用於測定組氨酸脫羧酶活性的螢光極化測定的製作方法

2024-02-21 07:03:15

專利名稱：用於測定組氨酸脫羧酶活性的螢光極化測定的製作方法
技術領域：
本發明的領域涉及用於檢測HDC活性的螢光極化測定方法，可以用於疾病診斷以及確證HDC抑制劑。
2.背景技術組胺是一種強效生物活性胺，在多種病理以及生理狀態中具有活性(Jutel M，Watanabe T，Akdis M，Blaser K，Akdis CAImmune regulation byhistamine.Curr.Opin.Immunol 2002；14735-740)。除了已經良好表徵的對急性炎性以及過敏性反應的活性外，組胺調節抗原-特異免疫反應的多個方面(Schneider E，Rolli-Derkinderen M，Arock M，Dy MTrends in histamineresearchnew functions during immune responses and hematopoiesis.TrendsImmunol 2002；23255-263)。最近的發現，例如在免疫活性細胞上發現新的組胺受體(H4)以及H1和H2受體對T輔助細胞極化中作用的證實，引起了人們對組胺觸發的免疫調節機制的極大興趣(Schneider E，Rolli-Derkinderen M，Arock M，Dy M.；Trends Immunol.2002 May；23(5)255-63)。
組氨酸脫羧酶(HDC)是組胺生物合成中的限速酶(Watanabe T，Yamatodani A，Maeyama K，Wada HPharmacology ofα-fluoromethylhistidine，a specific inhibitor of histidine decarboxylase.Trends Pharmaceutical Sci1990；11363-367.)。哺乳動物HDC是吡哆醛5-磷酸(PLP)-依賴酶大家族中的成員(Christen P，Mehta PFrom Cofactor to enzymes.The molecular evolutionof pyridoxal-5』phosphate-dependent enzymes.Chemical Record 2001；1436-447.)。HDC在大多數組織中表達但是最高的水平見於皮膚、GI道以及氣道。HDC是74Kd酶，能轉化為更短的54Kd形式(Yatsunami K，Tsuchikawa M，Kamada M，Hori K，Higuchi TComparative studies of humanrecombinant 74-and 54-kDa L-histidine decarboxylase.J.Biol.Chem.1995；27030813-30817)。二種形式在體外都具有活性，但是二者不同時出現在亞細胞室中；74Kd形式主要見於內質網中(Tanaka S，Nemoto K，Yamamura E，Ohmura S，Ichikawa ADegradation of the 74kDa form of l-histidine de-carboxylase via the ubiquitin-proteasome pathway in a rat basophilic/mast cellline(RBL-2H3).FEBS Letters 1997；417203-207)。
最近得到的HDC-缺乏小鼠為內源性組胺在廣泛的正常以及疾病過程中作用的研究提供了良好的系統(Ohtsu H，Watanabe TNew functions ofhistamine found in histidine decarboxylase gene knockout mice.BiochemBiophys Res Commun 2003；443-447)。HDC-/-小鼠具有下降數目的肥大細胞以及下降的粒狀含量如肥大細胞蛋白酶(Ohtsu H，Tanaka S，Terui T，Hori Y，Makabe-Kobayashi Y，Pejler G，Tchougounova E，Hellman L，Gertsenstein M，Hirasawa N，Sakurai E，Buzas E，Kovacs P，Csaba G，Kittel A，Okada M，Hara M，Mar L，Numayama-Tsuruta K，Ishigaki-Suzuki S，Ohuchi K，Ichikawa A，Falus A，Watanabe T，Nagy AMice lacking histidine decarboxylase exhibit abnormalmast cells.FEBS 2001；50253-56.)。