一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶的製作方法

2024-04-08 03:53:05

一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶，屬於酶工程【技術領域】。本發明採用基因重組技術將葡萄糖氧化酶524位點的甲硫氨酸突變為亮氨酸，並轉化入畢赤酵母Pichia?pastoris?GS115中，經篩選鑑定得到一株較原有菌株催化效率提高的菌株。該菌株表達的葡萄糖氧化酶在50mL搖瓶上酶活64.6U/mL，比野生型提高了近10%。催化效率Kcat/Km為76.98mM-1·s-1，比野生型（16.73mM-1·s-1）提高了近4.5倍。
【專利說明】一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶，屬於酶工程【技術領域】。
【背景技術】
[0002]葡萄糖氧化酶是生物領域中最主要的工具酶之一，自1967年Updike和Hicks將GOD固定在Clark氧電極表面將其應用於血糖測定以來，GOD被廣泛應用於食品飼料醫藥等相關領域。
[0003]在食品工業中，由於氧的存在引起許多不利於產品質量的化學反應，並為許多微生物生長創造了條件。目前許多國家已將GOD作為公認的安全抗氧劑而廣泛應用於各種食品和食品加工工藝中。雖然用途多樣，GOD的作用主要在於將葡萄糖氧化形成過氧化氫和葡萄糖酸。利用其專一氧化酶的原理製成葡萄糖氧化酶分析儀能快速準確簡易地測定各種食品中的葡萄糖含量指導生產。在醫藥工業中GOD作為試劑盒酶電極等用於血清(漿)尿液及腦脊液中葡萄糖的體外定量分析；G0D製成的酶製劑還可用於除去或緩解牙斑牙垢和齲齒的形成，防止口腔疾病和牙病的發生。此外由於可以催化生成H2O2，還可用於對H2O2敏感的淋巴瘤的導向目標的治療。GOD還是一種新型的酶飼料添加劑，能夠改善動物腸道環境調節飼料消化促進動物生長。含葡萄糖氧化酶乳酸過氧化物和乳鐵蛋白的混合飼料添加劑可用於預防牲畜胃腸道感染腹瀉並有促進動物生長作用。
[0004]從動植物組織中提取GOD有一定的局限，酶量亦不豐富；細菌GOD產酶量少；一般採用黑麴黴和青黴屬菌株作為GOD生產菌。我國及美國均採用點青黴及產黃青黴生產G0D,日本常用尼奇青黴,俄羅斯用生機青黴。近年報導膠黴屬(Clioctadium)、擬青黴屬(Paecilomyces)和帚黴屬(Scopulariopsis)也能生產 G0D。
[0005]產量低、酶活低、檢測方法複雜是GOD產業化的限制性因素，國內外為此做了大量工作並取得了明顯進展。目前國外生產的GOD廠家主要是德國的Boehringer和日本的TOYOBO0規模化生產高活性的GOD還有困難。發酵生產GOD的同時產生大量雜蛋白分離提取複雜成本高。同時，葡萄糖氧化酶在生物傳感器方面一直有著很廣泛和重要的應用前景。繼人們採用葡萄糖氧化酶和葡萄糖氧電極而檢測血糖水平之後，第二代傳感器採用人工電子受體(又被稱為電子介質或氧化還原染料)以代替氧作為電子受體。然而這一應用仍存在一些問題，譬如:採用氧化酶(GOD)的電子介質型生物傳感器很容易受到樣品中的溶解氧影響，因此採用對氧低敏感度的氧化酶相對來說具有很大的優勢。本發明旨在提供一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶。

【發明內容】

[0006]本發明提供了一種催化效率提高的葡萄糖氧化酶突變體，是以SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列為出發序列，將第524位的甲硫氨酸M突變為亮氨酸L ;所得突變葡萄糖氧化酶命名為M524L。
[0007]編碼SEQ ID N0.1所示胺基酸序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。[0008]所述突變體M524L的胺基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
[0009]本發明還提供了一株產所述葡萄糖氧化酶的基因工程菌，是以畢赤酵母(Pichiapastoris) GS115為宿主，以pPIC9K為載體，表達編碼所述葡萄糖氧化酶突變體的基因。
[0010]所述基因工程菌的構建方法包括如下步驟:PCR或化學合成得到編碼突變體M524L的基因，連接表達載體pPIC9K，將重組質粒轉化P.pastoris GS115，獲得基因工程菌。
[0011]利用所述基因工程菌發酵產葡萄糖氧化酶的方法，包括以下步驟:(1)將攜帶突變基因的基因工程菌活化後，在30°C、200rpm下培養至OD6tltl=L 6-1.7，作為種子液；(2)將種子液以2% (v/v)的接種量轉入基本發酵培養基，於30°C、200rpm條件下發酵培養；(3)當在基本發酵培養基中培養至OD6tltl=L 2-1.5時，收集菌體，將酵母細胞轉入誘導培養基中誘導蛋白的產生。
