鹼性果膠酶突變體及其重組表達工程菌的製作方法
2024-01-28 15:11:15
專利名稱：鹼性果膠酶突變體及其重組表達工程菌的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程技術領域，具體涉及一種鹼性果膠酶突變體及其重組表達工程菌。
背景技術：
果膠酶是指能催化果膠質分解的多種酶的總稱，對果膠質結構化學的研究表明，果膠質的化學結構比較複雜，能催化其分解的果膠酶也是種類繁多。根據分解糖苷鍵的反應性質或降解底物的性質，果膠酶可以分為3類果膠水解酶、果膠裂解酶和果膠酯酶。果膠酶按其作用最適PH分為酸性果膠酶和鹼性果膠酶。目前研究和應用最多的是酸性果膠酶，主要用於水果榨汁和果汁澄清。
鹼性果膠酶是在鹼性範圍內具有較高活性的果膠酶，在造紙、紡織等行業有著巨大的應用前景，已經引起廣泛的關注。鹼性果膠酶可用於棉麻織物雜質的有效去除，提高織物潤溼性，且不會像纖維素酶那樣降低棉纖維的強度。以鹼性果膠酶為主要成分的脫膠酶，在薴麻、亞麻等麻類植物的脫膠工藝中的應用也越來越受到重視，可以不破壞植物纖維，不汙染環境、節約能源。但現有鹼性果膠酶，酶活水平普遍較低，只有幾十個酶活單位，且鹼性果膠酶對過氧化氫的耐受性低，不能滿足工業生產的需要。目前工業上多採用構建重組表達工程菌株的方法來提高酶製劑的產量，常用的有大腸桿菌、畢赤酵母、麴黴、枯草芽孢桿菌等表達系統，其中枯草芽孢桿菌發酵周期短、工藝成熟，因此得到廣泛使用。
發明內容
本發明的目的是提供一種鹼性果膠酶突變體及其重組表達工程菌，即通過隨機突變的方法對來源於枯草芽孢桿菌的鹼性果膠酶基因進行改造，獲得了酶活水平極大提高的突變體。同時，突變體的酶學性質也比突變前有了很大的改進，為鹼性果膠酶的產業化提供了有力的支持。本發明的一個方面涉及一種鹼性果膠酶突變體，其胺基酸序列為SEQ ID N0:4;其編碼核苷酸序列為SEQ ID N0:3。本發明另一個方面涉及一種重組載體，所述的重組載體為攜帶有序列為SEQ IDNO:3的核苷酸片段的表達載體。上述的表達載體為原核表達載體。本發明的另一方面涉及一種枯草芽孢桿菌工程菌，該工程菌攜帶有能表達上述鹼性果膠酶突變體的表達載體。所述枯草芽孢桿菌工程菌株，命名為Bacillus subtilis PL113，已於2012年8月31日，保藏於地址為北京市朝陽區北辰西路I號院中科院微生物研究所(郵編100101)的中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為=CGMCC NO 64890本發明另一方面涉及上述工程菌株的應用，用於生產鹼性果膠酶突變體。
本發明還涉及上述鹼性果膠酶突變體在紡織等領域的應用。本發明的鹼性果膠酶突變體在枯草芽孢桿菌168中的表達量高達1140U/mL，是突變前的40多倍，且具有更好的酶學性質，對溫度、pH和雙氧水的耐受性都得到很大的提高。本發明的鹼性果膠酶突變體最適作用溫度為60°C，60°C處理20min後，仍能保留38%的酶活，是突變前的4倍；最適pH為9. 0，在pH9. O條件下，60°C處理lh，仍能保留64. 7%的酶活，是突變前的5. 7倍；在含H20210g/L的緩衝體系中處理60min，仍能保留31. 3%的酶活，是突變前的3. 8倍。
圖I :表達載體pWB980-PL113的構建示意圖；圖2 :鹼性果膠酶突變體相對酶活-溫度變化曲線圖；圖3 :鹼性果膠酶突變體相對酶活-pH變化曲線圖。
具體實施例方式下面結合實例對本發明的方法做進一步說明。但實例僅限於說明，並不限於此。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常可按常規條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實驗指南》中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件運行。本領域相關的技術人員可以藉助實施例更好地理解和掌握本發明。但是，本發明的保護和權利要求範圍不限於所提供的案例。實施例I鹼性果膠酶基因PL的克隆一、枯草芽孢桿菌CGMCC1. 897染色體的提取所述枯草芽孢桿菌CGMCC1. 897購自「中國普通微生物菌種保藏管理中心」，分類命名為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，保藏號為CGMCC1. 897。，挑取新鮮的枯草芽孢桿菌CGMCC1.897單菌落於5mLLB液體培養基中，37°C搖床200rpm振蕩培養過夜，按照Tiangen細菌基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司)的說明提取染色體。二、引物設計根據NCBI上鹼性果膠酶同源序列設計引物，上遊引物為5』ATGAAACGACTTTTTTTATGGTTCA3』 ；下遊引物為5』 TCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3』。