這些小鼠顯示了下降的氣道高反應性(Kozma GT，Losonczy G，Keszei M，Komlosi Z，Buzas E，Pallinger E，Appel J，Szabo T，Magyar P，Falus A，Szalai CHistamine deficiency in gene-targetedmice strongly reduces antigen-induced airway hyper-responsiveness，eosinophilia and allergen-specific IgE.International Immunol.2003；15963-973，下降的血管通透性(Ohtsu等Plasma extravasation inducedby dietary supplemented histamine in histamine-free mice.Eur J Immunol.2002；321698-708)、下降的皮膚炎症(Ghosh AK，Hirasawa N，Ohtsu H，Watanabe T，Ohuchi KDefective angiogenesis in the inflammatory granulation tissue inhistidine decarboxylase-deficient mice but not in mast cell-deficient mice.J.Exp.Med.2002；195973-982.)以及增加的骨密度(Fitzpatrick LA，Buzas E，GagneTJ，Nagy A，Horvath C，Ferencz V，Mester A，Kari B，Ruan M，Falus A，BarsonyJ.Targeted deletion of histidine decarboxylase gene in mice increases boneformation and protects against ovariectomy-induced bone loss.Proc Natl AcadSci USA.2003；100(10)6027-32)。因此，強效的HDC活性抑制劑可能可以用於過敏、炎性、免疫性、骨以及心血管疾病。組胺也已經證實是一些類型的癌症增殖的積極的調節劑(Hegyesi H，Somlai B，Varga VL，Toth G，Kovacs P，Molnar EL，Laszlo V，Karpati S，Rivera E，Falus A，Darvas Z.Suppression of melanoma cell proliferation by histidine decarboxylase specificantisense oligonucleotides.J Invest Dermatol.2001 Jul；117(1)151-3)。
組胺的生物作用已經進行了深入的研究，利用組胺受體特異性激動劑或者拮抗劑的藥理學方法。儘管HDC在過敏性以及炎性響應中的重要的作用，目前幾乎沒有該酶的小分子抑制劑。這些抑制劑中的大多數都是通過合理設計策略發現的並且為組氨酸類似物。表徵良好的HDC抑制劑為不可逆抑制劑α-氟甲基組氨酸(Watanabe T，Yamatodani A，Maeyama K，WadaH.Pharmacology of alpha-fluoromethylhistidine，a specific inhibitor of histidinedecarboxylase.Trends Pharmacol Sci.199011363-7)。
識別新類型的HDC抑制劑的能力受限於缺乏適合用於HTS的測定。最常使用用來HDC活性的測定基於o-苯二醛(OPT)方法(Roskoski R，RoskoskiLMA rapid histidine decarboxylase assay.Analytical Biochem.1978；87293-297.)。這種測定對組胺相對於組氨酸不具有選擇性並且涉及酶產物與底物的層析分離。另外一種更加敏感的HDC測定利用[14C]-標記的組氨酸轉化為[14C]-標記的-組胺。然後利用薄層層析分離底物以及產物。組胺ELISA試劑盒可以潛在地適於用來測量HDC活性。但是，這些測定需要乙醯化步驟(乙醯化的組胺)以實現任何有用的選擇性以及靈敏度。此外，這些步驟需要大量的洗滌步驟，而這與HTS不符合。
發明概述用於測定候選化合物的HDC調節活性的螢光極化測定方法，包括下述步驟a)提供反應混合物，包括HDC、組氨酸、螢光標記的組胺探針、候選化合物以及抗組胺抗體，所述的抗組胺抗體對組胺相對於組氨酸的選擇性大於至少10倍；b)孵育反應混合物；
c)測定在測試化合物存在下是否發生了HDC的抑制，其中螢光極化信號的增加表明測試化合物抑制HDC的活性。
在本發明的另一實施方案中，抗組胺抗體對組胺相對於組氨酸的選擇性大於至少100倍。
在本發明的另一實施方案中，孵育反應混合物多於15分鐘，並且更優選地介於60至120分鐘之間並且最優選地介於約80至100分鐘之間。
在本發明的另一實施方案中，使用人HDC。
在本發明的另一實施方案中，HDC為重組酶或者部分純化的。
