富硒蛹蟲草及其栽培方法與應用與流程

2024-04-11 04:25:05 1

本發明涉及蛹蟲草栽培技術，具體地說，涉及一種富硒蛹蟲草及其栽培方法與應用。

背景技術：

硒(selenium,se)元素是人和動物生命活動中不可缺少的微量元素之一，是生物體內硫氧還原蛋白酶、脫碘酶、穀胱甘肽過氧化酶等多種含硒酶蛋白的必需組分，並且參與人體多種代謝途徑。研究發現，當機體缺乏硒元素時，會減弱免疫機制，降低對疾病的抵抗力，出現各種相應的缺乏症狀。我國具有豐富硒資源，但硒在自然界分布極不均勻，導致我國三分之二以上地區缺硒。中國營養學會及fao/who/iaea聯合專家委員會確定人體攝入量適宜範圍為60-250μg/d，安全劑量為400μg/d，中毒劑量為800μg/d。硒過量也會造成人體危害，因此亟待為缺硒人群開發安全高效硒源。自然界中硒主要以有機硒和無機硒兩種形式存，現已證實膳食中硒的吸收與其化學狀態有關，通常無機態硒的生物活性低於有機硒的生物活性。研究表明無機硒(硒酸鹽、亞硒酸鹽)毒性較大，作為直接補硒源具有潛在危險；而有機硒(硒代蛋氨酸，硒代胱氨酸，硒甲基硒代胱氨酸，等)毒性較低，並具有多種生物活性，包括抗腫瘤、抗氧化、提高免疫力等。因此利用生物轉化，將無機硒轉化為具有高活性的有機硒是目前富硒產品的最安全有效的手段之一。外源添加四價硒、六價硒具有較高的環境風險，同時四價硒、六價硒對生物體的毒性作用較大，生物體很難高效的將其利用並不影響其自身品質。而納米硒的毒性較低，生物體對其吸收和耐受濃度顯著高於四價硒和六價硒，因此納米硒在生物轉化過程中更安全、更高效。

蛹蟲草(cordycepsmilitaris)又名北冬蟲夏草，在生物分學上屬於是子囊菌亞門，麥角菌目，麥角菌科，蟲草屬。蛹蟲草是一種藥食兩用真菌，含有豐富的蟲草酸、蟲草素、腺苷、胺基酸等活性成分，並具有顯著的藥理作用，如抗疲勞、抗腫瘤、耐缺氧、增強免疫力、增強性功能等。真菌中硒經過生物轉化，大部分以有機硒形態存在於子實體中，從而極易被人體吸收利用，但普通蛹蟲草子實體中硒含量偏低，同時普通蛹蟲草對硒的耐受和生物轉化能力較低，在硒濃度達到其耐受限度就出現菌絲和子實體的生長受到嚴重抑制，甚至死亡。通過化學合成以及微生物發酵的方法製備納米硒是一種更為簡便、經濟、綠色環保獲取單質硒的方法。通過篩選耐硒蛹蟲草菌株，同時利用納米硒進行富硒蛹蟲草的栽培，有效降低了外源硒的環境風險，同時更高程度提升了蛹蟲草子實體中有機硒含量。國內外研究人員對微生物參與的硒的各價態間的轉化及有機硒的形成有較明確的認識。利用富硒蛹蟲草能夠完全將無機硒轉化為低毒、高活性的有機硒形式，能夠更加安全高效的進行補硒。

技術實現要素：

本發明的目的是提供一種富硒蛹蟲草及其栽培方法。

本發明的另一目的是提供所述富硒蛹蟲草在富硒功能食品、保健品以及飼料產品中的應用。

本發明的又一目的是提供利用富硒蛹蟲草栽培後的培養基開發富硒雞飼料等產品方面的應用。

為了實現本發明目的，本發明提供的富硒蛹蟲草的栽培方法，包括以下步驟：

s1、篩選高耐硒蛹蟲草菌株；

s2、將步驟s1篩選得到的高耐硒蛹蟲草菌株在添加有納米硒的培養基中進行培養，即得富硒蛹蟲草。

本發明中所述的納米硒為化學合成的納米硒和/或生物發酵合成的納米硒。其中，化學合成的納米硒，其製備可採用zl201410520106.4公開的方法，合成的納米硒粒徑範圍為30-300nm。生物發酵合成的納米硒，其製備可採用cn201510047365.4、cn201610566900.1、cn201610952997.x、cn201610946230.6或cn201610946282.3公開的方法。

