。還包括僅含有標記過的靶細胞和Triton X-100(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)的三個最大稀釋孔，和三個自發稀釋孔。離心該平板(200×g，5分鐘)並在37℃保溫4小時。將該平板再次離心並取出100μl的上清液。用下列通式測定溶解百分數(每分鐘的試驗數[cpm]-自發的cpm)/(總cpm-自發的cpm)。測試三個重複中的各個變量。
擴增分析通過在存在或不存在IL-2的兩種情況下，將105淋巴細胞與含輻射自體和異源腫瘤細胞的BSM(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)以及輻射過的自體正常結腸細胞一起保溫完成擴增分析。培養96小時後，用1mCi[3H]胸腺嘧啶在37℃脈衝標記細胞1小時，並用一個細胞收集器收集。通過閃爍計數測量摻入的放射活性。
統計分析使用配對的和未配對的學生t試驗和Mann-Whitney U試驗測定淋巴細胞群的表型和功能特徵之間差異的顯著性。將使用退化模型的變異分析用於評估擴增速率的差異。
結果淋巴結檢測參與Ⅰ期研究的患有再發和/或結腸直腸癌的20個患者(8個婦女和12個男性)的組織。平均年齡是57歲(範圍33～72歲)。用探針檢測這些患者鑑別出1～11(中值為4)淋巴結，這些淋巴結在檢查和觸診中顯示正常但含有125Ⅰ-標記的CC49。常常這些淋巴結的特徵在於非常高的放射活性(淋巴結與背景數的比值大於10∶1)，並且常在用經典方法檢測時認為是結腸癌的腫瘤排斥區位點如胃肝區、腹腔區和腸骨區中鑑別出這些淋巴結。切除二十五個診斷學上正常的含有放射性標記的MoAb的淋巴結以及六個論斷為正常不含有放射性標記的MoAb的淋巴結(來自五個不同研究患者)用於免疫學研究。
用常規的組織學評估法，即是蘇木精和曙紅(HE)染色法以及利用MoAb AE1-3(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)的免疫組織化學鑑定細胞角蛋白而評估淋巴結中存在的腫瘤。使用經改進的抗生物素蛋白-生物素過氧化酶複合物技術(Vectastain，Vector，Burlingame，CA)鑑別鼠MoAb。通常，發現在用常規的H和E染色法檢測定位的淋巴結中僅存在腫瘤細胞的一或兩個病灶;如果沒有鑑別出腫瘤細胞，免疫組織化學研究表明CC49分布在具有特徵性的新月狀的或環狀樹枝型的胚層中心。通過染色從分離和梯度離心(Ficoll-Hypaque，Pharmacia)後的淋巴結中製備的細胞離心製劑也可調查腫瘤細胞的存在。
將25個診斷為正常但含有放射性標記MoAb的淋巴結劃分為含有「顯微鏡下的腫瘤」或「排出抗原」。將17個劃分為含有顯微鏡下的腫瘤;在所有17個結中進行淋巴結的解離和梯度離心後發現有腫瘤細胞，在其中的14個淋巴結中根據其一半進行病理學檢測的HE染色後也發現有腫瘤。在8個淋巴結中既未根據解離也未根據HE鑑定出腫瘤細胞，將這些淋巴結劃分為含有脫落抗原。在診斷為不含有放射性標記的MoAb的六個正常淋巴結中既未通過解離也未通過HE染色鑑別出腫瘤。
表型將來自用探針鑑定出的淋巴結的淋巴細胞的表型與其它的淋巴細胞群相比較(表9，下文)。研究六個不同的淋巴細胞群(1)含有顯微鏡觀察下腫瘤的淋巴結，(2)含有脫落抗原的淋巴結，(3)帶肉眼可見腫瘤的淋巴結，(4)不相關的淋巴結，(5)TIL;和(6)外周血淋巴細胞(PBL)。利用細胞流式計數器測定剛剛分離的材料的表型特性。在用1000U/ml IL-2培養24小時後測定TIL的表型以促進分離和提高淋巴細胞的產量。
從帶有顯微鏡觀察下腫瘤或脫落抗原的淋巴結的CD4-CD8比例大於其它任何淋巴細胞群(P0.05)。由探針鑑別的淋巴結和帶有肉眼可見的腫瘤的淋巴結具有的CD45RO+細胞數顯著地高於TIL、PBL和未相關淋巴結具有的CD45RO+細胞數(P0.05)。PBL比任何群體和TIL具有顯著高的CD56+細胞數(P0.001)。未檢測到帶顯微鏡觀察下可見腫瘤的淋巴結以及帶脫落抗原之間的表型差異。
表12淋巴細胞群的表型顯微鏡觀察 肉眼可見到的腫瘤 輔抗原 的腫瘤(n=12) (n=8) (n=6)CD3 73±10 71±15 64±16CD4 63±11 59±12 44±15CD8 10±3 10±4 19±7CD4/CD8 6.3±0.9ab5.9±1ab2.3±0.8CD56 4±3 4±3 1±1CD45RA 16±8 17±10 12±10CD45RO 40±13ac38±16ae37±16aeHLA-DR 13±15 28±6 27±13
表12(續)淋巴細胞群的表型腫瘤淋巴細胞 外周血淋巴細胞非相關的 (TIL) (PBL)(n=6) (n=4) (n=9)CD3 72±20 72±16 62±13CD4 50±12 35±6 41±18CD8 21±11 24±18 22±14CD4/CD8 2.4±0.4 1.5±0.5 1.9±0.3CD56 1±1 1±1 14±5acCD45RA 33±14ad18±9 20±14CD45RO 20±9 21±12 29±19HLA-DR 21±15 24±11 20±15＊利用流式細胞計數器分析來自淋巴結的淋巴細胞。所獲得的數據代表陽性細胞平均百分數±標準偏差。
a 顯著差異b P0.001相對於肉眼可見的，非相關的，TIL和PBL。
c P0.001相對於顯微鏡觀察到的，脫落抗原，肉眼可見的，非相關的，以及TIL。
d P0.001相對於顯微鏡觀察到的，脫落抗原，肉眼可見的，TIL和PBL。
e P0.05相對於TIL、PBL和非相關的。
擴增還檢查了對1000U/ml人重組IL-2(重組人，銫，Emeryville，CA)產生應答的各種淋巴細胞群的擴增。所有培養物濃度都為106個細胞/ml，並當融合後將細胞分開(每3～6天)。來自顯微鏡觀察下有腫瘤的淋巴結的淋巴細胞的擴增與來自脫落抗原的淋巴結的淋巴細胞的擴增是類似的;兩者的擴增顯著地大於(P0.05)TIL及帶肉眼可見腫瘤的淋巴結，以及不相關淋巴結的擴增。來自不相關淋巴結的淋巴細胞的擴增顯著地高於(P0.05)帶肉眼可見的腫瘤的淋巴結以及TIL的擴增。通常TIL群發育為CD4+和CD8+的結合物或主要是CD8+的群體。所有淋巴結淋巴細胞群發育為CD4+群佔優勢的CD4+和CD8+的群體。似乎CD8+細胞的出現與培養物擴增的降低以及TIL培養物擴增的增加相關。