在本發明的另一實施方案中，組胺探針對抗組胺抗體的親和力大於1μM。
在本發明的另一實施方案中，使用的抗組胺抗體利用通過連接基區域橋連至載體的組胺通過免疫小鼠產生，並且其中所述的連接基結構上類似於螢光探針。
在本發明的另一實施方案中，連接基區域為1，4-苯醌並且載體為白蛋白。
在本發明的另一實施方案中，螢光標記的組胺探針選自FITC、羅丹明、TAMRA或者Cy5。
在本發明的另一實施方案中，組氨酸濃度介於10μM和5mM之間並且更加優選地介於100μM和1mM之間。
本發明另外一方面提供了一種檢測患者樣品中HDC活性作為診斷疾病的工具的方法，其中所述的方法包括a)將所述的樣品與反應混合物接觸，所述的反應混合物包括HDC、組氨酸、螢光標記的組胺探針以及抗組胺抗體，所述的抗組胺抗體對組胺的選擇性比組氨酸至少大10倍；b)孵育反應混合物；c)測定與對照樣品中的HDC活性水平相比，患者樣品中是否發生HDC活性的增加，其中相對於對照樣品的螢光極化信號的下降表明患者樣品處於患所述疾病的風險中。
在本發明的另一實施方案中，使用的抗組胺抗體利用通過連接基區域橋連至載體的組胺通過免疫小鼠產生，並且其中所述的連接基結構上類似於組胺-螢光探針。
在本發明的另一實施方案中，所述的疾病選自癌症、哮喘和肥大細胞瘤、免疫疾病以及胃腸道疾病。
附圖簡述

圖1A顯示了組胺的結構。
圖1B顯示了N-[3′，6′-二羥基-3-氧代螺[異苯並呋喃-1(3H)，9′-[9H]口佔噸-5(或6)-基]-N′-[2-(1H-咪唑-4-基)乙基]-2，4-二甲基硫脲，二鈉鹽(FITC-組胺)探針分子的結構。
圖2顯示了FITC-組胺與抗-組胺抗體的結合。測定如在方法中所述在96-孔板中以一式兩份運行，FITC-組胺濃度為6nM。這些數據利用SAS擬合併且測定的Kd值為3.9nM。
圖3顯示組胺(●)或者組氨酸(□)對結合至抗-組胺抗體的FITC-組胺的置換。如在方法中所述的，在96-孔板中進行一式三份測定，利用6nM FITC-組胺，50nM抗-組胺抗體以及標示的競爭性配體濃度。
圖4A顯示在不同酶濃度下的HDC時間進程。在384-孔板中的一式三份反應通過加入標示濃度的HDC而啟動，並且在孵育0至180分鐘的時間點測定螢光極化。探針、底物以及抗體濃度如在標準測定中所述。
圖4B在90分鐘時候的HDC滴定。測定(384-孔)以一式四份的形式進行，利用標示濃度的HDC在37℃在AllegroTM系統上進行90分鐘。測定窗定義為在空白(無酶)以及反應孔之間的mP差值。
圖5顯示組氨酸甲基酯(A)、α-氟甲基組氨酸(B)以及二肽組氨酸-苯丙氨酸(C)對HDC的抑制。反應利用在方法中描述的標準條件以及標示的抑制劑濃度進行。利用XLFit4(IDBS軟體)擬合數據得到IC50值。誤差線顯示一式三份測定的平均值±SD。
圖6顯示從單天篩選的90塊板(384孔)得到的空白(●)以及陽性對照(□)值的散布圖。
發明詳述螢光標記的組胺探針。本發明提供了螢光探針。優選的探針為FITC-組胺(硫脲，N-[3′，6′-二羥基-3-氧代螺[異苯並呋喃-1(3H)，9′-[9H]口佔噸-5(或6)-基]-N′-[2-(1H-咪唑-4-基)乙基]-2，4-二甲基，二鈉鹽)，其從Molecular Probes(Eugene，OR)得到。其他的合適的探針包括用羅丹明、TAMRA或者Cy5標記的組胺。
抗組胺抗體。本發明提供了一種使用抗組胺抗體的測定。能夠使用的一種合適的單克隆抗體是組胺抗體D22.12，能夠從Argene(Varilhes，France)得到。D22.12抗體利用偶聯至白蛋白的2-組胺基-1，4-苯醌免疫小鼠而得到(Guesdon JL，Chevrier D，Mazie JC，David B，Avrameas SMonoclonalanti-histamine antibody.Preparation，characterization and application to enzymeimmunoassay of histamine.J.Immunol.Methods 1986；8769-78.)，而我們檢測的所有其他的抗體利用偶聯至白蛋白的組胺或者乙醯化組胺免疫得到。D22.12對組胺-螢光的高親和力源自用來得到D22.12的免疫原(組胺基苯醌)和組胺-螢光探針之間的結構上的類似性。適用於本發明的其他的抗組胺抗體能夠利用也具有與組胺探針結構類似的具有相似連接基的免疫原得到。取決於用作探針的螢光團，可以使用不同的抗-組胺抗體。
組氨酸能夠從Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)得到。
HDC酶的來源a)重組-在本發明的優選的實施方案中，使用人HDC酶。包括可以使用全長蛋白或者截短形式如53KD形式，只要截短形式保持組氨酸脫羧酶活性。優選地，使用人HDC蛋白(SEQ ID.1)或其片段。HDC蛋白也可以融合到蛋白標記物上，如穀胱甘肽S-轉移酶(GST)以有利於純化。