前述的方法，步驟s2所述培養基中納米硒的濃度為2-100mg/l。

前述的方法，步驟s1篩選高耐硒蛹蟲草菌株的方法如下：

s11、採集野生蛹蟲草，將蛹蟲草洗淨，用70-75％酒精(優選75％酒精)消毒，將分生孢子梗切成小塊；

s12、將過濾滅菌的亞硒酸鈉溶液加入到pda培養基中，使培養基中亞硒酸鈉的終濃度達到40-60mg/l(優選60mg/l)，倒平板後，將分子孢子梗接種到含亞硒酸鈉的平板上，於18-22℃避光培養7-10天，觀察菌株生長情況，選擇菌絲生長較好的高耐硒菌株，作為富硒蛹蟲草的出發菌株；

前述的方法，步驟s2具體如下：

s21、將高耐硒出發菌株接種於pda斜面培養基上，於18-22℃恆溫培養箱中培養7-10天，然後將分生孢子轉接至裝有pd液體培養基的錐形瓶中，裝液量為150-200ml/500ml(優選200ml/500ml)，於恆溫震蕩培養箱中18-22℃，150rpm培養3-5天；

s22、步驟s21所得菌液經稀釋5-10倍(優選10倍)後，取5ml稀釋菌液接種於裝有富含納米硒培養基的栽培瓶中，於避光、不通風、溫度15-18℃，空氣相對溼度60-65％的條件下培養4-7天，至菌絲會長滿培養基；

s23、菌絲長滿後給予光照，保證每日光照時長12h，生長3-5天後，菌絲由白色轉變成黃色，待菌絲全部轉變為橘黃色後，每日持續光照24h，繼續在18-22℃培養40-50天；當子實體生長到5-7cm，頂部膨大，表明蛹蟲草子實體成熟，即可採收，得到富硒蛹蟲草。

其中，步驟s22所述的富含納米硒培養基的製備如下：向300ml栽培瓶中加入10-40g大米，10-40mlpd液體培養基，然後加入納米硒，以封口膜封口，於高壓滅菌鍋121℃滅菌30min；滅菌結束後冷卻至室溫，將栽培瓶置於超淨臺上，開紫外燈滅菌30min。

本發明還提供按照上述栽培方法獲得的富硒蛹蟲草，其含有2.8-362μg/g有機硒，蟲草素和腺苷含量分別為6.8-10.3μg/g、2.2-4.1μg/g，總胺基酸含量為1.8-2.4μg/kg。同時富硒蛹蟲草中含有較高的蟲草多糖，蟲草多糖具有抗氧化活性，清除機體內多餘氧自由基，提高免疫力等能力。

本發明還提供所述富硒蛹蟲草在製備富硒功能食品、保健品以及飼料產品中的應用。

本發明還提供由所述富硒蛹蟲草製備的富硒功能食品、保健品以及飼料產品。開發出的產品包括但不限於富硒蛹蟲草糖果壓片，富硒蛹蟲草膠囊，富硒即食玉米粉，富硒即食小米粉，富硒即食豆粉，富硒蛹蟲草保健酒，富硒蛹蟲草保健茶以及富硒動物飼料等。

本發明進一步提供一種富硒雞飼料，製備方法為：利用上述方法製備富硒蛹蟲草，富硒蛹蟲草收穫後，用殘留的培養基製成富硒蛹蟲草菌餅，然後將富硒蛹蟲草菌餅與豆粕，玉米、石粉、維生素、微量元素、食鹽、添加劑等原料進行混合復配，即得富硒雞飼料。

優選地，富硒雞飼料中硒含量為300-500μg/kg。

在本發明的一個具體實施方式中，富硒雞飼料的主要配方為：富硒蛹蟲草菌餅600-800g，豆粕100-150g，玉米粉200-300g，石粉40-50g，維生素2-3g，微量元素2-4g，食鹽0.5-1g，添加劑1-2g。養雞場每日給雞飼餵富硒雞飼料可以使雞蛋中硒含量達到250-600μg/kg。