增殖我們首先將來自由Neoprobe 1000探針鑑定的淋巴結的淋巴結淋巴細胞的增殖應答與來自不相關淋巴結(來自相同患者)的淋巴結淋巴細胞的增殖應答。將淋巴細胞(105/孔)與經照射(5000R)的自體和異源腫瘤細胞(0～50，000/孔)在有或沒有10U/ml的IL-2存在下共培養5天。還將淋巴細胞置於作為可溶性TAG-72源的表達CC49結合抗原決定基的各種濃度的BSM中。在收集前18小時加入[3H]胸腺嘧啶。在存在和不存在IL-2的情況下自體腫瘤(50，000個細胞)誘導用探針(n＝來自16個不同患者的19個淋巴結)鑑別的所有淋巴結的顯著增殖(攝取的[3H]胸腺嘧啶cpm大於未刺激細胞的三個標準偏差。在任何研究中自體正常結腸細胞和PBL不誘導增殖。來自帶有顯微鏡觀察下帶腫瘤的淋巴結的淋巴細胞的激增應答在存在和不存在IL-2(P0.01)情況下都大於來自非相關淋巴結的淋巴細胞對自體和對異源TAG-72+結腸腫瘤標本的擴增應答。與來自非相關淋巴結的淋巴細胞相反，將來自淋巴結的淋巴細胞暴露於以劑量-應答方式應答BSM而進行增殖的顯微鏡觀察下可見的腫瘤。為了對在擴增應答中CC49可能有的作用以及其結合抗原決定基進行定性，在未添加或存在BSM(100μg/ml)、CC49(0.1μg/ml)以及BSM+CC49情況下，將來自暴露於顯微鏡觀察下存在的腫瘤中的淋巴結的淋巴細胞在10U/ml的IL-2中培養。單獨的CC49不加強增殖，並且CC49與BSM結合後不取消由單獨BSM誘導的增殖。
通過比較其對TAG-72+和對TAG-72-腫瘤細胞的激增應答而進一步檢測由探針鑑別的淋巴結的淋巴細胞的激增應答。評估下列細胞衍生的患者自體和異源TAG-72+(即CC49+)結腸癌細胞，包括來自患有pseudomyxoma peritonaei的患者的豐富的TAG-72+細胞;患者衍生的TAG-72+胸腺細胞;患者衍生的TAG-72-鱗片狀的細胞肛門直腸癌，TAG-72-黑素瘤，以及TAG-72-結腸直腸癌，TAG-淋巴母細胞樣Daudi細胞;以及LS174T細胞(ATCC)，一種在體內而不在體外表達TAG-72的結腸癌細胞。來自帶有顯微鏡觀察下腫瘤的淋巴結的淋巴細胞激增所有的TAG-72+腫瘤;帶有顯微鏡觀察下腫瘤的淋巴結對患者衍生的TAG+腫瘤細胞的激增大於對TAG-72-細胞的激增(P＝0.0001)。這些數據列於下面表13中。
表13對腫瘤細胞＊的激增反應無促有絲分裂劑 IL-2無腫瘤細胞 444±185 5476±1800TAG-72*腫瘤細胞自體結腸 1428±600 10,495±1435異源結腸 1755±531 9313±1764粘蛋白結腸**5203±1866 13,376±2719乳腺(Breast) 2571±1519 10,302±3277Tag-72腫瘤細胞結腸 884±625 7621±1319直腸 584±268 7410±152Daudi 712±217 8066±3173LS174T 124±86 798±282＊用50，000輻射過的腫瘤細胞±U/ml的IL-2刺激來自用探針鑑別的淋巴結的淋巴細胞4天。數據代表來自4個不同患者的淋巴結的平均增殖數CPM±標準偏差。在存在和不存在促有絲分裂劑的情況下，淋巴細胞對TAG-72+的激增相對於對TAG-72-腫瘤的激增的差異是顯著的P＝0.0001。
＊＊粘蛋白結腸來自患有pseudomyxoma peritonea的患者的豐富的TAG-72+細胞人工培養的LS174T細胞抑制增殖應答，表明在該移植細胞系中可能存在腫瘤衍生的抑制因子。使用冷凍的LS174T細胞作為靶並不誘導抑制。
細胞溶解活性在這些試驗中，將分離開的淋巴結和腫瘤以及PBL群與1000U/ml的IL-2一起培養直到35天。所有培養開始濃度為106個細胞/ml，並且在融合時進行離解。在培養4～7天後以及21～28天後進行標準4小時51Cr-釋放分析評估經擴增的淋巴細胞的細胞溶解活性。將以前冷凍的自體腫瘤、異源腫瘤以及天然殺傷者抗性的Daudi細胞用作靶。在所有的異源分析中使用來自兩患者之一的TAG-72抑制的腫瘤細胞;來自這兩個患者的細胞對由健康的志患者產生的淋巴因子激活的殺傷劑敏感性相同(±10%)。這些數據列於下面表14中。
表14淋巴細胞群a的細胞溶解活性顯微鏡觀察 肉眼可見到的腫瘤 脫落抗原 的腫瘤天數 (n=7) (n=6) (n=7)自體的 4-7 21±8bc18±6bc11±621-28 2±2 5±3 3±3異源的 4-7 24±8bc19±6bc9±421-28 3±4 4±3 2±2Daudi 4-7 34±14bc38±11bc15±721-28 4±6 3±3 3±2
表14(續)淋巴細胞群a的細胞溶解活性腫瘤淋巴細胞 外周血淋巴細胞非相關的 (TIL) (PBL)(n=6) (n=4) (n=7)自體的 9±5 4±4 39±18bd2±1 6±4 6±4異源的 8±5 3±4 51±28bd3±2 4±2 5±4Daudi 10±7 4±2 73±21bd2±3 5±3 3±2a 來自淋巴結的淋巴細胞與1000U/ml的IL-2培養，測定相對於患者衍生的自體和異源TAG-72-腫瘤細胞相對於TAG-72-，天然殺傷抗性，Daudi細胞的細胞裂解活性。在培養4～7天後以及在培養21～28天後測定細胞溶解活性。數據表示在效應劑與靶比例為40∶1時的平均裂解百分數±標準偏差。
b 顯著不同。
c P0.05相對於肉眼可見的，非相關的，以及TIL。
d P0.001相對於顯微鏡下可見的和脫落抗原以及0.0001相對於肉眼可見的，非相關的和TIL。
從PBL產生最高活性的細胞溶解活性。帶有顯微鏡下觀察的腫瘤的淋巴結的細胞溶解活性與脫落抗原的淋巴結的細胞溶解活性相當。儘管小於由PBL產生的細胞溶解活性，從這些淋巴結產生的細胞溶解活性一貫大於從TIL產生的和從通過肉眼觀察為相關和非相關的淋巴結產生的活性。在任何時候都未觀察到自體腫瘤的特定殺傷作用。在所有培養物中細胞溶解活性隨時間而降低。
討論通過在體內定位腫瘤-反應性淋巴細胞而建立的一種技術。通過鑑定帶有顯微鏡觀察下腫瘤和/或脫落抗原的淋巴結，體內使用放射性標記的MoAb以及γ-檢測探針可再現性地定位有抗自體腫瘤反應性的淋巴結淋巴細胞。淋巴結對腫瘤的應答效果是變化的。它們是結腸直腸癌中轉移的第一個位點並且在宿主-腫瘤相互作用中起著重要的作用。利用包括相關的引流淋巴結的簡單外科手術，許多患有轉移到淋巴結的結腸直腸癌的患者已生存很長時間。本發明結果支持在患有結腸直腸癌的患者的淋巴結中，甚至在遠離原發腫瘤的淋巴結中都存在對顯微鏡觀察下腫瘤的免疫應答的觀點。我們的結果證實與肉眼可見的腫瘤的淋巴細胞的微弱的免疫應答性以及TIL的微弱應答性。當與來自帶有顯微鏡觀察下可見的腫瘤和脫落抗原的淋巴結產生的淋巴細胞相比較時，來自帶有肉眼可見腫瘤的淋巴結，TIL和非相關淋巴結的淋巴細胞功能上顯示有抑制。在幾種功能研究中包括細胞溶解活性，激增應答以及擴增，證實顯示出差異。