b)純化-本發明的方法可以利用純化的HDC酶實施。如這裡所述，術語部分純化包括已經部分純化的HDC酶以使其含量高於可以見於人體細胞的HDC酶。HDC的純化方法是本領域公知的，並且得到Watabe A，Fukui T，Ohmori E，Ichikawa APurification and properties of L-histidine decarboxylasefrom mouse stomach.Biochem.Pharmacol.1992；43587-593的教導，其內容這裡引入作為參考。
用於檢測抑制劑的標準測定在標準的測定中，在HDC緩衝液中稀釋的HDC(所述的緩衝液包含還原劑如DTT和酶輔因子PLP)，加入到樣品板中。將在HDC緩衝液中的測試化合物以及合適量的DMSO或者單獨的緩衝液加入到板中。螢光標記的-組胺和組氨酸在FP緩衝液中混合併且以10μL轉移到板中。最終，將90nM抗-組胺抗體加入到20μL的FP緩衝液中。因此，在測定中的最終濃度為HDC 25至50nM，FITC-組氨酸3至6nM，組氨酸300至600uM，抗-組胺抗體25至50nM，以及DMSO 1至5％。然後將板在37℃孵育至少15分鐘。在獲取螢光極化的合適的儀器上讀數螢光極化信號，如LJLAnalyst(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，激發波長485nm，發射波長530nm，螢光分色鏡在505nm並且G係數設定為1。螢光信號的下降為測試化合物抑制HDC活性的表徵。
用於檢測候選抑制劑的標準步驟的改良-參數的優化本發明提供了一種HDC測定，用於測定候選化合物的HDC調節活性以及一種用於測定患者樣品中的HDC水平的診斷方法。可以預期本領域的普通技術人員可以實施本發明，通過改變許多參數以使測定適於自身的使用。可以改變的一些參數包括抗-組胺抗體濃度、底物組氨酸的濃度、探針濃度、HDC酶的來源以及濃度、測試化合物濃度、加入組分的順序、單個成分的體積、反應的總體積、反應之前的HDC與測試化合物的預孵育步驟的加入、反應的持續時間、反應的溫度、測定板的類型、冷卻或者加熱步驟、終止酶反應的加入步驟(例如酸、鹼、鹽、已知的HDC抑制劑或者其他)、用來讀取螢光極化信號的儀器類型以及相關的參數。
螢光探針對其受體靶分子的選擇性在本發明的一個實施方案中，抗-組胺抗體對組胺的選擇性相對於組氨酸大於100X。合適的候選抑制劑預期IC50＜10μM。
診斷疾病的標準測定從正常或者疾病樣品中提取以及製備組織或者血清以測定HDC活性的方法是本領域中公知的。例如(1)1-Sieja K，Stanosz S，vonMach-Szczypinski J，Olewniczak S，Stanosz M.Concentration of histamine inserum and tissues of the primary ductal breast cancers in women.Breast.2005Jun；14(3)236-41；(2)E.Masini，V.Fabbroni，L.Giannini，A.Vannaccil，L.Messerini，F.Perna，C.Cortesini and F.Cianchi Histamine and histidinedecarboxylase up-regulation in colorectal cancercorrelation with tumor stageInflamm.res.54，Supplement 1(2005)S80-S81；(3)3-Fogel WA，Dudkowska M，Wagner W，Grzelakowska-Sztabert B，Manteuffel-Cymborowska M.Ornithineand histidine decarboxylaseactivities in hypertrophic and hyperplastic mousekidney.Inflamm Res.2005 Apr；54 Suppl 1S62-3。
這些方法可以適用於製備樣品以用於在這裡描述的螢光HDC測定中的檢測。我們的方法容許高通量測定正常靶或者疾病組織或者血漿或者血液樣品中的HDC活性。
實施例試劑FITC-組胺(硫脲，N-[3′，6′-二羥基-3-氧代螺[異苯並呋喃-1(3H)，9′-[9H]口佔噸-5(或6)-基]-N′-[2-(1H-咪唑-4-基)乙基]-2，4-二甲基，二鈉鹽)得自Molecular Probes(Eugene，OR)。組胺單克隆抗體22.12獲自Argene(Varilhes，France)。L-組氨酸、組胺、磷酸鉀(1M單-以及二鹼溶液)、聚乙二醇400分子量、乙二醇四乙酸(EGTA)、二硫蘇糖醇、吡哆醛-5-磷酸以及氯化鈉得自Sigma Chemical Co.(St.Louis，MO)。3-[(3-Cholamidopropyl)二甲基氨基]-1-丙磺酸(CHAPS)得自Pierce Chemical Co.(Rockford，IL)。二甲亞碸由Baker Chemical Corp提供。黑色不透明的聚苯乙烯384-孔板購自Corning-Costar。已知的HDC抑制劑組氨酸-甲基酯，以及His-Phe得自SigmaChemical Co以及α-氟甲基組氨酸得自Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals化合物庫。
