一株釀酒酵母及其在吸附黃麴黴毒素中的應用的製作方法

2024-04-07 13:57:05

專利名稱：一株釀酒酵母及其在吸附黃麴黴毒素中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一株釀酒酵母及其應用，特別是涉及釀酒酵母及其在吸附黃麴黴毒素
中的應用。
背景技術：
黃麴黴毒素(Aflatoxin， AFT)是黃麴黴(A. flavus)，寄生麴黴(A. parasiticus)及特麴黴(A. nomius)等真菌產生的次級代謝產物，常見的有AFB" AFB2、 AFG" AFG2、 AFM^AFM2、AFB2a、AFG2a、AFBM2a及AFGM2a等，其中AFB工(黃麴黴毒素B》的毒性最強。大量的流行病學調查及研究均證實，黃麴黴毒素B工和B型肝炎病毒協同作用可誘發人肝細胞癌細胞株的建立。黃麴黴毒素B工還會影響動物胚胎，造成免疫抑制和反覆感染，降低某些動物的產奶和產蛋量。黃麴黴毒素主要存在於玉米，花生等食物中，嚴重影響我國花生及其製品的出口 ；此外，飼料也常受到黃麴黴毒素的汙染。因此，迫切需要一種高效安全的脫毒方法消除這類毒素對人畜健康的危害。 目前，黃麴黴毒素的生物學脫毒方法主要有以下幾種 1、微生物代謝產生的酶降解黃麴黴毒素例如從諾卡氏菌DSM 12676、嗜麥窄食單胞菌、假密環菌、分枝桿菌DSM 44556T、紅串紅球菌及糙皮側耳中提取出的降解酶，此方法降解率較高，但酶易受pH，溫度等條件的影響而失活，此外，目前還沒有研究證明黃麴黴毒素降解產物的安全性，故此方法可能產生二次汙染。 2、微生物菌體本身及其細胞壁提取物吸附黃麴黴毒素例如鼠李糖乳桿菌GG、鼠李糖乳桿菌LC-705、乾酪乳桿菌乾酪亞種CGMCC 1. 539及某些釀酒酵母，上述菌株能通過物理方式與黃麴黴毒素結合，形成毒素-菌體複合物，此類複合物易與食品分離，能夠達到去除食品中AFB工的目的。該方法簡便、經濟、不會產生二次汙染，具有較好的開發應用前景。

發明內容
本發明的目的是提供一株釀酒酵母，該菌株菌體本身能夠吸附黃麴黴毒素，該菌
體可用於製備吸附黃麴黴毒素的生物製劑，用於黃麴黴毒素的生物脫毒。本發明所提供的釀酒酵母，是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 。 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1已於2009年11月2日保藏於
中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯
路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCC N2 3382。 釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCC漁3382，是從用於製作饅頭的傳統自然發酵的麵團中分離獲得。 本發明的另一個目的是提供一種吸附黃麴黴毒素B工的生物製劑。 本發明所提供的吸附黃麴黴毒素B工的生物制齊U，是發酵釀酒酵母菌
(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC漁3382得到的菌體。所述菌體是將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC漁3382的發酵液離心去除上清液後獲得。 上述生物製劑中，所述發酵釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1CGMCC N2 3382的發酵培養基組成為酵母浸粉1 % ，蛋白腖2% ，葡萄糖2% ，其餘為水；所述百分含量均為質量百分含量；
所述發酵培養基的pH值為7. 0-7. 2。 所述發酵培養條件為25°C 3(TC，搖床轉速為180rpm 200rpm，搖床旋轉半徑20mm 26mrn，振蕩培養30h 34h。 所述獲得的菌體還經過12rC加熱。所述加熱的步驟是將離心獲得的菌體重新懸
浮於磷酸緩衝液中(pH6. 0)在12rC加熱30min，再離心獲得釀酒酵母菌體。 本發明的第三個目的是提供上述吸附黃麴黴毒素B工的生物製劑的製備方法。 本發明所提供的吸附黃麴黴毒素B工的生物製劑的製備方法，是發酵釀酒酵母菌