鼠MoAb對觀察到的免疫應答的作用是未知的。使用體內放射性標記的MoAb檢測到的定位於患有再發性和/或轉移疾病的患者整個腹腔內的淋巴結的免疫組織學特徵相同於在Mariani-Costantini等人，「Immunohistochemical Evidence of Immune Response to Tumor-Associated Antigens in Lymph Nodes of Colon Carcinoma Patients」，Cancer，1991;67∶2880-66的免疫組織學研究中報導的特徵。這些研究者使用(體外)各種抗TAG-72的MoAb，包括CC49以及抗淋巴細胞和抗針對來自患有原發性結腸直腸癌的患者的非相關性局部淋巴結切片的單核細胞/巨噬細胞抗原決定簇的MoAb。他們還解釋了在初期中央的免疫組織化學反應，並且總結出脫落的TAG-72抗原決定基被選擇性地識別和被提供給初期中央B-細胞。
除了來自體內不接收MoAb的患者的淋巴結的免疫組織化學研究，其它研究結果暗示MoAb CC49不是免疫應答中心。單獨MoAb CC49不刺激由該探針鑑別的淋巴結淋巴細胞的體內增殖。使用該技術在檢測到人抗鼠MoAb抗體的患者以及未檢測到人抗鼠MoAb抗體的患者中檢識出與自體腫瘤反應的淋巴結淋巴細胞。再者，淋巴結單獨定位以及帶有肉眼可見的腫瘤和TIL的淋巴結也含有MoAb也證明與所觀察到的免疫學變化僅是對抗鼠MoAb的二次應答的可能性相反。
用探針鑑定的淋巴結特徵在於CD4∶CD8比例增加。CD4+細胞的腦脊液細胞異常增多是炎症反應的重要的早期症狀。已對癌症患者，包括結腸直腸癌患者的淋巴細胞表型進行了廣泛的研究;從各個研究組獲得的結果都不相一致。大多數的調查工作，包括本發明的調查已發現TIL的CD4∶CD8比例遠遠低於通常在PBL和在非相關淋巴結中觀察到的2∶1比例。其它的調查者也已觀察到在患有結腸直腸癌患者的淋巴結中CD4+細胞數的增加。Adachi等人報導在患有結腸直腸癌患者的淋巴結中CD4+細胞顯著增加。Adachi等人報導與中間產物結(即動脈幹中的那些結)相比和與來自膽囊切除術步驟中的結相比沒有腫瘤的結腸結中CD4+細胞顯著增加。Adachi等人「Immune Competent Cells of Regional Lymph Nodes in Colorectal Cancer PatientsI.Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Subpopulation」，J.Surg.Oncol.，1991;46∶110-6。
用探針鑑別的淋巴結始終顯示對TAG-72+腫瘤細胞和對可溶性粘蛋白的激增應答，暗示存在前敏化作用。雖然對TAG-72-腫瘤的激增應答低於對TAG-72+腫瘤的激增應答，但激增反應的特異性以及是否TAG-72/腫瘤相關的粘蛋白是關鍵的均無定論。向激增分析中加入結合到碳水化合物抗原決定基上的CC49 MoAb並不阻礙應答。
沒有觀察到由任何淋巴細胞群優先殺死自體腫瘤。更確切地說，在所有研究中平行地出現抗Daudi細胞，異源腫瘤和自體腫瘤的細胞裂解活性。現在的發現可能是所使用的IL-2濃度(1000U/ml)的後果;大多數僅用IL-2培養的TIL並不顯示最大的組織相容性限制的細胞毒性，而是證明非特異的細胞毒性。在非主要的組織相容性限制的形式中識別粘蛋白的細胞毒性，T細胞顯示出致死作用。已假定粘蛋白的多價特性允許多樣的T細胞受體的有效的，同時的接合，因此排除了對抗原-受體複合物的主要的組織相容性限制的穩定作用的需要。細胞毒性和擴增研究的結果與非主要組織相容性限制的相互作用相一致。由探針鑑別的淋巴結的細胞溶解活性大於其它的淋巴結但小於PBL。前面研究的淋巴細胞的細胞毒性的結果有分歧。一些研究已得出結論，相關的和非相關的淋巴結淋巴細胞以及TIL的非特異細胞溶解活性是低於PBL的溶解活性。其它人已報導從淋巴結和TIL中產生的非特異性致死作用相當於或大於相應的PBL的致死作用。
未檢測到淋巴細胞表型和帶有顯微鏡觀察下腫瘤的淋巴結和脫落抗原的淋巴結之間的功能有差異。由於患有結腸直腸癌的患者的局部淋巴結潛在地受各種各樣的微生物和化學抗原的影響，並且是腫瘤誘導的正常障礙互解的結果，因而常弄不清楚是否在結腸直腸瘤的局部淋巴結中觀察到的免疫學變化是腫瘤的或其它腸衍生的第二級刺激的結果。在來源於原發腫瘤和來源於結腸本身的淋巴結中觀察到免疫學變化的事實暗示應答是對腫瘤產生的而不是對第二級腸衍生的刺激產生的。
實施例Ⅲ進一步的試驗操作按上面報導的方式完成患者外科手術，淋巴結檢測和切除。上述分析產生了下面所述的另外的後期試驗結果。
細胞培養在75cm2組織培養瓶(Falcon Co.)中以106個細胞/ml的起始濃度在各種條件下將淋巴細胞懸液培養於添加了10%熱失活的人血漿、青黴素和L-穀氨醯胺(GIBCO，Grand Island，NY)的RPMI 1640中。培養是在37℃，無菌條件下於5.0%CO2的溼潤組織培養箱(Forma Scientific)中完成的。在4天時通過向限制性培養基中加入新鮮培養基而將細胞培養物分離開至密度為2.5×105個細胞/ml，並且在第7天時將細胞分離到密度為5.0×106。採用Coulter計數器測定細胞數，並採用藍色排除法檢測存活性。使用下列的生物學應答修飾因子完成培養IL-1(Immunex，Seattle WA)，IL-2(Cetus Corp.，Emeryville，CA)IL-4(Amgen，Thousand Oaks，CA)，幹擾素-(IFN-γ)γ(Biogen，Cambridge，MA)，OKT3抗-CD3抗體(Ortho，Raritan，NJ)，消炎痛(indomethacin)和甲氰咪胺。
表型分析用單克隆抗體和FACS測定淋巴細胞表型。將新鮮LNLs和人工培養的淋巴細胞以每50μl的含有10% FCS(FACS培養基)的Han-k＇s平衡鹽溶解(HBSS)中106個細胞的濃度置入V形96孔平板(Linbro Co.)上。將細胞0.2μg/20μl的鼠單抗(Beeton-Dickinson)在4℃保溫1小時。以600rpm轉速離心微滴板，並旋轉沉澱和用150μlFACS重複洗滌三次。旋轉細胞沉澱並在4℃將沉澱重新懸於螢光素結合的單抗-鼠單克隆抗體(Beeton-Dickinson)1小時。離心FITC染色的細胞並用FACS培養基洗滌三次，重新懸於加有1%福馬林的0.5ml FACS中並置於4℃直到分析時使用。所使用的抗體針對抗原決定基CD3(T-細胞受體)，CD4(T-輔助細胞/誘導劑)，CD8(T-細胞毒性/抑制劑)，CD25(Tac/IL-2受體)，CD45RA(真的)，CD45RO(記憶)，CD56(NK/LAK)，CD19(B細胞)，CD14(單核細胞/巨噬細胞)和螢光素結合的單抗-鼠IgG。