緩衝液HDC緩衝液由200mM磷酸鉀(pH 6.8)，2％PEG-400，0.2mM EGTA以及0.03％CHAPS組成。FP緩衝液為16.6mM Tris-HCl(pH 7.5)和50mM NaCl。
組胺含量的HPLC測定HPLC分離在裝配了二極體陣列檢測器的Agilent 1090M上進行。使用Delta-Pak HPI C4 300，2.0×150mm柱(Waters)。流動相由20ml PICB-8Low UV Reagent(Waters)的1000ml 10mM三乙胺磷酸鹽，pH 3.0組成。所有的分離在室溫下(22℃)進行，流速0.2ml/分鐘並且在215nm波長處監測。
利用濃度對響應面積的標準曲線計算組胺濃度。標準曲線利用一式二份注射組胺的對照緩衝液中的溶液產生，濃度為0至200或者600μM。使用6個等間距的濃度。在TI-68計算器上利用線性回歸計算濃度(μM)對響應面積的標準曲線。相關係數大於0.999。
人HDC的克隆相應於全長人HDC的截短的53Kd形式(索取號NM 002112)的cDNA通過PCR擴增，利用源自人肥大細胞系HMC-1的總RNA(Maeda K，Taniguchi H，Ohno I，Ohtsu H，Yamauchi K，Sakurai E，Tanno Y，Butterfield JH，Watanabe T，Shirato KInduction of L-histidine decarboxylase in a human mastcell line，HMC-1.Exp Hematol.1998；26325-31.)。使用的引物為5』-atgatggagcctgaggagtacagag以及3′-acactactgactcaggatgagagt。將HDCcDNA(1.5Kb)克隆到pcDNA4.1載體上。克隆pcDNA4.1-HDC用作模板以得到PCR產物，包含HDC的首先的1431個鹼基(胺基酸殘基1-477)並且插入凝血酶裂解位點5』並且鄰近首先的鹼基。該PCR產物克隆到pDEST 20中，利用Gateway克隆技術(Invitrogen Life Technologies)，按照廠商的操作規程。從最終的表達克隆純化的DNA進行測序證實並且然後轉化成DH10Bac E.coli用於轉座成杆粒。重組的杆粒DNA從單一的菌落純化並且轉座利用PCR分析證實。
GST-HDC的杆狀病毒表達以及純化將20L體積的SF900II-SFM(Invitrogen cat#10902-088)滅菌過濾到30LMBR的攪拌的罐生物反應器中。將MBR生物反應器裝配pH、溶解的氧氣以及溫度探針並且控制設置參數為pH 6.2、DO 50％、溫度27℃、RPM 110。將四份1L的Sf9細胞振蕩瓶生長至細胞密度介於2.5×106和3×106細胞/mL之間並且用來接種生物反應器，得到24L的培養基，細胞密度約為4×105至5×105細胞/mL。對接種的生物反應器每天取樣以檢測細胞密度、生存力以及細胞直徑，利用Cedex細胞計數器(Innovatious)。利用Bioprofile 100分析器(Nova Biomedical)也每天進行有營養的(葡萄糖、穀氨酸)以及廢物(氨)分析。在初始細胞接種後24小時，將生物反應器用GST-HDC杆狀病毒感染得到0.1的MOI。在感染前取樣1.5mL的細胞上清液樣品(離心，傾析以及冷凍)並且每24小時進行一次直至富集進行SDS-PAGE和WESTERN分析。感染後24小時，將25mg的Leupeptin溶解在SF900II-SFM培養基中，過濾滅菌並且注射到生物反應器中。感染後48小時富集。在12L的離心機(Sorvall BP12)中每次旋轉@3000rpm，4℃離心10分鐘沉澱感染的細胞。將沉澱合併到一個離心管中並且進行最終的離心在4℃在3500rpm離心10分鐘。稱量沉澱並且在-80℃冷凍直至使用。標準的沉澱為300克。