S. cerevisiae)LYMT-Yl CGMCC N2 3382，從其發酵液中分離得到的菌體即為吸附黃麴黴毒
素B工的生物製劑。 上述製備方法中，所述發酵釀酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)L預T-YICGMCC N2 3382的發酵培養基組成為酵母浸粉1%，蛋白腖2%，葡萄糖2%，其餘為水；所述百分含量均為質量百分含量；
所述發酵培養基的pH值為7. 0-7. 2。 所述發酵培養條件為25°C 3(TC，搖床轉速為180rpm 200rpm，搖床旋轉半徑20mm 26mrn，振蕩培養30h 34h。 所述獲得的菌體還經過12rC加熱。所述加熱的步驟是將離心獲得的菌體重新懸
浮於磷酸緩衝液中(pH6. 0)在12rC加熱30min，再離心獲得釀酒酵母菌體。 本發明的發酵釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC N2 3382以
及上述生物製劑在吸附黃麴黴毒素B工中的應用也屬於本發明的保護範圍。 所述應用中，所述生物製劑或釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)
L預T-YICGMCC N2 3382吸附黃麴黴毒素B工的溫度條件為20-30°C，優選為23°C ;所述吸
附的時間為30-120min，優選30min。為了達到良好的吸附效果，根據需要，所述釀酒酵母
(S. cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCC N2 3382的添加量可為2. 5X 109個酵母細胞/ml待吸附體
系以上，為了節省成本，提高效率，所述釀酒酵母的添加量可為2. 5 X 109-1. 7 X 101Q個酵母
細胞/ml待吸附體系。 實驗證明，本發明的釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCCN2 3382對黃麴黴毒素Bi具有很強的吸附能力。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)L預T-Y1吸附培養基中黃麴黴毒素B工的實驗表明，當菌體添加量為1.7Xl(T個/ml，菌體處理方式為12rC加熱30min，吸附溫度為3(TC，吸附時間為2h，搖床轉速為200rpm時，釀酒酵母的菌體對黃麴黴毒素B工的吸附率達94. 32X，黃麴黴毒素B工的濃度從23. 11ng/g降低到了 1.31ng/g;當菌體添加量為2. 5Xl(f個/ml，菌體處理方式為12rC加熱30min，吸附溫度為25°C，吸附時間為lh，搖床轉速為200rpm時，釀酒酵母的菌體對黃麴黴毒素B工的吸附率達81. 16%，黃麴黴毒素Bi的濃度從19. 95ng/g降低到了 3. 76ng/g。釀酒酵母(S. cerevisiae)L預T-Y1吸附花生槳中黃麴黴毒素B工的實驗表明菌體添加量為2. 5X109個/ml ，菌體處理方式為121°C加熱30min，吸附溫度為23°C ，吸附時間為30min，搖床轉速為200rpm，釀酒酵母的菌體對花生槳中黃麴黴毒素B^勺吸附率達88. 32%，花生槳中黃麴黴毒素B！的濃度從22. 50ng/g降低到了 2. 63ng/g。 因此，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC漁3382和用它製備的生物製劑在黃麴黴毒素B工的去除中具有良好的應用前景。


圖1為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC N2 3382的具體形態。 圖2為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1的平板菌落形態。
具體實施例方式
下述實施例中所述實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法；所述試劑和生物材