淋巴細胞細胞毒性利用標準的51Cr釋放4小時分析評估培養的淋巴細胞的細胞毒性。將自體結腸癌的腫瘤細胞靶和NK-抗性Daudi細胞系與鉻酸鈉51Cr100μCi/5×106個細胞/0.5ml一起在37℃保溫1小時。用104腫瘤靶以100μl/孔的濃度在96孔微滴板中完成細胞毒性分析。加入100μl的效應細胞以達到效應器靶(E∶T)的比例為1.5∶1、5∶1、20∶1和40∶1。向標記的腫瘤靶中加入Triton X-100以進行完全釋放試驗;在每一個分析試驗中都既用完全釋放又用自發釋放樣品作為對照。在37℃和5%CO2中保溫平板4小時，然後收集。在保溫時期完成後，小心地吸出10μl的無細胞上清液，並計數。由通式(試驗cpm-自發cpm)/(總cpm-自發cpm)計算細胞毒性百分數。
淋巴增殖分析通過3H-胸腺嘧啶摻入法測定淋巴細胞的增殖應答。在96孔微滴板中以每孔0.2ml完全培養基中105個細胞的濃度培養淋巴細胞。用膠原酶消化自體腫瘤，洗滌並用3000拉德(銫源)輻射，然後以應答者刺激器比例為2∶1將它與淋巴細胞一起保溫。將淋巴細胞保溫96小時，並用10μCi/孔3H-胸腺嘧啶(New England Nuclear)脈衝最後的12小時。用Skatron Ph.D.(Cambridge Technology)技術將平板收集到尼龍濾膜上並在Beckman 6500γ計數器的閃爍夾層中計數。
IL-2製備分析利用IL-2依賴性CTLL細胞檢測淋巴細胞擴增前和擴增後產生的IL-2。簡而言之，將1×105淋巴細胞在96孔微滴板上與生物學應答調節物一起保溫過夜後，從每個孔中吸出10μl的上清液並轉移到另一個平板上。以2×103個細胞/孔的密度向平板中加入CTLL細胞，並在6小時後用1μCi/孔的3H-胸腺嘧啶脈衝。在12小時時收集平板並按前面描述計數。以達到標準濃度的IL-2時CTLL吸收的3H-胸腺嘧啶的cpm作為陽性對照。
細胞因子mRNA分析利用按Morgan等人「Detection of Cytokine mRNA in Vivoby PCRProblems and Solutions」，Transplantation，56∶2∶437(1993)描述的聚合酶鏈反應(PCR)進行逆轉錄和擴增而分析細胞因子mRNA。通過在異硫氰酸胍緩衝液(4M異硫氰酸胍，25mM檸檬酸鈉pH7.0，0.5%，肌氨酸(Sarkosyl)鈉，0.7%β-巰基乙醇)中勻漿化並在5.7M CsCl墊上超離心來提取總RNA。利用寡聚(dT)引物和200U MMLV逆轉錄酶從5μg RNA製備cDNA。用無菌水將樣品稀釋到終體積為150μl用於PCR。用標準技術在Perkin-Elmer或Thermolyne Temptronic熱循環儀中完成PCR擴增。將cDNA(5μl)在含有10mM Tris-Cl，pH8.3，50mM Kcl，1.5mM MgCl2，0.2mM dNTPs，0.4μM引物，和1.25U Taq聚合酶的50μl反應中擴增cDNA(5μl)。循環參數94℃，1分鐘;50℃～60℃，2分鐘;72℃，1分鐘;循環40次。通過在2%瓊脂糖上電泳並用溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓染色。用於IL-2、IL-4、IL-5的PCR引物、腫瘤壞死因子(TNF)-β、β-肌動蛋白和幹擾素(IFN)-γ是來自於Brenner等人「Message Amplification PhenotypingATechnique to Simultaneously Measure Multiple mRNAs from Small Numbers of Cells」，Biotechniques，7∶1096(1989)，並用Oligos，Etc，(Wilsonville，OR)分析。
統計分析使用方差分析(ANOVA)比較在擴增和IL-2產生分析試驗中各處理組之間的差異;使用非參數分析評估擴增指數。
結果擴增用CC49單克隆抗體定位根據＇840專利描述進行了外科手術的30個患者的淋巴結。利用各種各樣生物學應答調節劑體外擴增。在進行短期擴增(21天)後的擴增參數(即總淋巴細胞數增加倍數)顯示於表15中。
表15RIGS-定位的淋巴結的擴增參數以1×106個細胞/ml的濃度培養LNLs並在培養4天和10天時將細胞分離開以便達到最大增殖。數據代表淋巴結淋巴細胞的擴增參數(倍數增加)的平均值±S.D.。用Ⅰ-2/抗-CD3培養RIGS-定位的LNLs導致與Ⅰ-2和IL-1/IL-2相比增加倍數顯著地提高(P0.00001)。
天數6 天數10 天數14 天數21IL-2 1000 U 0.94±0.2 2.52±0.8 7.84±3.8 32.5±12IL-1/IL-2 1.27±0.3 3.6±1.0 13.6±8.2 41.3±18IL-2/抗-CD32.88±1.8 36.0±13 88.6±21 173±115RIGS定位的LNL在與IL-2 100U/ml和IL-1 200U/ml+IL-2 100U/m培養時大約擴增40倍。用I-2 100U/ml和抗-CD3MAb培養的淋巴結群顯示比僅用IL-2培養時其擴增顯著地增高(P＜0.00001)。向含有IL-2的培養物中加入IL-4(100～1000U/ml)，幹擾素-γ(100～1000U/ml)，甲腈咪胍(100μg/ml)，或消炎痛(100μg/ml)在任何時間點都不顯著地改變擴增或表型。
在各個時間期間進行表型分析，以鑑別淋巴細胞的哪一個群體應答這些培養條件而生長。
表16培養的淋巴結淋巴細胞的表型用IL-2 1000U/ml，IL-1 200 U/ml和IL-2 100 U/ml，或IL-2 100 U/ml以及抗-CD30.1g/ml擴增的RIGS定位的LNLs的表型。結果表示根據FACS染色顯示陽性的細胞的平均百分數±SD(n＝6患者)。
CD4 CD8 CD100天 10天 0天 10天 0天 10天IL-2 74±5.2 36±2.4 14±4 29±12 7±4 29±5IL-1/IL-2 74±5.2 44±7.9 14±4 33±13 7±4 23±7IL-2/抗-CD374±5.2 76±10 14±4 15±10 7±4 7.7±5在0天時由RIGS定位的新鮮LNLs的表型顯示CD4/CD8的比例為大約5∶1。在10天時在IL-2/抗-CD3細胞中維持CD4+主要表型，而在IL-2和IL-1/IL-2中培養的LNL在第10天時趨向於產生CD8+和CD56+表型。表13提供了來自五個患者的在IL-2/抗-CD3中擴增的LNL的特性。