[0012]所述基本發酵培養基為BMGY培養基(IL):胰蛋白腖20g，酵母抽提物10g，甘油IOmL, YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩衝液。
[0013]所述誘導培養基為BMMY培養基(IL):胰蛋白腖20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩衝液。
[0014]本發明提供的葡萄糖氧化酶突變體M524L在搖瓶中的酶活比對照菌株的酶活提高了近10%，催化效率Kcat/Km為76.98^ ? s'比野生型(16.73mM_1 ? s』提高了近4.5倍。降低了生產成本，在工業上具有重大應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0015]圖1:各株突變菌株`的葡萄糖氧化酶的酶活比較。
[0016]圖2:各株突變菌株的葡萄糖氧化酶的比酶活比較。
[0017]圖3:催化效率提高型葡萄糖氧化酶蛋白電泳(SDS-PAGE) ；M:蛋白質分子量標準；2:突變株M524L純化後；3:突變株M524L純化前。
[0018]圖4:各株突變葡萄糖氧化酶的pH穩定性比較。
[0019]圖5:各株突變葡萄糖氧化酶的熱穩定性比較。
【具體實施方式】
[0020]葡萄糖氧化酶酶活測定方法:G0D活性測定採用鄰-聯(二)茴香胺分光光度法。在有氧的條件下，GOD催化葡萄糖脫氫產生H2O2，在過氧化物酶(POD)作用下，氧供體鄰-聯(二)茴香胺(DH2)被氧化成棕色產物。測540nm處吸光度的變化，根據標準曲線的結果計算葡萄糖氧化酶活力單位。I個葡萄糖氧化酶活力(IU)定義為:在30°C、pH6.0的條件下，Imin將I mo I的P -D-葡萄糖氧化成D-葡萄糖酸和H2O2所需的酶量為一個葡萄糖氧化酶酶活力單位。
[0021]實施例1重組菌的構建及鑑定
[0022]以SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列為出發序列，分別將第524位的甲硫氨酸M、第305位的甲硫氨酸M突變為亮氨酸L。所得突變葡萄糖氧化酶命名為M524L、M305L。
[0023]以 Pichia pastoris GS115_pPIC9K_G0D (CCTCC NO:M2012266)中的重組質粒PPIC9K-G0D為模板，定點突變獲得含有不同突變GOD基因的載體pPIC9K_G0D，或分別化學合成突變後的基因、連接表達載體PPIC9K。
[0024]所用定點突變引物為:
[0025]M305L-F:5』GAATATTCCGGTATCGGACTGAAGTCCATCCTGGAG3』 ；
[0026]M305L-R:5』CTCCAGGATGGACTTCAGTCCGATACCGGAATATTC3』 ；
[0027]M524L-F:5』GTACTTGCTCCATGCTGCCGAAGGAGATG3』 ；
[0028]M524L-R:5』ATCTCCTTCGGCAGCATGGAGCAAGTAC3』 ； [0029]PCR反應體系:0.2mL PCR管中按順序加入以下試劑:5XFD PCR buffer5 u I;DNTPMixture2 u I;模板DNAl u I ;上遊引物各Iu I ；phusion酶0.5 y I ;加雙蒸水至終體積為 25iil。5XFD PCR buf f er5 u I; DNTP Mixture2 y I;模板 DNAl y I ;下遊引物各 I y I ;phusion酶0.5 ill ； DMSO 1.5 u I加雙蒸水至終體積為25 yl。反應5個循環後，將對應PCR反應液混合，繼續反應25個循環。PCR擴增條件:98°C預變性3min ;98°C變性15s ;53°C退火30s ;72°C延伸llmin (5個循環)；72°C延伸IOmin0混合後擴增條件:98°C變預變性3min ；98°C變性 15s ;53°C退火 30s ;72°C延伸 llmin (25 個循環)；72°C延伸 IOmin0
[0030]限制性內切酶DpnI消化後，化學轉化法轉化宿主菌JM109，轉化菌液塗布在含有氨苄青黴素的LB平板上，37°C過夜培養。最終獲得分別含有突變胺基酸GOD基因的載體PPIC9K-G0D。GOD突變體M524L的胺基酸序列如SEQ ID N0.3所示，GOD突變體M305L的胺基酸序列如SEQ ID N0.4所示。將測序正確的pPIC9K-G0D分別電擊轉化P.pastoris GS115感受態細胞，得到基因工程菌。
[0031]畢赤酵母的轉化採用電轉法:GS115於50mL YPD中培養至OD6tltl=L 2-1.5離心收集細胞；依次用400mL冰冷的無菌水洗兩次細胞，再用40mL冰冷的lmol/L的山梨醇洗一次細胞，重懸細胞於lmLlmol/L的山梨醇中。100 u L原生質體與5-10 u g線性化質粒DNA(MSSI切)混合轉入冰冷的lmol/L山梨醇稀釋菌體後塗布於固體MD培養基。30°C培養4_6天後挑取單克隆。