料，如無特殊說明，均可從商業途徑獲得。 實現本發明所採用的培養基具體如下所述 酵母(YPD)培養基酵母浸粉1%，蛋白腖2%，葡萄糖2%，其餘為水，所述百分含量均為質量百分含量。在YPD液體培養基中加入1. 5%質量百分含量的瓊脂即得到YPD固體培養基。 實施例1、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC N2 3382的分離、純化及鑑定。 2009年3月，在超淨工作檯中，取用於製作饅頭的傳統自然發酵麵團放在無菌蒸餾水中振蕩15min製備菌懸液，搖床轉速為180rpm;將菌懸液用無菌水倍比稀釋後塗布在YPD培養基平板上，25t:條件下培養，約40h後，菌落布滿整個平板，用接種環挑取平板上的若干個不同的菌落置於YPD液體培養基中，震蕩培養30h。然後將離心上述發酵液得到的菌體應用於黃麴黴毒素BJ及附試驗，從而篩選出對黃麴黴毒素BJ及附能力最強的菌株。經染色後於光學電子顯微鏡下觀察及生理生化實驗確定該菌株為釀酒酵母。將上述確定為釀酒酵母的菌株進行擴大培養並將其命名為LYMT-Yl。 按照酵母菌的特徵與鑑定手冊(英Barnett， J.A.等著；胡瑞卿譯，青島海洋大學出版社，1991.6)中描述的方法，對菌株L預T-Yl CGMCC N2 3382進行形態特徵、培養特性和生理生化特性鑑定，具體結果如下
(1)菌體的形態特徵 該菌株細胞呈橢圓形，出芽生殖，每個細胞產l個或多個芽孢，芽孢也成橢圓形。該菌株細胞的具體形態見圖1。
(2)培養特性 菌落呈乳白色、光滑、圓形、邊緣整齊、菌落直徑3-4mm、好氧、菌落軟而溼潤、質地均勻容易挑取。該菌株的平板菌落培養形態見圖2。
(3)生理生化特性 發酵:+ ;硝酸鹽;尿酶;重氮基藍B(DBB)實驗_。注:"+ "表示陽性反應，"表示陰性反應。基於以上特徵，將菌株LYMT-Yl鑑定為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，
5並於2009年11月2日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為北京市朝陽區大屯路，中國科學院微生物研究所)，保藏登記號為CGMCCN23382。 實施例2、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCC漁3382對培養基中黃麴黴毒素B工的吸附作用試驗1 將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCC漁3382接種於YPD液體培養基中，30°C ，旋轉半徑20mm， 180rpm振蕩培養33h後。用血球計數板計數發酵液濃度，根據計數結果取適量發酵液，然後離心得到釀酒酵母菌體，將上述菌體懸浮在磷酸緩衝液(p朋.O)中，在12rC加熱30min，加熱完成後離心去除磷酸緩衝液(p朋.0)得到釀酒酵母菌體。 移取2ml YPD培養基，經高效液相色譜檢測得到該培養基中黃麴黴毒素B:的濃度為23. ll士O. 87ng/g，將該培養基加入到盛有上述釀酒酵母菌體的離心管中，菌體添加量為
1. 7 X 1(^個酵母細胞/ml，設置吸附溫度30°C ，吸附時間2h，搖床轉速200rpm，作用完畢後，將上述菌體與培養基的混合溶液在10， OOOrpm離心10min收集上層溶液即可得到脫毒的培養基，經高效液相色譜檢測，脫毒培養基中黃麴黴毒素BJ勺濃度為1.31士0. 10ng/g，該菌體對黃麴黴毒素B工的吸附率達94.32±0.43%。每處理三個重複，上述獲得的結果數值為三個重複的平均值。 對照例1 移取與上述相同的2ml YPD培養基，檢測得到該培養基中黃麴黴毒素B工的濃度為23. ll士O. 87ng/g，將該培養基加入空白離心管中，設置作用溫度3(TC，作用時間2h，搖床轉速200rpm，作用完畢後，將培養基在10， OOOrpm離心10min收集上層溶液，經高效液相色譜檢測，培養基中黃麴黴毒素B工的濃度為23. 11 ±0. 87ng/g。 實驗結果表明，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC漁3382對黃麴黴毒素B工的吸附能力很強，當菌體添加量為1. 7X 101Q個酵母細胞/ml，菌體經121°C加熱30min，吸附溫度3(TC，吸附時間2h，搖床轉速200rpm時，該菌體對培養基中黃麴黴毒素Bi的吸附率達94. 32±0. 43X，可使培養基中黃麴黴毒素Bi的濃度從23. ll士O. 87ng/g降低到1. 31 ±0. 10ng/g。 