三、目的基因PL PCR擴增以枯草芽孢桿菌CGMCC1.897染色體為模板，利用上下遊引物進行擴增，擴增條件為94°C預變性5min，94°C變性40s，60°C退火40s，72°C延伸60s，30個循環後，72°C延伸IOmin0凝膠回收試劑盒回收PCR擴增產物，命名為PL，大小為1038bp。四、基因測序驗證將目的基因PL克隆至pMDlS-T載體，送至北京華大基因測序中心進行測序，測得PL基因序列為SEQ ID NO: I，其編碼胺基酸序列為SEQ ID N0:2。通過NCBI同源序列比對，確定擴增的基因為鹼性果膠酶基因，且與Genbank中YP 004203799. I的胺基酸序列同源性達 100%。
實施例2枯草芽孢桿菌工程菌株的構建一、目的基因的PCR擴增根據載體pWB980多克隆位點上的單酶切位點SalI和Sphll，設計引物，上遊引物為 PLF :5』 CCGGTCGACGATGAAACGACTTTTTTTATGGTTC 3』 ；下遊引物為 PLR :5』 CCAGCATGCTCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3』 。以枯草芽孢桿菌CGMCC1.897染色體為模板，利用上下遊引物擴增目的基因PL。二、重組載體的構建將回收的PL PCR擴增產物和載體PWB980，利用限制性內切酶SalI和SphlI，37°C酶切過夜。酶切產物用I. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行回收。按照PL pffB980摩爾比3:1比例進行連接反應，22°C連接5h，得到重組表達質粒pWB980-PL的連接產物，構建過程見圖I。·
三、宿主菌感受態細胞製備I、將宿主菌Bacillus subtilis 168在LB平板上活化。2、挑單菌落於5mLGMI培養基中，30°C，125r/min振蕩培養過夜。3、次日取過夜培養物ImL接到9mLGMI培養基中，37°C，200rpm,振蕩培養3. 5h。4、取2mL上一步的培養液轉接到18mL的GMII培養基中，37°C，200r/min振蕩培養90分鐘。5、上一步培養液，5000g/min室溫離心10分鐘，收集菌體，用2mL原培養液上清重懸菌體，懸浮後的菌體即為感受態細胞。四、重組質粒轉化宿主菌I、將全部連接產物與250uL製備好的宿主菌感受態細胞混合，37°C，200rpm，振蕩培養O. 5h。2、塗布含有30ug/mL卡納黴素的LB平板，篩選得到含有重組表達質粒的枯草芽孢桿菌工程菌株，工程菌株命名為Bacillus subtilis PL。3、測序分析按照omega質粒提取試劑盒的操作說明，提取重組菌Bacillus subtilis PL的質粒，進行測序分析，驗證連接後獲得的是正確的表達閱讀框。枯草芽孢桿菌168感受態細胞製備用溶液IOX 鹽溶液15%Κ2ΗΡ04· 3Η20, 6%ΚΗ2Ρ04, 2%(ΝΗ4)2S04, 0. 2%MgS04. 7H20,1% 檸檬酸
鈉，在蒸餾水中一次溶解，115 °C高溫滅菌，室溫貯存。枯草芽孢桿菌168感受態細胞製備用培養基IOmLGMI 培養基9. 6ImLl X 鹽溶液，O. ImL 10% 酵母粉，O. 25mL 20% 葡萄糖，O. 04mL 5%水解酪蛋白。IOmLGMII 培養基9. 662mL I X 鹽溶液，O. 05mL 10% 酵母粉，O. 25mL 20% 葡萄糖O. 008mL 5% 水解酪蛋白，O. 025mL IMMgCl2 溶液，O. 005mL IM CaCl2 溶液。 實施例3鹼性果膠酶基因PL的隨機點突變及突變文庫構建利用易錯PCR對基因PL進行隨機點突變。一、易錯PCR條件的確定根據文獻經驗，本發明中選用的Mn2+終濃度為O. 5mmol/L。在這個濃度下，根據不同Mg2+濃度下擴增出目的條帶的亮度和特異性，最終選擇Mg2+濃度為6mmol/L。
二、易錯PCR擴增以質粒pWB980-PL為模板，上遊引物PLF 5』CCGGTCGACGATGAAACGACTTTTTTTATGGTTC 3』 ；下遊引物PLR :5』 CCAGCATGCTCAGTAGCCAAATACCAGAGTTG 3』，隨機突變鹼性果膠酶