表17用IL-2/抗-CD3培養的RIGS定位的LNLs的表型在IL-2 100 U/ml和抗-CD3抗體0.1μg/ml時在各個時期培養的RIGS定位的淋巴結的表型。數據表示陽性染色細胞百分數的平均值±S.D.(n＝5個患者)。
4天 7天 10天 14天 21天CD3 70±16 85±19 83±18 89±11 88±13CD4 64±17 74±13 79±21 78±14 66±12CD8 9±5 16±9 19±4 23±5 34±9CD56 4±3 6±4 5±4 3±4 2±2CD45RA 13±5 4±6 13±8 11±9 13±6CD45RO 42±11 74±12 51±13 78±10 80±8HLA-DR 28±7 64±12 61±11 83±11 87±5在培養期的早期(＜12天)，維持腦脊液(淋巴)細胞增多，這種狀況與在10天時大約有40倍擴增。當培養期延長到14天時，產生CD8+細胞並且CD4∶CD8細胞比例降低。在整個培養期間可觀察到CD45RO+(記憶)增加，並且HLA-DR表達增加，暗示活化。在10天後與B細胞(CD19)和單核細胞(Leu-M3)相關聯的表型低於所有測試培養物的5%。
細胞毒性為了評估是否這些培養條件導致細胞溶解的淋巴細胞的過度生長，體外檢測細胞毒性。在7天前觀察抗自體結腸腫瘤細胞的細胞毒性，隨後在培養10天後這種毒性減至無意義水平。沒有一種測試的培養條件導致細胞溶解T細胞的長期過度生長。在整個培養期間抗NK-抗性Daudi細胞的細胞毒性顯示相似的動力學，暗示在培養期的早期的細胞毒性與淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)活性有關。
經擴增的LNL的激增應答為了評估經擴增的細胞的激增能力，在自體腫瘤以及含有CC49抗原決定基的牛頜下腺粘蛋白(BSM)存在下在10天時檢測在IL-2/抗-CD3中培養的LNL。記錄了下列數據。
表18試驗1 試驗2分裂素 應答(cpm) 應答(cpm)未處理 777±226 901±223IL-2 17337±3507 19283±3199IL-2+腫瘤 28527±3969 30962±4412IL-1+BSM 25585±4941 30034±1130這些結果暗示IL-2/抗-CD3擴增的細胞保留了應答可溶性粘蛋白以及自體腫瘤而激增的能力。
IL-2產生為了評估擴增的細胞分泌細胞因子的能力，評估在IL-2和抗-CD3抗體擴增的探針定位的LNL(＇840專利方法)，在0天(擴增前)和10天(擴增後)時產生的IL-2。
表19IL-2/抗-CD3擴增的LNL產生的IL-2將擴增的細胞單獨培養(NT)或與PMA 10 ng/ml一起培養12小時。通過將CTLL3H-胸腺嘧啶摻入其中而檢測上清液中產生的IL-2。結果表示4個重複測定的平均值±S.D.。與所有三個試驗(P0.0001)中0天時相比，PMA刺激的經過10天培養的淋巴細胞產生的IL-2顯著增高。
試驗1 試驗2 試驗3NT PMA NT PMA NT PMA0天 1549± 4187± 1039± 3626± 1522± 10648123 416 145 1072 428 ±74210天 3776± 16919± 1796± 15459 4997± 2101360 2136 472 ±739 258 ±1307用IL-2和抗-CD3培養10天的LNLs保留了向體外分泌IL-2的能力。儘管基線值反應患者存活性，但用佛波醇酯(PMA 10ng/ml)刺激的擴增細胞與0天相比導致IL-2產生顯著增加(P＝0.0001)。
細胞因子mRNA的表達利用RT-PCR進行LNLs的細胞因子mRNA分析以證實經擴增的效應產生細胞因子的潛力。圖9顯示在IL-2/抗-CD3中經擴增10天的LNLs的細胞因子mRNA的表達。該培養的細胞群表達各種各樣的mRNAs如IL-2、IL-4、IL-5、IFNγ以及TNF-β，一種混合的Th1和Th2群體的暗示形式。
討論選定的細胞治療法已證明在臨床試驗中有希望治療幾種癌症。就絕大部分而言還能抗結腸直腸癌。涉及到細胞來源，體外活化方法，以及體內抗腫瘤活性的機理是引起爭論的問題。儘管還沒有確定在選定的細胞治療中使用的效應細胞的特性，但是最近的證據表明選定的轉化細胞的體內效果與分泌細胞因子的能力的相關性比與體外細胞毒性的相關性更大。Barth等人，「Interferon γ and tumor Necrosis Factor Have a Role in Tumor Regression Mediated by Murine CD8+Tumor-Infiltrating Lymphocytes」，J.Exp.Med.，173∶647(1991)。本發明的工作包括調查使用TAG-72-特異性CC49單克隆抗體擴增淋巴結的效應細胞的方法，這種淋巴結在體內反抗患有結腸直腸癌的患者的顯微鏡觀察到的腫瘤以及脫落腫瘤粘蛋白。
在試圖避免對腫瘤分泌的因子的次級抑制的方案中，使用＇840專利系統以鑑別遠離診斷為含有隱性的、顯微鏡可觀察到的腫瘤以及脫落TAG-72的淋巴結。上面提供的資料證明根據＇840號專利定位的淋巴結是CD4+細胞的好來源，該CD4+細胞已在體內經受對微小的轉移性腫瘤和脫落腫瘤抗原產生應答而激活。這些經過定位的淋巴細胞其特徵在於CD4+腦脊液細胞增多，並且相對於主要是「真的」CD45RA+的非相關LNLs而言，它含有高百分數的CD45RO+「記憶」細胞。帶有顯微鏡下觀察到的腫瘤和脫落抗原的LNLs對分裂素的體外激增應答比外周血淋巴細胞、TILs、非相關的淋巴結或帶有肉眼可見的腫瘤的結顯著增高並且更專一。
幾種方法的證據始終與這些淋巴結對TAG-72抗原的抗原-特異性加工相一致。通過將患有結腸直腸癌的以前未收到抗體的患者的無腫瘤淋巴結的胚中央進行免疫組織化學染色;以及對有抗-CEA抗體的這些淋巴結的染色的免疫組織化學研究沒有證明同樣類型的抗原加工過程。另外，這些淋巴結淋巴細胞對可溶性粘蛋白TAG-72的體外應答激增表明它們在體內已對TAG-72敏感，對可溶性CEA的同樣應答沒有看到。