本發明通過化學合成以及生物發酵的方法製備納米硒，利用製備的納米硒進行蛹蟲草的富硒栽培。本發明首次在栽培過程中利用納米硒獲得富硒蛹蟲草，並將得到的富硒蛹蟲草應用在富硒功能食品、保健品以及飼料產品中。本發明採用的納米硒，具有環境友好，安全高效等特點。將低毒、高生物活性的納米硒應用到富硒蛹蟲草的栽培過程中使蛹蟲草富硒效果顯著，並能夠通過生物轉化全部轉化為有機硒形式存在於富硒蛹蟲草子實體中。本發明的栽培方法能夠獲得生長好，易存活，產量高，營養品質高的富硒蛹蟲草，有利於進行推廣種植，從而提高種植戶收入。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中高耐硒蛹蟲草菌株的生長情況。

圖2為本發明實施例1中富硒蛹蟲草子實體。

圖3為本發明實施例1中富硒蛹蟲草中硒含量測定結果。

圖4為本發明實施例1中富硒蛹蟲草中硒形態，主要以硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸兩種有機硒形式存在。

圖5為本發明實施例1中富硒蛹蟲草中蟲草素、腺苷hplc圖譜。

圖6為本發明實施例1中富硒蛹蟲草中胺基酸圖譜。

圖7為本發明實施例2中富硒雞飼料飼養獲得雞蛋中硒含量。

具體實施方式

以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段，所用原料均為市售商品。

本發明中涉及的培養基如下：

pda培養基，製備方法為：將200g土豆洗淨去皮切塊，加入1000ml水，煮至用勺輕壓就碎，用多層紗布過濾，向濾液中加入20g葡萄糖，20g瓊脂粉，用1水定容至1000ml，調ph7.0。分裝後，用高壓滅菌鍋121℃，30min滅菌，冷卻後備用。

pd液體培養基：土豆200g，葡萄糖20g，水1000ml，ph7.0。

若無特別說明，本發明中所述的「份」是指「重量份」。

實施例1富硒蛹蟲草及其栽培方法

1、高耐硒蛹蟲草菌株篩選

(1)準備好採集工具，在合適的時間和地點採集野生蛹蟲草。

(2)將採集的野生蛹蟲草清洗乾淨，並用75％酒精消毒，將分生孢子梗切成小塊。

(3)將過濾滅菌的亞硒酸鈉溶液加入到pda培養基中，終濃度達到60mg/l，倒平板後，將分子孢子梗接種到含亞硒酸鈉的平板上。置於18-22℃避光培養7-10天，觀察菌株生長情況，選擇菌絲生長較好的高耐硒菌株(圖1)。

2、富硒蛹蟲草的栽培

(1)配製pda斜面培養基，滅菌並冷卻後接入高耐硒菌種，置於18-22℃恆溫培養箱中培養7-10天。

(2)取500ml錐形瓶加入200mlpd液體培養基，滅菌冷卻後接入高耐硒菌種，置於恆溫震蕩培養箱中18-22℃，150rpm，培養3-5天。

(3)在300ml栽培瓶中加入10-40g大米，10-40mlpd液體培養基，加入納米硒使得硒濃度為2-100mg/l，以封口膜封口後在高壓滅菌鍋121℃滅菌30min。