基因PL。每100 μ L 體系為IOxPCR buffer 10 μ L ;dATP (10mmol/L) 2 μ I ; dGTP(10mmol/L)2y I ;dCTP(50mmol/L) I. 0μ I ;dTTP (50mmol/L) I. Ομ I ;MgC12 (25mmol/L) 24 μ I ；弓 I 物PLF(10ymol/L)4y I ;引物 PLR(10 μ mol/L) 4 μ I ；ddH20 40. 5 μ I ；Mn2+ (5mmol/L) 10 μ L ；DNA Primerstar I μ I (5M/ μ I);模板 pWB980_PL 0· 5 μ I。反應條件為94°C4min ；94°C lmin、60°C 40s,72°C lmin，30 個循環；72°C IOmin0三、突變文庫構建I. 5%瓊脂糖凝膠檢測易錯PCR結果，同時用凝膠回收試劑盒回收PCR片段，具體操作按照Omega Gel Extraction Kit說明書進行。將回收產物經SalI和SphII雙酶切，克隆到表達載體PWB980上，重組質粒轉化宿主菌Bacillus subtilis 168，構建隨機突變文庫，共得到120個單菌落。實施例4突變文庫篩選和酶活測定分別挑取活化後的實施例3所述工程菌Bacillus subtilis PL和突變文庫中的120個重組枯草芽孢桿菌單菌落，接種於30mL種子培養基中，37°C，200rpm發酵培養10h，獲得種子液；按2%的接種量再將種子液轉接到30mL發酵培養基中，370C，200rpm發酵培養24h，獲得發酵液；離心去除菌體，即得到含有鹼性果膠酶的粗酶液。分別測定Bacillus subtilis PL和上述各突變重組菌株粗酶液中鹼性果膠酶的酶活力，酶活測定方法如下酶活單位定義ImL酶液在45 °C，pH為9. O條件下，每分鐘使聚半乳糖醛酸裂解產生I μ mol的不飽和聚半乳糖醛酸的酶量。反應體系中包括粗酶稀釋液20 μ L，0. 2%聚半乳糖醛酸的甘氨酸-氫氧化鈉(0. 2mol/L)緩衝液(pH9. 0，含有 0. 44mmol/L 的 CaCl2)2mL，反應條件為 45°C溫育 15min，用3mL0. 03mol/L的磷酸終止反應，在235nm處測定其吸光度值。酶空白將2mL上述緩衝體系配製的底物保溫2min後，依次加入3mL0. 03mol/L的磷酸和20 μ L與實驗樣相同稀釋倍數的滅活的酶液，混勻。其他操作與實驗樣相同。
OD235XIO6X 釋倍數X Jx應混合液體ft!計算公式· , 活力 CU/niL)=——.....................................................................................................................................................................................................——
103>^4600\{^親_液體積式中4600 (L · Iiior1Cnr1)-不飽和聚半乳糖醒酸在235nm處的摩爾吸光係數t (min) 一酶促反應時間(在酶反應的線性範圍內)b (cm) 一比色杯厚度經簡化酶活力(U/mL) =3. 6232 X稀釋倍數XOD235其中Bacillus subtilis PL (PL)和酶活較高的九株突變重組菌的鹼性果膠酶酶活如表I所示。表I粗酶液中鹼性果膠酶酶活比較
權利要求
1.一種鹼性果膠酶突變體，其特徵在於，所述的鹼性果膠酶突變體的胺基酸序列為SEQID N0:4。
2.一種核苷酸，其特徵在於所述的核苷酸用於編碼權利要求I所述的鹼性果膠酶突變體。
3.如權利要求2所述的核苷酸，其特徵在於所述的核苷酸的序列為SEQID N0:3。
4.一種重組載體，其特徵在於所述的重組載體為攜帶有權利要求3所述的核苷酸片段的表達載體。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特徵在於所述的表達載體為原核表達載體。
6.用於表達權利要求I所述的鹼性果膠酶突變體的枯草芽孢桿菌工程菌，其特徵在於，所述的枯草芽孢桿菌工程菌攜帶有權利要求4所述的重組載體。
7.如權利要求6所述的枯草芽孢桿菌工程菌，其保藏編號為CGMCCNO. 6489。
8.權利要求I所述的鹼性果膠酶突變體在紡織領域中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種鹼性果膠酶突變體及其重組表達工程菌，所述的鹼性果膠酶突變體，其胺基酸序列為SEQ ID NO:4；其編碼核苷酸序列為SEQ ID NO:3。用於表達上述突變體的枯草芽孢桿菌工程菌株，其保藏編號為CGMCC NO.6489。本發明的鹼性果膠酶突變體在枯草芽孢桿菌中的表達量高達1140U/mL，是突變前的40多倍，且具有更好的酶學性質，對溫度、pH和雙氧水的耐受性都得到很大的提高。本發明的鹼性果膠酶突變體最適作用溫度為60℃，60℃處理20min後，仍能保留38%的酶活，是突變前的4倍；最適pH為9.0，在pH9.0條件下，60℃處理1h，仍能保留64.7%的酶活，是突變前的5.7倍；在含H2O2的緩衝體系中處理60min，仍能保留31.3%的酶活，是突變前的3.8倍。
文檔編號D06M16/00GK102899299SQ20121032633
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月6日 優先權日2012年9月6日
發明者肖志壯, 張霞, 王海, 劉魯民, 郝榮耀 申請人:青島蔚藍生物集團有限公司, 濰坊康地恩生物科技有限公司