可能是由於限制的培養間隔以及培養條件的緣故，所測試的培養方法沒有引出腫瘤-特異性CTL產生的證據。由Finn及其同事們將胰癌患者的引流腫瘤的淋巴結與IL-2一起培養並用腫瘤細胞重複刺激。Finn關於「Pancreatic Tumor AntigensDiagnostic Markets and Targets for Immunotherapy」，PP.16-17一章，在DeVita等人，Important Advances in Oncology，J.B.Lippincott，Philadelphia，PA(1992);以及Jerome等人，「Cytotoxic T-Lymphocytes Derived from Patients with Breast Adenocarcinoma Recognize an Epitope Present on the Protein Core of a Mucin Molecule Preferentially Expressed by Malignant Cells」，Cancer Res.，51∶2908-2916，1991;and Brand，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(上文)上公開。由於在＇840專利定位的淋巴結淋巴細胞的培養物中CD4+細胞佔優勢，因而抗腫瘤靶的直接細胞毒性一般來說是低的也不令人吃驚。由＇840系統檢測出的LNLs是否按Finn等人觀察到的非MHC限制的方式識別粘蛋白核心蛋白抗原現在仍在調查中。
已在幾個動物模型中證明非細胞溶解的，分泌細胞因子的T細胞的選定的轉移促進了擴散性癌的完全根除。Kahn等人「CD4 Cell Clones Specific for the Human P97Melanoma-Associated Antigen Can Eradicate Pulmonary Metastases from Murine Tumor Expressing the P97Antigen」，J.Immunal.，146∶3225(1991);和Forni等人，「Helper Strategy in tumor ImmunologyExpansion of Helper Lymphocytes and Utilization of Helper Lymphokines for Experimental and Clinical Immumotherapy」，Can.Metast.Rev.，7∶289(1988)。已證明分泌許多細胞因子的T細胞激活各種各樣的宿主效應器機構，包括CTL，多形態核細胞和殺癌細胞巨噬細胞。細胞因子mRNA的IL-2、IL-4、TNF-β和IFN-γ存在於IL-2/抗-CD3擴增細胞中暗示一種包括細胞和體液的免疫應答的混合的Th1和Th2表型。觀察到在擴增後由這些＇840專利定位的LNLs顯著地產生IL-2，暗示它們在體內作為T-輔助細胞起作用。在幾個試驗動物模型中已觀察到可控制腫瘤的演化和減輕，在這幾個模型中通過將基因轉染的腫瘤細胞，可能藉助補充效應宿主而連續地產生低含量的IL-2和IL-4。Golumberk等人，「Treatment of Established Renal Cancer by Tumor Cells Engineered to Secrete Interleukin-4」，Science，254∶713(1991)。
使用放射性標記的單克隆抗體分泌體內反抗一種特異性腫瘤相關的粘蛋白的LNL為患有晚期結腸直腸癌患者的選定的細胞免疫治療提供了獨特機會。由於每一個＇840專利定位的淋巴結含有大約5×108細胞，以每一個類群為基礎，在試驗動物模型中將有效的細胞數目擴增20倍。
為了證明本發明公開的新治療劑的減輕腫瘤的能力，提供下列數據。這些數據是本發明的圖表，並不構成對本發明的限制。
實施例Ⅳ治療方案結腸直腸癌的研究在該結腸直腸癌研究中已收集了二十七個患者。按上文描述以及在＇840號專利中公開的內容每個患者接收125I CC49單克隆抗體，之後間隔一定的時間。然後給每個患者進行外科手術。測定出其中三個患者完全是可切除的，因而從該研究中排除出。測定出留下的24個患者患有不可切除的疾病。測定出淋巴結，並移出。將通過肉眼觀察檢測測定出那些不含有腫瘤的淋巴結，以上文中描述的方式進行擴增。隨機分配這些患者使之僅接收細胞(無IL-2)或施用細胞加IL-2。記錄下列資料
表20患者年齡/ RIGS 細胞 IL-2 最好*評價編號性別日期 (1010) 應答1 54/M 11/20/92 1.4 - SD 93年4月開始化療93年5月觀察到部分應答2 55/F 12/10/92 4.0 - PD 進行性疾病:在治療前負擔了大腫瘤(肝塊17×15cm)3 37/F 1/8/93 2.4 - CD 腫瘤繼續減輕,腫瘤是5×5cm,現在2cm並大量骨化(11/93)4 69/F 1/29/93 3.3 + MR 在1個月後,肝轉移降低20%。從93年4月28日開始演化。
部分應答的化療開始於93年5月表20(續)患者年齡/ RIGS 細胞 IL-2 最好*評價編號性別日期 (1010) 應答5 37/M 2/18/93 4.3 + SD CA-125從133(4/93)降至62(6/93)。CEA是在正常限值(11/93)內6 46/M 3/5/93 7.3 + SD 從93年6月14日開始轉移到肺7 50/M 3/26/93 NA NA NA 完全切除-終止研究8 70/M 4/9/93 4.3 + SD 93年9月8日開始演化9 54/M 4/23/93 4.3 + PR 未觀察到盲腸,損傷6×6cm(93年7月)10 36/M 6/18/93 3.2 - PD 由腫瘤取代70%肝臟(演化從93年8月25日)
表20(續)患者年齡/ RIGS 細胞 IL-2 最好*評價編號性別日期 (1010) 應答11 70/F 7/2/93 3.2 + SD 從93年10月6日開始演化12 23/M 7/9/93 1.7 + PD 93年9月2日終止13 47/M 7/23/93 0.6 - PD 在治療前負擔大批腫瘤(11cm×12cm肝損壞)新損傷8/1/93終止12/24/9314 53/M 7/30/93 0.4 - SD 在93年9月15日演化從9/15到11/17穩定15 58/F 8/27/93 NA NA NA 完全切除-終止研究16 55/M 9/3/93 2.3 - SD 完成研究17 68/F 9/24/93 1.1 - SD 完成研究表20(續)患者年齡/ RIGS 細胞 IL-2 最好*評價編號性別日期 (1010) 應答18 66/M 10/8/93 5.4 + SD 二月後疾病穩定19 65/M 11/19/93 2.5 + SD 二月後疾病穩定20 63/M NA NA NA NA 完全切除-終止研究21 56/M 2/25/94 N/A + PD 所有損傷增加無新的LFT's穩定22 52/M 3/11/94 N/A + SD23 59/F 4/15/94 0.49 - N/A24 46/M 4/22/94 0.16 - N/A25 50/M 5/6/94 N/A - N/A26 64/F 5/13/94 N/A - N/A