(4)待滅菌結束後冷卻至室溫，放於超淨臺，開紫外燈滅菌30min。將液體菌種稀釋10倍後分別往每瓶中接種5ml菌種。

(5)將接完菌的栽培瓶置於避光、不通風、溫度控制在15-18℃，空氣相對溼度控制在60-65％，培養4-7天，菌絲會長滿培養基。

(6)菌絲長滿後打開光照，保證每日光照時長12h，生長3-5天後，白色菌絲會轉變成黃色。

(7)待菌絲全部轉變為橘黃色後，每日持續光照24h，繼續在18-22℃培養至40-50天。

(8)當子實體生長到5-7cm左右，頂部膨大，表明蛹蟲草子實體成熟，即可採收(圖2)。使用彎頭的小鐵勺將蛹蟲草子實體從根部舀起，晾乾或烘乾。

3、富硒蛹蟲草品質分析

(1)富硒蛹蟲草中總硒分析

將栽培獲得的富硒蛹蟲草進行粉碎，過100目篩。稱取0.2g(一式三份)加入10ml濃硝酸，冷浸24h，用微波消解逐級消解1h，冷卻定容至100ml容量瓶中。用電感耦合等離子質譜(icp-ms)(美國agilent公司7500a)測定總硒含量，同時配製硒標準系列溶液0，1，5，25，50，100μg/l，繪製標準曲線(硒標準溶液購於中國標準物質中心)，定量為外標法。測定結果發現納米硒製備的富硒蛹蟲草烘乾後其中硒含量達到2.8-362μg/g(圖3)。

(2)富硒蛹蟲草中硒形態分析

將栽培獲得的富硒蛹蟲草進行粉碎，過100目篩。稱取0.2g(一式三份)加入8mg/ml的蛋白酶十四10ml。重複混勻後，在37℃恆溫搖床震蕩過夜。反應後，樣品離心得到上清液，過0.22μm濾膜，用高效液相色譜電感耦合等離子質譜(hplc-icp-ms)分析其中硒形態。標準品硒代胱氨酸(secys2)，硒代蛋氨酸(semet)購於中國標準物質中心，外標法定量。液相色譜工作條件：陰離子交換柱(hamiltonprp-x100)，流動相40mm磷酸氫二銨，ph6。測定結果發現富硒蛹蟲草中硒主要以硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸兩種有機硒形式存在(圖4)。

(3)富硒蛹蟲草中蟲草素、腺苷分析

將栽培獲得的富硒蛹蟲草進行粉碎，過100目篩。稱取0.5g(一式三份)加入8ml高純水，超聲5h(p>450w,50hz-100hz)60℃，取出後用水定容至10ml，搖勻。取1ml樣液，4000rpm離心後，後0.22μm濾膜。

蟲草素、腺苷標準品各取10mg(按實際含量折算)，用流動相定容至100ml，搖勻。該混合標準溶液蟲草素和腺苷濃度均為100μg/ml，4℃冰箱保存，有效期1個月。分別取0.1ml0.2ml0.5ml1.0ml2.0ml5.0ml母液(100μg/ml)定容至10ml標準曲線濃度1.0μg/l、2.0μg/l、5.0μg/l、10.0μg/l、20.0μg/l、50.0μg/l。高效液相色譜的使用條件，c18，250mm×4.6mm(i.d)5μm；流動相：a乙腈，b1.0％乙酸a:b＝1：99；流速1.0ml/min；柱溫35℃；檢測波長260nm紫外檢測器打開；進樣量10μl。納米硒製備的富硒蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量分別能夠達到6.8-10.3μg/g，2.2-4.1μg/g(圖5)。顯著高於普通蛹蟲草中蟲草素和腺苷含量。

(4)富硒蛹蟲草中胺基酸分析

將栽培獲得的富硒蛹蟲草進行粉碎，過100目篩。稱取300mg左右樣品，置於10ml水解玻璃管中；加入7ml-8ml左右的6mol/l的鹽酸；擰緊水解管蓋，搖勻樣品，置於烘箱中加熱水解，水解溫度為110℃，水解22小時；水解管放置至室溫，取出水解管中的樣品加入到100ml容量瓶中，用蒸餾水稀釋至刻度。.搖勻容量瓶，使用針筒式0.2μm濾膜過濾，取2ml濾液置於茄形旋轉蒸發瓶中，使用真空旋轉蒸發儀除去酸，用蒸餾水清洗一下，蒸乾，至接近中性；加入2ml蒸餾水溶解，上機分析。使用儀器型號：l-8900日立胺基酸分析儀(l-8900aminoacidanalyzer)，標準品為：日本和光純藥株式會社的混合標準品，標準品名稱：aminoacidsmixturestandardsolution,typeh，定量為外標法。胺基酸分析結果表明，納米硒製備的富硒的蛹蟲草含有的胺基酸種類及含量與普通蛹蟲草相比沒有顯著差異，總胺基酸含量在1.8-2.4μg/kg(圖6)。