[0032]實施例2高表達菌株的篩選。
[0033]分別製備含lmg/mL、l.5mg/mL、2mg/mL、2.5mg/mL遺傳黴素的YPD平板,將MD培養基上的單克隆依次點板到不同濃度的YPD平板上培養48小時後，挑取形態較大的菌落進行下一步的發酵培養。
[0034]實施例3重組菌的酶活測定和蛋白電泳
[0035]採用實施例2中獲得的分別表達突變體M524L、M305L的酵母工程菌為生產菌株，活化後將在30°C、200rpm條件下培養到OD6tltl=L 6-1.7的種子以2% (v/v)的接種量轉入基本發酵培養基(裝液量為50mL/500mL)，於30°C、200rpm條件下發酵培養。在基本發酵培養基中培養至0D_=1.2-1.5時，離心收集全部菌體，生理鹽水洗滌2次，重懸後菌體全部轉入50mL(500mL三角瓶)液體誘導培養基中，置於30°C、200r/min搖床培養，每24h補加l%(v/v)的甲醇，誘導產酶。以表達野生型(即，未經突變的出發G0D)葡萄糖氧化酶的P.pastorisGSl 15為對照菌株。
[0036]培養基:種子和斜面培養基為YPD培養基(IL):胰蛋白腖20g，酵母抽提物10g，葡萄糖20g ;斜面培養基添加瓊脂20g。
[0037]基本發酵培養基為BMGY培養基(IL):胰蛋白腖20g，酵母抽提物10g，甘油10mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩衝液。[0038]誘導培養基為BMMY培養基(IL):胰蛋白腖20g，酵母抽提物10g，甲醇8mL，YNB13.4g, IOOmM pH6.0 的磷酸緩衝液。
[0039]發酵結束後獲得發酵液，離心獲得發酵上清，對酶進行純化，純化方法是陰離子層析，採用梯度洗脫的方法，最終獲得較純的葡萄糖氧化酶。
[0040]如附圖所示，通過蛋白電泳(SDS-PAGE)得到一條分子量大小約為68kDa的蛋白條帶。同時在搖瓶過程中，M524L在發酵第6天達到最高酶活64.6U/mL,比對照菌株的酶活(58.7U/ml)提高了近10%。同時，相比野生型，突變株M524L的pH穩定性有所提高，在pH4-7內基本保持50%以上的活力，溫度穩定性基本不變。
[0041]純化後的葡萄糖氧化酶M524L經計算Km值為10mM，Kcat為767.98s—1。催化效率Kcat/Km為76.98mM_1.s'比野生型(16.73mM_1 *8^)提高了近4.5倍。對過氧化氫的耐受能力也有所提聞。
[0042]雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定 的為準。
【權利要求】
1. 一種葡萄糖氧化酶突變體，是以SEQ ID N0.1所示的胺基酸序列為出發序列，將催化活性中心的甲硫氨酸突變為亮氨酸。
2.根據權利要求1所述的葡萄糖氧化酶突變體，其特徵在於，是將第524位的甲硫氨酸M突變為亮氨酸L，突變後的葡萄糖氧化酶的胺基酸序列如SEQ ID N0.3所示。
3.編碼權利要求2所述葡萄糖氧化酶突變體的核苷酸。
4.攜帶權利要求3所述核苷酸的載體、基因工程菌或轉基因細胞系。
5.根據權利要求4所述的基因工程菌，其特徵在於，是以畢赤酵母(Pichiapastoris)GSl 15為宿主，以pPIC9K為載體，表達編碼所述葡萄糖氧化酶突變體的基因。
6.構建權利要求5所述基因工程菌的方法，其特徵在於，是通過PCR或化學合成得到編碼突變體的核苷酸序列，連接表達載體pPIC9K獲得重組質粒,將重組質粒轉化P.pastorisGS115，獲得基因工程菌。
7.應用權利要求5所述基因工程菌發酵生產葡萄糖氧化酶的方法，其特徵在於，包括以下步驟:(1)將攜帶突變基因的基因工程菌活化後，在30°C、200rpm下培養至OD600=L 6-1.7，作為種子液；(2)將種子液以2%的接種量轉入基本發酵培養基，於30°C、200rpm條件下發酵培養；(3)當在基本發酵培養基中培養至OD6tltl=L 2-1.5時，收集菌體，將酵母細胞轉入誘導培養基中誘導蛋白的產生。
8.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述基本發酵培養基為:胰蛋白腖20g/L，酵母抽提物10g/L，甘油10mL/L，YNB13.4g/L，100mM/L pH6.0的磷酸緩衝液。
9.根據權利要求7所述的方法，其特徵在於，所述誘導培養基為:胰蛋白腖20g/L，酵母抽提物 10g/L，甲醇 8mL/L，YNB13.4g/L，100mM/L pH6.0 的磷酸緩衝液。
10.權利要求1所述葡萄糖氧化酶突變體的應用。
【文檔編號】C12N15/81GK103614350SQ201310699636
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】陳堅, 聞一凡, 張娟, 堵國成, 顧磊, 劉曉筱 申請人:江南大學