實施例3、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCC漁3382對培養基中黃麴黴毒素B工的吸附作用試驗2 將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCC漁3382接種於YPD液體培養基中，25t:培養，旋轉半徑26mm， 200rpm振蕩培養33h後。用血球計數板計數發酵液濃度，根據計數結果取適量發酵液，然後離心得到釀酒酵母菌體，將上述菌體懸浮在磷酸緩衝液(p朋.0)中在12rC加熱30min，加熱完成後離心去除磷酸緩衝液(p朋.0)得到釀酒酵母菌體。 移取2ml YPD培養基，經高效液相色譜檢測得到該培養基中黃麴黴毒素B工的濃度為19. 95±0. 30ng/g，將該培養基加入到盛有上述釀酒酵母菌體的離心管中，菌體添加量為
2. 5 X 109個酵母細胞/ml，設置吸附溫度25°C ，吸附時間lh，搖床轉速200rpm，作用完畢後，將上述菌體與培養基的混合溶液在10， OOOrpm離心10min收集上層溶液即可得到脫毒的培養基，經高效液相色譜檢測，脫毒培養基中黃麴黴毒素BJ勺濃度為3. 76±0. 05ng/g，該菌體對黃麴黴毒素B工的吸附率達81. 16±0.26%。每處理三個重複，上述獲得的結果數值為三
個重複的平均值。 對照例2 移取與上述相同的2ml YPD培養基，檢測得到該培養基中黃麴黴毒素B工的濃度為19. 95±0. 30ng/g，將該培養基加入空白離心管中，設置作用溫度25。C，作用時間lh，搖床轉速200rpm，作用完畢後，將培養基在10， OOOrpm離心lOmin收集上層溶液，經高效液相色譜檢測，培養基中黃麴黴毒素B工的濃度為19. 95±0. 30ng/g。 實驗結果表明，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC漁3382對培養基中黃麴黴毒素B工的吸附能力很強，菌體經12rC加熱30min，吸附溫度25。C，吸附時間lh，搖床轉速200rpm時，該菌體對黃麴黴毒素Bi的吸附率達81. 16±0. 26%，可使培養基中黃麴黴毒素B丄的濃度從19. 95±0. 30ng/g降低到3. 76±0. 05ng/g。
按照上述實施例2-3和對比例1-2的方法進行處理後，培養基中黃麴黴毒素B工的濃度都顯著降低了。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC漁3382對培養基中黃麴黴毒素B工的吸附作用試驗表明，當菌體添加量為1.7X10"個/ml，菌體處理方式為12rC加熱30min，吸附溫度為3(TC，吸附時間為2h，搖床轉速為200rpm時，釀酒酵母的菌體對培養基中黃麴黴毒素B工的吸附率達94. 32X，黃麴黴毒素B工的濃度從23. 11ng/g降低到了 1.31ng/g;當菌體添加量為2. 5Xl(f個/ml，菌體處理方式為12rC加熱30min，吸附溫度為25°C，吸附時間為lh，搖床轉速為200rpm時，釀酒酵母的菌體對黃麴黴毒素B工的吸附率達81. 16X，黃麴黴毒素Bi的濃度從19. 95ng/g降低到了 3. 76ng/g。
實施例4、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCC漁3382對花生漿中黃麴黴毒素B工的吸附作用試驗1。 將釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) LYMT-Y1 CGMCC漁3382接種於YPD液體培養基中，25t:，搖床旋轉半徑20mm，搖床轉速為180rpm振蕩培養33h後。用血球計數板計數發酵液濃度，根據計數結果取適量發酵液，然後離心得到釀酒酵母菌體，將上述菌體懸浮在磷酸緩衝液(P朋.O)中在12rC加熱30min，加熱完成後離心去除磷酸緩衝液(p朋.0)得到釀酒酵母菌體。 稱取2g花生漿，經高效液相色譜檢測得到該花生漿中黃麴黴毒素B工的濃度為22. 50士1.31ng/g，將該花生漿加入到盛有上述釀酒酵母菌體的離心管中，菌體添加量為2. 5 X 109個酵母細胞/ml，設置吸附溫度23°C ，吸附時間30min，搖床轉速200rpm，作用完畢後，將上述菌體與花生漿的混合溶液在10， OOOrpm離心lOmin收集上層溶液即可得到脫毒的花生漿，經高效液相色譜檢測，脫毒花生漿中黃麴黴毒素BJ勺濃度為2. 63±0. 30ng/g，該菌體對黃麴黴毒素B工的吸附率達88. 32± 1. 31 % 。每處理三個重複，上述獲得的結果數值為三個重複的平均值。