進行蛋白純化的時候，所有的緩衝液製備自蒸餾以及去離子水並且所有的步驟在4℃進行。將細胞沉澱與裂解緩衝液(20mM Hepes，pH 7.5，150mM KCl，10％甘油，2mM DTT，1mM EGTA，Roche蛋白酶抑制劑混合物片，以及0.01mM PLP)以5ml/g細胞沉澱的比例混合。將細胞在冰上利用PolyTron PT 2100(Kinematica AG，Switzerland)勻漿，然後利用BransonSonifier 450(Converter，USA)以50％工作循環超聲3次，每次5分鐘。將細胞裂解液在18,600g離心30分鐘，然後在225,071g離心60分鐘。將澄清的裂解液直接負載到50mL Glutahione Sepharose 4B柱(Amersham，Sweden)上，利用AKTA Prime層析系統(Amersham，Sweden)。負載後，將柱用4柱體積(CV)的洗滌緩衝液(20mM Hepes，pH 7.5，150mM KCl，10％甘油，2mMDTT，0.5mM EDTA，0.5mM PMSF和0.01mM PLP)洗滌，並且然後利用10CV的洗脫緩衝液(20mM還原的GTH，2mM DTT以及洗滌緩衝液，pH 8.0)洗滌。富集從柱上洗脫的HDC產物，根據SDS-PAGE凝膠的視覺觀察。標準收率為33mL的HDC，濃度1.8mg/mL。將富集的產品相對於5L的緩衝液1(20mM Hepes，pH 7.5，0.1mM EGTA，0.2mM PMSF，0.25mM DTT，10％甘油和0.01mM PLP)透析4小時，然後相對於5L的緩衝液2(0.1M磷酸鉀，pH 7.5，2％PEG-400，0.1mM EGTA，2mM PMSF，10％甘油和0.02mM PLP)透析17小時。將最終的產物等分，在液氮中快速凍結並且儲存在-80℃。
組氨酸脫羧酶測定在標準的測定中，HDC，在HDC緩衝液中稀釋至90nM以及0.9mM DTT和99μM PLP，以20μL加入到黑色不透明的384-孔板中。以10μL將測試化合物在HDC緩衝液溶液以及6％DMSO中的溶液或者單獨的緩衝液加入到板中。將36nM FITC-組氨酸和3.6mM組氨酸在FP緩衝液中混合併以10μL轉移到板中。最後，將90nM抗-組氨酸抗體以在20μL的FP緩衝液中的溶液加入。因此，在測定中的最終濃度為HDC 30nM、FITC-組氨酸6nM、組氨酸600μM、抗-組胺抗體30nM、DMSO 1％。將板在37℃孵育90分鐘。在LJL Analyst(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)上獲取螢光極化信號，激發波長485nm，發射波長530nm，螢光分色鏡設置在505nm並且G因子設定為1。用於測定開發中的96-孔板的測定形式，如上描述進行，使用的體積是384-孔板中標示的兩倍。
高通量篩選測定在Zymark AllegroTM機器人系統(Caliper-Zymark，Hopkinton，MA)上自動化，利用Multidrop以加入酶，Sciclone以加入底物/探針以及測試化合物，並且Multidrop以加入抗體。將板在潮溼環境中在37℃孵育，並且在集合到Allegro系統的LJL Analyst中讀取螢光極化，利用上述設定。化合物以5μg/mL的濃度篩選。計算相對於測定空白(除了HDC以外包含全部的反應)，以及100％對照(包含HDC緩衝液以及1％DMSO代替化合物)的POC值。
結果HDC酶產物(組胺)以及組胺探針(FITC-組胺)的結構顯示在圖1中。我們首先開始檢測數種商業化的抗組胺抗體與FITC-組胺探針之間的相互作用(數據未顯示)。這些抗體中的一種(D22.12)，顯示了通過螢光極化測定的強烈的探針結合併且保留用於進一步的表徵。
我們首先測定探針對抗體的親和力以及相互作用的特異性，二者對建立競爭模式的強有力的測定是至關重要的。圖2顯示了利用各向異性測量測定的探針和抗體的結合曲線。探針濃度保持在6nM並且抗體濃度以約3個logs變化。在擬合數據的基礎上，測定解離常數為3.9nM。抗體對組胺相對於組氨酸的特異性如圖3中所示證明。探針和抗體濃度分別保持恆定在6和50nM，而組胺和組氨酸的濃度隨所顯示的變化。在檢測的5個log範圍之內，組氨酸不能與FITC-組胺競爭結合抗體。然而組胺自由地與探針競爭結合抗體，得到135μM的IC50。因此，FITC-組胺與組胺單克隆抗體的緊密以及特異結合以及與酶反應的產物競爭結合的能力暗示可能開發針對HDC的強有力的競爭性FP測定。
圖4A顯示了在不同濃度的HDC酶反應的時間過程。600uM的組氨酸，約為報導的Km 200-400uM的兩倍(Watabe等1992)。在HDC濃度＞100nM的時候，反應保持線性只有約30分鐘。為了平衡隨大規模篩選酶需求導致的測定窗的大小以及反應的線性，我們選擇在標準的測定中使用25-50nM的HDC以及90分鐘的孵育時間。圖4B進一步完善，其顯示了在Allegro機器人系統進行的在90分鐘孵育時候的HDC滴度。從該實驗中，我們得到酶濃度為30nM。因此，最終的測定條件設定為30nM HDC、30nM抗體以及6nM FITC-組胺，總體積60μL，在37℃反應90分鐘。PLP濃度設定在33μM以保持酶的飽和。
圖5顯示了3種已知的HDC抑制劑在標準測定中的行為組氨酸甲基酯、α-氟甲基組氨酸以及二肽組氨酸-苯丙氨酸。我們測得3種化合物的IC50分別為7.7uM、1.4uM和228.1uM。這些數值與利用HPLC測定得到的數值較好地一致。