表20患者年齡/ RIGS 細胞 IL-2 最好*評價編號性別日期 (1010) 應答27 59/M 5/27/94 N/A - N/A＊CR＝完全應答;PR＝部分應答;MR＝微小應答SD＝穩定疾病;PD＝演化疾病;NA＝不適用臨床應答有兩個患者(編號3和4)已顯示在有和無IL-2情況下有減輕腫瘤的跡象。然後對這些患者重複掃描評價腫瘤應答，作出本研究的補充部分。
毒性本治療有很好的耐藥力。伴隨細胞輸注沒有併發症。在細胞輸注後大約1小時所有患者開始發燒和發冷。用藥劑很容易控制這些症狀。在接收了外源IL-2的患者中已觀察到肝酶的無症狀的和暫時的提高。
免疫效果已收集到大量的免疫學數據包括表面表型，細胞因子mRNA表達，以及經擴增細胞的細胞毒性;對自體腫瘤的DTH應答(皮膚試驗);外周血淋巴細胞毒性;外周血細胞表型;血清細胞因子;以及111In-標記細胞的細胞輸送研究(患者5號)。由於收集太早沒有獲得決定性結果。
上述數據清楚地證明來自於富含CD4+淋巴細胞中的經確定的淋巴結的治療劑的效果。基於在患者4中觀察到的應答，將已接收了本發明治療劑的患者給予佐劑化學治療可能是對患者特別有益，甚至在接收本發明中公開的本發明的選定的細胞治療處理前將已重鈣化的患者進行化療。根據涉及將佐劑化療施用給合適階段的患者的國家健康機構(NIH)的一致報告這一點特別重要。「NIH Consensus ConferenceAdjuvant Therapy for Patients with Colon and Rectal Cancer」，JAMA，1990;264∶1444-50。
Buroker等人「Randomized Comparison of Two Schedules of Fluorouracil and Leucovorin in the Treatment of Advanced Colorectal Cancer」，J.Clin.Oncol.，Vol.12，No.1，pp14-20(January 1994)，報導了接收兩種不同給藥方式的5FU/甲醯四氫葉酸的372個患者存活9.3和10.7個月(中數)。而Stangl等人「Factors Influencing the Natural History of Colorectal Liver Metastases」，Lancet，1994;343∶1405-10，報導了在484個未處理的患者中，中數存活期是從診斷時間開始的7.5個月;而對於經受了局部的或全身化療的患者，中數存活時間分別為12.7和11.1個月。圖12圖解顯示給藥後的時間對施用新的治療劑後存活的患者的數目(參見表12)。這些結果是初步的並且是對於小群體的患者，可以看到對患者的利益。
胰癌研究迄今為止在這一胰癌研究中收編了二個患者。按上面描述和在＇840患者中描述每個患者接收125I CC49單克隆抗體，之後間隔1個時間階段。然後給每個患者進行外科手術。測出這兩個患者患有不可切除的疾病。檢測出淋巴結，然後移出。然後按上面描述的方式將用肉眼觀察到的不含有腫瘤的那些淋巴結進行擴增。隨機地分配患者接受單獨的細胞(無IL-2)、對他們使用細胞+IL-2，記錄下面數據表21患者 年齡/ RIGS 細胞 IL-2 最好 評論編號性別日期 (1010) 應答1 62/F 4/1/94 N/A - PD2 69/F 4/1/94 N/A + N/A＊CR＝完全應答;PR＝部分應答;MR＝微小應答SD＝穩定疾病;PD＝演化疾病;NA＝不適用在該申請中，所有引文特地引入本文作為參考。
權利要求
1.一種檢測淋巴結的方法，該淋巴結富集於包括CD4+腫瘤特異性淋巴細胞的腫瘤特異性淋巴細胞中，包括下列步驟a)給患者施用有效量的放射性標記的定位劑，該定位劑特異性地結合一種由瘤組織產生的或與之相關的一種標誌；b)在步驟a)之後間隔一段時間，目的使所說的放射性標記的定位劑優先富集於瘤組織中，並且清除掉未結合的放射性標記的定位劑，以便提高患者瘤組織的光發射與背景光發射的比例；c)在步驟b)中所述的時間間隔之後，通過用放射性檢測探針檢測所述淋巴結位點處提高的發射含量的方法，用所述探針確定顯示有合生了放射性標記的定位劑的淋巴結位點來接近所述患者；d)取出在步驟c)中測出的淋巴結；e)從那些取出的淋巴結中選擇肉眼觀察不含有腫瘤跡象的淋巴結；並且f)培養從步驟e)中選出的所說的淋巴結以激增本文中所述的腫瘤特異性淋巴細胞。
2.根據權利要求1的方法，其中在步驟d)中取出的淋巴結是那些通過肉眼觀察和觸診沒有肉眼可見腫瘤跡象的淋巴結。
3.根據權利要求1的方法，其中所述的選出的淋巴結在步驟f)中受促細胞分裂素刺激進行培養。
4.根據權利要求3的方法，其中在步驟f)中所述的淋巴細胞是在白細胞介素-2和抗-CD3單克隆抗體存在下培養。
5.根據權利要求4的方法，其中所述的培養進一步包括腫瘤相關的糖蛋白(TAG)抗原。
6.根據權利要求4的方法，其中所述的培養進一步包括含有一種或多種自體瘤組織或異源瘤組織的瘤組織。
7.根據權利要求4的方法，其中白細胞介素-2的量在約10～500μ/ml的範圍內並且抗-CD3單克隆抗體的比例在約10～500ng/ml的範圍內。
8.根據權利要求6的方法，其中所述瘤組織已在所述培養步驟g)之前失活。
9.根據權利要求8的方法，其中所述瘤組織已用放射源進行輻射以使之失活。
10.根據權利要求1的方法，其中包括從步驟e)中選定的所述淋巴結中分離出CD4+細胞以便進行步驟f)的培養。
11.根據權利要求1的方法，其中在步驟f)中培養的所述的淋巴細胞來源於脾淋巴細胞。
12.根據權利要求1的方法，所述定位器是一種或多種多克隆抗體、單克隆抗體、抗體片段及其嵌合體，及一種人變體，一種單鏈抗體或肽。
13.根據權利要求1的方法，其中的定位器選自於A5B7單克隆抗體、CC49單克隆抗體、CC83抗體及其結合體。
14.根據權利要求1的方法，其中所述的放射性標記發射出γ射線或β-射線，這種射線可由所述的放射檢測探針檢測。
15.根據權利要求14的方法，其中所述的放射性標記具有不超過約550kev的能量選擇範圍。
16.根據權利要求15的方法，其中所述的放射性標記包括125I。
17.根據權利要求1的所述方法，其中所述放射性標記包括125I。
18.根據權利要求4所述方法，其中所述放射性標記包括125I。
19.根據權利要求1所述方法，其中可用手工操作的可移動位置的輕便發射檢測探針在步驟c)中通過外科手術接近所述患者。