實施例2富硒蛹蟲草在富硒功能食品、保健品以及飼料產品中的應用

1、富硒蛹蟲草糖果壓片的製備

實施例1製備的富硒蛹蟲草含有2.8-362μg/g有機硒，蟲草素和腺苷含量分別為6.8-10.3μg/g，2.2-4.1μg/g,總胺基酸含量在1.8-2.4μg/kg。同時富硒蛹蟲草中含有較高的蟲草多糖，蟲草多糖具有抗氧化活性，清除機體內多餘氧自由基，提高免疫力等能力。將富硒蛹蟲草作為原料，開發富硒蛹蟲草壓片糖果具很好的休閒和保健效果。

富硒蛹蟲草壓片糖果主要由30-40％富硒蛹蟲草子實體，20-40％玉米澱粉、10-20％酵素粉、15-25％麥芽糊精、0.3-0.7％硬脂酸鎂組成，以質量百分比計。

例如，取40％富硒蛹蟲草，30％玉米澱粉，10％酵素粉；10％麥芽糊精、9.5％蔗糖、0.5％硬脂酸鎂，充分混合後在輻照滅菌1h，壓片，即得富硒蛹蟲草糖果壓片。

每片富硒蛹蟲草糖果壓片含有20-60μg有機硒，正常人每日攝入1-2片即可滿足每日對硒的需求，患病、老人等特殊人群每日攝入4-6顆。富硒蛹蟲草壓片糖果具有多種保健功能，具有提高人體免疫力、抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用。同時壓片糖果攜帶簡便，味道甘甜，食用方便。

2、富硒蛹蟲草膠囊的製備

(1)挑選出生長粗壯、色澤金黃的富硒蛹蟲草子實體，洗淨、晾乾，進行冷凍乾燥24h，保持富硒蛹蟲草中水份含量低於10％。

(2)將凍幹後的富硒蛹蟲草子實體用高速粉碎機進行粉碎，粉碎後過300-400目篩得到細膩的富硒蛹蟲草粉。

(3)將富硒蛹蟲草粉0.4g每份分裝於食品級天然膠囊中，分裝完成後進行輻照滅菌。

(4)每顆富硒蛹蟲草膠囊含有20-60μg有機硒，正常人每日攝入1-2顆即可滿足每日對硒的需求，患病、老人等特殊人群每日攝入4-6顆。富硒蛹蟲草膠囊製備過程方便，無外源物質添加，蛹蟲草成分純淨，是較好的補硒佳品。定量食用，能起到很好的保健效果。

3、富硒蛹蟲草功能營養粉的製備

(1)富硒蛹蟲草玉米粉

富硒即食玉米粉，其組成主要包括：蛹蟲草粉、玉米粉、稻米粉。

將富硒蛹蟲草烘乾後粉碎至細膩，稱取20份；挑選乾淨無黴變，含水量低於10％的優質玉米粒，經清洗、剝皮、破渣、提胚、粉碎，稱取100份，加入4％的水拌勻後進行膨化，膨化後過100目篩；挑選新鮮乾淨無黴變，含水量低於10％的稻米40份，稻米粉碎後加入3％的水拌勻，經膨化後，過100目篩。

將20-60份富硒蛹蟲草粉，100-300份膨化玉米粉，40-120份膨化稻米粉，20-60份de20的麥芽糊精充分混合後在輻照滅菌後進行小包分裝即為富硒即食玉米粉。每包即食玉米粉含量為10-60g，其中含有10-100μg有機硒。正常人每日攝入1-4包即可滿足每日對硒的需求，患病、老人等特殊人群每日攝入2-8包。

(2)富硒蛹蟲草小米粉

富硒即食小米粉，主要組成有：富硒蛹蟲草粉，小米粉，核桃仁粉，白芝麻粉。

將富硒蛹蟲草烘乾後粉碎至細膩，稱取10-40份；挑選優質的小米，洗淨灰塵、米糠，烘乾後控制含水量低於10％，再經破渣、提胚、粉碎，稱取100份，加入4％的水拌勻後進行膨化，膨化後過100目篩；挑選優質的核桃仁(5-20份)、白芝麻(5-20份)通過清洗，乾燥，翻炒。磨粉備用。