然後將如上描述的測定用來篩選庫中的化合物，最終濃度為5μg/mL。將384-孔板設置包含352個化合物孔，16個對照孔(無化合物)以及16空白孔(無酶)每板。在純淨DMSO中的化合物，在緩衝液種稀釋以得到測定中最終DMSO的濃度為1％。該DMSO濃度顯示對酶活性或者穩定性沒有影響(數據未顯示)。該測定在Allegro自動體系中完全自動化，能夠每天處理約100塊板的通量。圖6顯示了90塊板的單一篩選循環的空白以及對照孔的散射圖，平均的Z』為0.6並且測定窗為80-100mP。在測定中篩選超過600,000種化合物，確證的命中率為0.05％，利用60％的對照作為命中標準。確證的命中化合物隨後進行10點劑量效應測定以評價功效。
討論對FP測定的性能發揮作用的重要的參數為螢光探針對其受體或者靶分子的親和力。通常的規則是，探針結合至其受體的Kd與結合的級分成反比。因此，高親和力結合允許最佳的螢光-配體/受體化學計量學以及強烈的FP信號。我們篩選了多種抗-組胺抗體以尋求發現一種對我們的組胺-螢光探針具有合適的親和力。在這些抗體中只有一種，D22.12，具有足夠高的親和力用於開發FP測定。D22.12抗體是利用偶聯至白蛋白的2-組胺基-1，4-苯醌通過免疫小鼠產生的(Guesdon等；1986)，而我們檢測的所有的其他的抗體利用偶聯至白蛋白的組胺或者乙醯化組胺免疫產生的。D22.12對組胺-螢光的高度結合親和力源自用於得到D22.12的免疫原(組胺基苯醌)以及組胺-螢光探針之間的結構類似性。
HDC(54Kd形式)與其底物的組氨酸的Km為275μM(數據未顯示)。因此，開發HDC測定的重要的必要條件是組胺相對於組氨酸的選擇性。我們的FP測定顯示組胺的選擇性超過對組氨酸選擇性的100-倍。但是，如圖3中所示，由於FP信號中的非特異性增加，組氨酸濃度應該保持低於2mM。這種限制在測定HDC活性的大多數應用中不是問題，因為酶的Km遠低於測定耐受的組氨酸的最大量。
脫羧酶構成了發揮重要生理作用的大的酶家族(Christen等；2001)。例如，DOPA脫羧酶負責關鍵神經遞質多巴胺以及血清緊張素的合成，分別地通過對L-3，4-二羥基苯丙氨酸(L-DOPA)和L-5-羥基色氨酸脫羧基。目前用於測定遞質如血清緊張素和多巴胺的方法與組胺檢測技術類似。因此，這裡描述的針對HDC的測定可以適用於相關的酶如多巴脫羧酶並且使開發具有更好的藥理特性的新的抑制劑成為可能。
序列表110貝林格爾·英格海姆藥物公司(Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals，Inc.)AUGUST，E.MichaelRAJOTTE，Daniel120用於測定組氨酸脫羧酶活性的螢光極化測定1309/327 PCT140PCT/US2005/0417661412005-11-1515060/628,2421512004-11-161601170PatentIn version 3.32101211662212PRT213人(Homo sapiens)4001Met Met Glu Pro Glu Glu Tyr Arg Glu Arg Gly Arg Glu Met Val Asp1 5 10 15Tyr Ile Cys Gln Tyr Leu Ser Thr Val Arg Glu Arg Arg Val Thr Pro20 25 30Asp Val Gln Pro Gly Tyr Leu Arg Ala Gln Leu Pro Glu Ser Ala Pro35 40 45Glu Asp Pro Asp Ser Trp Asp Ser Ile Phe Gly Asp Ile Glu Arg Ile50 55 60Ile Met Pro Gly Val Val His Trp Gln Ser Pro His Met His Ala Tyr65 70 75 80Tyr Pro Ala Leu Thr Ser Trp Pro Ser Leu Leu Gly Asp Met Leu Ala85 90 95
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His Ala Asn Ser Gly Val Ala Thr Asp Phe Met His Trp Gln Ile Pro340 345 350Leu Ser Arg Arg Phe Arg Ser Val Lys Leu Trp Phe Val Ile Arg Ser355 360 365Phe Gly Val Lys Asn Leu Gln Ala His Val Arg His Gly Thr Glu Met370 375 380Ala Lys Tyr Phe Glu Ser Leu Val Arg Asn Asp Pro Ser Phe Glu Ile385 390 395 400Pro Ala Lys Arg His Leu Gly Leu Val Val Phe Arg Leu Lys Gly