20.根據權利要求1所述方法，其中用一種內窺鏡或腹腔鏡在步驟c)中評估所述患者。
21.根據權利要求1所述方法，其中所述放射檢測探針在增加放射含量的情況下與一種產生聲音的應答器結合。
22.根據權利要求1所述方法，其中在步驟b)中所述比例大於約1.5∶1。
23.根據權利要求4所述方法，其中在步驟c)中用一種內窺鏡或腹腔鏡接近所述患者。
24.根據權利要求1的方法，其中給患者施用步驟f)中經激增的淋巴結。
25.根據權利要求7的方法，其中給患者施用步驟f)中經激增的淋巴結。
26.根據權利要求9的方法，其中給患者施用步驟f)中經激增的淋巴結。
27.一種治療劑，其能有效地減輕腫瘤患者的腫瘤的演化，該治療劑包含藥物學上可接受的載體從患者切下的富集包含CD4+腫瘤特異性淋巴細胞的腫瘤特異性淋巴細胞的淋巴結，其中淋巴結已受分裂素刺激以便其擴增。
28.根據權利要求27的所述治療劑，其中在白細胞個素-2和抗-CD3單克隆抗體存在下培養所述的淋巴結。
29.根據權利要求28的所述治療劑，其中所述培養進一步包括一種或多種腫瘤相關的糖蛋白(TAG)抗原或瘤組織。
30.根據權利要求29的治療劑，其中所述培養包括含有一種或多種自體瘤組織或異源瘤組織的瘤組織。
31.根據權利要求28的治療劑，其中白細胞介素-2的含量範圍從約10到500U/ml範圍，抗-CD3單克隆抗體的比例範圍為約10～500ng/ml。
32.根據權利要求30的治療劑，其中所述瘤組織在用所述淋巴結培養前失活。
33.根據權利要求32的治療劑，其中所述瘤組織用放射源輻射使其失活。
34.根據權利要求27的治療劑，其中所述的淋巴結來源於脾淋巴細胞。
35.一種使患有腫瘤的患者減輕腫瘤症狀的方法，包括給所述病人施用有效量的權利要求27的治療劑。
36.一種使患有腫瘤的患者減輕腫瘤症狀的方法，包括給所述病人施用有效量的權利要求28的治療劑。
37.一種使患有腫瘤的患者減輕腫瘤症狀的方法，包括給所述病人施用有效量的權利要求29的治療劑。
38.使患有腫瘤的患者減輕腫瘤症狀的方法，包括給所述病人施用有效量的權利要求33所述的治療劑。
39.使患有腫瘤的患者減輕腫瘤症狀的方法，包括給所述病人施用有效量的權利要求34所述的治療劑。
40.根據權利要求35的方法，所述患者隨後將進行佐劑化學治療。
41.用於培養含有從患者切下的淋巴結的淋巴結的方法，該淋巴結富集在腫瘤特異性淋巴細胞包括CD4+腫瘤特異性淋巴細胞中，該方法包括以下步驟(a)從所述切下的淋巴結中分離出淋巴結淋巴細胞(LNL);(b)在存在分裂素刺激條件下培養所述LNL以擴增所述LNL;(c)隨後，除去所述分裂素的刺激。
42.根據權利要求41所述方法，其中所述的LNL在白細胞介素-2(IL-2)、抗-CD3單克隆抗體，和腫瘤相關的糖蛋白(TAG)抗原存在下進行培養。
43.根據權利要求42的方法，其中白細胞介素-2的量範圍為10～500U/ml，並且抗-CD3單克隆抗體的比例範圍為從約10～500ng/ml。
44.根據權利要求42的方法，其中所述的IL-2和抗-CD3是可溶的，並同時被加入到所述的LNL中。
45.根據權利要求41所述方法，在巨噬細胞培養基中培養所述的LNL。
46.根據權利要求45所述方法，其中所述培養基是無血清培養基。
47.一種培養淋巴結的方法，該淋巴結包括從患者切下的富集於腫瘤反應性細胞的淋巴結，該方法包括(a)從所述切下的淋巴結中分離出腫瘤活性細胞;(b)在分裂素刺激條件下培養所述腫瘤活性細胞以擴增所述的腫瘤活性細胞;(c)之後，除去所述分裂素刺激。
48.根據權利要求41的方法，其中在白細胞介素-2(IL-2)、抗-CD3單克隆抗體，和腫瘤相關的糖蛋白(TAG)抗原存在的條件下培養所述腫瘤反應性細胞。
49.根據權利要求48的方法，其中白細胞介素-2的量的範圍為約10～500U/ml，抗-CD3單克隆抗體的量為從約10～500ng/ml。
50.根據權利要求48所述方法，其中向所述腫瘤反應性細胞中同時加入所述可溶性IL-2和抗-CD3。
51.根據權利要求47所述方法，其中所述腫瘤反應性細胞於巨噬細胞培養基中進行培養。
52.根據權利要求51的方法，其中所述培養基是無血清培養基。
53.一種有效地減輕腫瘤患者的腫瘤治療劑，該治療劑包括藥物學上可接受載體以及富集於腫瘤反應性細胞上的從病人切下的淋巴結，該淋巴結已受分裂素刺激而擴增。
54.根據權利要求53所述的治療劑，其中在白細胞介素-2和抗-CD3單克隆抗體存在下培養所述淋巴細胞。
55.根據權利要求54所述治療劑，其中包括進一步培養一種或多種腫瘤相關的糖蛋白(TAG)抗原或瘤組織。
56.根據權利要求55所述治療劑，其中所述培養包括含有一種或多種自體瘤組織或異源瘤組織的瘤組織。
57.根據權利要求54所述治療劑，其中白細胞介素-2的量範圍是從約10～500U/ml，抗-CD3單克隆抗體的比例範圍為從約10～500ng/ml。
58.根據權利要求56的治療劑，其中所述瘤組織已在用所述淋巴結培養前進行過失活。
59.根據權利要求58的治療劑，其中所述瘤組織已用放射源進行輻射使其失活。
60.根據權利要求53的治療劑，其中所述淋巴結來自於脾淋巴細胞。
61.一種減輕腫瘤患者腫瘤症狀的方法，包括給患者施用有效劑量的權利要求53所述治療劑。
62.一種減輕腫瘤患者症狀的方法，包括給所述患者施用有效量的權利要求54的治療劑。
63.一種減輕腫瘤患者症狀的方法，包括給所述患者施用有效量的權利要求55的治療劑。
64.一種減輕腫瘤患者症狀的方法，包括給所述患者施用有效量的權利要求59的治療劑。
65.一種減輕腫瘤患者症狀的方法，包括給所述患者施用有效量的權利要求34的治療劑。
66.根據權利要求61所述方法，其中所述患者隨後將進行佐劑化療。
全文摘要
本發明涉及測定富集於腫瘤反應性細胞中的淋巴結的方法。該方法包括給患者施用有效量的放射性標記的定位劑，該定位劑特異性地與由瘤組織產生的或與之相關的一個標誌相結合。然後，通過用放射檢測探針檢測淋巴結位點處提高的輻射水平而確定顯示有合生了放射性標記定位劑的淋巴結位點，從而用該探針接近病人(優選用外科手術)，取出顯示有輻射水平提高的淋巴結位點並進行肉眼觀察分析或組織學分析。然後選擇出肉眼觀察無腫瘤組織或可轉移疾病的淋巴結進行培養，目的是激增腫瘤反應性細胞，使其成為治療癌症的有效治療劑。
文檔編號A61K51/10GK1103431SQ9411574
公開日1995年6月7日 申請日期1994年7月16日 優先權日1993年7月16日
發明者小愛德華·W·馬丁, 布雷恩·J·查爾內基, 皮爾·L·特裡茲, 朱利安·A·金 申請人:俄亥俄州立大學研究基金會