將20-60份富硒蛹蟲草粉，100-300份膨化小米粉，10-40份核桃仁，10-40份白芝麻充分混合後在輻照滅菌後進行小包分裝即為富硒即食小米粉。每包即食小米粉含量為10-60g，其中含有10-100μg有機硒。正常人每日攝入1-4包即可滿足每日對硒的需求，患病、老人等特殊人群每日攝入2-8包。

(3)富硒蛹蟲草豆粉

富硒即食豆粉，主要組成有：富硒蛹蟲草粉，黃豆粉。

將富硒蛹蟲草烘乾後粉碎至細膩，稱取20-60份；挑選優質黃豆，清洗，乾燥後，在130℃下烘烤1h，鹼液浸泡、去皮、磨漿、將黃豆漿液噴霧乾燥、得到黃豆粉100-300份。

將20-60份富硒蛹蟲草粉，100-300份黃豆粉充分混合後在輻照滅菌後進行小包分裝即為富硒即食豆粉。每包即食豆粉含量為10-60g，其中含有10-100μg有機硒。正常人每日攝入1-4包即可滿足每日對硒的需求，患病、老人等特殊人群每日攝入2-8包。

4、富硒蛹蟲草保健酒的製備

將富硒蛹蟲草與多種滋補類食品進行復配，製備富硒蛹蟲草保健酒。

富硒蛹蟲草保健酒以富硒蛹蟲草為主要材料，輔以杜仲、沙參、玉竹、枸杞、茯苓、棗仁、當歸浸入酒中浸泡。每2斤中草藥用量配比為：蛹蟲草40-200g；枸杞30-40g；杜仲3-6g；沙參，棗仁10-20g；玉竹，茯苓5-10g。

富硒蛹蟲草保健酒中有機硒含量在0.5-15μg/ml，成年人每日攝入10-20ml富硒蛹蟲草保健能夠提高機體免疫力，改善血液循環的作用，同時具有補腎壯陽之功效。

5、富硒蛹蟲草保健茶的製備

以富硒蛹蟲草為主要原料，輔以甜葉菊，茉莉花，玫瑰花製成富硒蛹蟲草保健茶。

富硒蛹蟲草保健茶配方：富硒蛹蟲草30-40％，甜葉菊5-10％，茉莉花5-10％，玫瑰花5-10％。

將富硒蛹蟲草、甜葉菊、茉莉花、玫瑰花烘乾控制水份在10％以下。通過配方復配以後分裝，進行滅菌。

富硒蛹蟲草保健茶顏色清亮，含有蟲草素、腺苷、硒、黃酮等多種活性物質，能夠增強人體免疫力抗疲勞。

富硒蛹蟲草保健茶中有機硒含量在40-100μg/g，成年人每日攝入2-4g富硒蛹蟲草保健能夠提高機體免疫力，改善血液循環的作用，同時具有補腎壯陽之功效。

實施例3富硒蛹蟲草栽培過程中附加產品的應用

富硒雞飼料的製備：

(1)納米硒在製備富硒蛹蟲草的過程中，富硒蛹蟲草收穫後會有大量富硒培養基保留。

(2)富硒蛹蟲草剩餘培養基被蛹蟲草菌絲吃透，培養基中硒含量達到1-200μg/g。同時培養基含有大量的蟲草素、腺苷、胺基酸等營養物質。

(3)富硒雞飼料主要以納米硒製備富硒蛹蟲草過程中產生的富硒蛹蟲草菌餅為原料，配合豆粕，玉米、石粉、維生素、微量元素、食鹽、添加劑。

(4)富硒雞飼料的主要配方：富硒雞飼料的主要配方為：富硒蛹蟲草菌餅600-800g，豆粕100-150g，玉米粉200-300g，石粉40-50g，維生素2-3g，微量元素2-4g，食鹽0.5-1g，添加劑1-2g。

(5)富硒雞飼料中硒含量在300-500μg/kg，養雞場每日給雞飼餵富硒雞飼料，飼餵20天後，可以使雞蛋中硒含量達到250-600μg/kg，雞肉硒含量達到160-280μg/kg(圖7)。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。