Pro405 410 415Asn Cys Leu Thr Glu Asn Val Leu Lys Glu Ile Ala Lys Ala Gly Arg420 425 430Leu Phe Leu Ile Pro Ala Thr Ile Gln Asp Lys Leu Ile Ile Arg Phe435 440 445Thr Val Thr Ser Gln Phe Thr Thr Arg Asp Asp Ile Leu Arg Asp Trp450 455 460Asn Leu Ile Arg Asp Ala Ala Thr Leu Ile Leu Ser Gln His Cys Thr465 470 475 480Ser Gln Pro Ser Pro Arg Val Gly Asn Leu Ile Ser Gln Ile Arg Gly485 490 495Ala Arg Ala Trp Ala Cys Gly Thr Ser Leu Gln Ser Val Ser Gly Ala500 505 510Gly Asp Asp Pro Val Gln Ala Arg Lys Ile Ile Lys Gln Pro Gln Arg515 520 525Val Gly Ala Gly Pro Met Lys Arg Glu Asn Gly Leu His Leu Glu Thr530 535 540Leu Leu Asp Pro Val Asp Asp Cys Phe Ser Glu Glu Ala Pro Asp Ala545 550 555 560Thr Lys His Lys Leu Ser Ser Phe Leu Phe Ser Tyr Leu Ser Val Gln565 570 575
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權利要求
1.用於測定候選化合物的HDC調節活性的螢光極化測定方法，包括下述步驟a)提供反應混合物，包括HDC、組氨酸、螢光標記的組胺探針、候選化合物以及抗組胺抗體，所述的抗組胺抗體對組胺的選擇性比組氨酸大至少10倍；b)孵育反應混合物；c)測定在測試化合物存在下是否發生了HDC的抑制，其中螢光極化信號的增加表明測試化合物抑制HDC的活性。
2.權利要求1的測定方法，其中抗組胺抗體對組胺的選擇性比組氨酸大至少100倍。
3.權利要求1的螢光極化測定方法，其中反應混合物孵育多於15分鐘。
4.權利要求3的螢光極化測定方法，其中反應混合物孵育60至120分鐘。
5.權利要求4的螢光極化測定方法，其中反應混合物孵育約80至100分鐘。
6.權利要求1的方法，其中HDC為SEQ ID.No.1的多肽。
7.權利要求1的方法，其中HDC為重組酶。
8.權利要求1的方法，其中HDC為部分純化的。
9.權利要求1的方法，其中組胺探針對抗組胺抗體的親和力大於1μm。
10.權利要求1的方法，其中使用的抗組胺抗體利用通過連接基區域橋連至載體的組胺免疫小鼠產生，並且其中所述的連接基在結構上類似於螢光探針。
11.權利要求10的方法，其中所述的連接基區域為偶聯至載體的1，4-苯醌。
12.權利要求10的方法，其中所述的載體為白蛋白。
13.權利要求1的方法，其中螢光標記的組胺探針選自FITC、羅丹明、四甲基羅丹明和Cy5。
14.權利要求1的方法，其中組氨酸濃度介於10μM至5mM之間。
15.權利要求10的方法，其中組氨酸濃度介於100μm和1mM之間。
16.一種作為疾病診斷工具的檢測患者樣品中HDC活性的方法，其中所述的方法包括a)將所述的樣品與反應混合物接觸，所述的反應混合物包括組氨酸、螢光標記的組胺探針以及抗組胺抗體，所述的抗組胺抗體對組胺的選擇性比組氨酸至少大10倍；b)孵育反應混合物；c)測定與對照樣品中的HDC活性水平相比，患者樣品中是否發生HDC活性增加，其中相對於對照樣品的螢光極化的下降表明患者樣品處於所述疾病的風險中。
17.權利要求16的方法，其中使用的抗組胺抗體利用通過連接基區域橋連至載體的組胺免疫小鼠產生，並且其中所述的連接基結構上類似於螢光探針。
18.權利要求16的方法，其中所述的疾病選自癌症、哮喘、肥大細胞瘤、免疫疾病、骨疾病以及胃腸道疾病。
19.權利要求18的方法，其中所述的疾病為癌症。
全文摘要
用於測定候選化合物的HDC調節活性的螢光極化測定方法，包括下述步驟a)提供反應混合物，包括HDC、組氨酸、螢光標記的組胺探針、候選化合物以及抗組胺抗體，所述的抗組胺抗體對組胺相對於組氨酸的選擇性大於至少10倍；b)孵育反應混合物；c)測定在測試化合物存在下是否發生了HDC的抑制，其中螢光極化信號的增加表明測試化合物抑制HDC的活性。
文檔編號G01N33/53GK101057146SQ200580038616
公開日2007年10月17日 申請日期2005年11月15日 優先權日2004年11月16日
發明者E·麥可·奧古斯特, 丹尼爾·拉喬特 申請人:貝林格爾·英格海姆藥物公司