對照例3 稱取與上述相同的2g花生漿，檢測得到該花生漿中黃麴黴毒素B工的濃度為22. 50± 1. 31ng/g，將該花生漿加入空白離心管中，設置作用溫度23°C ，作用時間30min，搖床轉速200rpm，作用完畢後，將花生漿在10， OOOrpm離心lOmin收集上層溶液，經高效液相色譜檢測，花生漿中黃麴黴毒素B工的濃度為2. 63±0. 30ng/g。 實驗結果表明，釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC漁3382對花生漿黃麴黴毒素B工的吸附能力很強，菌體經121t:加熱30min，吸附溫度23。C，吸附時間30min，搖床轉速為200rpm時，該菌體對花生漿中黃麴黴毒素Bi的吸附率達88. 32士1.31X，可使花生漿中黃麴黴毒素Bi的濃度從22. 50±1.31ng/g降低到了2. 63±0. 30ng/g。
權利要求
釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1，其保藏登記號為CGMCC №3382。
2. 釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1 CGMCC N2 3382在製備吸附黃麴黴毒素BJ勺生物製劑中的應用。
3. —種製備吸附黃麴黴毒素B工的生物製劑的方法，是發酵釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)L預T-Yl CGMCC N2 3382，將其發酵液離心除去上清液得到菌體，即為吸附黃麴黴毒素B工的生物製劑。
4. 根據權利要求3所述的方法，其特徵在於所述發酵釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)LYMT-Yl CGMCC N2 . 3382的發酵培養基的組成為酵母浸粉1 % ，蛋白腖2% ，葡萄糖2% ，其餘為水；所述百分含量均為質量百分含量；所述發酵培養基的pH值為7. 0-7.2。
5. 根據權利要求3或4所述的方法，其特徵在於所述發酵培養條件為25°C 30°C，搖床轉速為180rpm 200rpm，旋轉半徑20mm 26mm，振蕩培養30h 34h。
6. 根據權利要求3-5中任意一項所述的方法，其特徵在於所述獲得的菌體還經過12TC加熱。
7. 根據權利要求6所述的方法，其特徵在於所述加熱的步驟是將離心獲得的菌體重新懸浮於磷酸緩衝液中在12rC加熱30min，再離心獲得釀酒酵母菌體。
8. 權利要求3-7中任意一項所述的方法製備的吸附黃麴黴毒素B工的生物製劑。
9. 權利要求3-7中任一所述的生物製劑在吸附黃麴黴毒素B工中的應用。
10. 根據權利要求9所述的應用，其特徵在於所述吸附黃麴黴毒素B工的溫度條件為20-30。C，優選為23°C ;所述吸附的時間為30-120min，優選30min。
全文摘要
本發明公開了一株釀酒酵母及其在吸附黃麴黴毒素B1中的應用。該菌株是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1CGMCC № 3382。該菌株經過發酵後產生對黃麴黴毒素B1具有吸附作用的菌體。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1CGMCC № 3382對培養基中黃麴黴毒素B1的吸附作用試驗表明，釀酒酵母的菌體對黃麴黴毒素B1的吸附率達81.16％；釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)LYMT-Y1CGMCC № 3382對花生漿中黃麴黴毒素B1的吸附作用試驗表明，釀酒酵母的菌體對花生漿中黃麴黴毒素B1的吸附率達88.32％。
文檔編號C12R1/865GK101775358SQ20101010912
公開日2010年7月14日 申請日期2010年2月8日 優先權日2010年2月8日
發明者劉暢, 劉陽, 邢福國 申請人:中國農業科學院農產品加工研究所