一種副乾酪乳桿菌及其應用的製作方法
2024-04-15 15:03:05
1.本發明涉及微生物技術領域，具體涉及一種副乾酪乳桿菌及其應用。
背景技術：
2.隨著科學家對乳酸菌健康益處了解的逐漸深入，乳酸菌在食品中的應用範圍也在逐漸擴延。乳酸菌是發酵工業中的重要微生物，代謝物可賦予優良的發酵風味，同時提高產品的營養價值。目前副乾酪乳桿菌和植物乳桿菌是研究較多的益生菌，廣泛應用於奶製品、飲料等食品生產中。
3.共軛亞油酸(conjugated linoleic acid，cla)是含有共軛雙鍵的十八碳二烯酸的總稱，是人體無法合成，必須從外界食物中獲取但又必不可少的脂肪酸之一，被稱為「二十一世紀的新型營養素」。研究表明，cla具有增強人體抗氧化能力和免疫能力的作用，並且在調節血液膽固醇和甘油三酸脂水平、防止動脈粥樣硬化、促進脂肪氧化分解等方面具有積極作用。cla最重要的天然來源是反芻動物相關食品，但含量卻非常低。另外，在亞麻籽油、紅花油、花生油、葵花籽油、棉籽油和玉米油等植物油脂中存在著大量cla的前體物亞油酸(linoleic acid，la)，但其中cla的含量卻很低，通常低於0.1％，很難實現對它的提取利用。
4.目前，國內外產cla微生物的研究尚處在菌株篩選、產cla微生物培養條件優化階段。市場上銷售的cla產品多以游離的la或具有高含量la的植物油為前體物，在一定條件下，通過鹼催化的異構化來生產cla。然而化學法得到的cla往往是由多種異構體組成，對底物的實際利用效率也十分有限，這就造成極大的浪費。
5.申請號：cn202011348882.2的中國發明專利公開了：k56副乾酪乳桿菌在發酵乳清的上清中有總抗氧化能力(t-aoc)達到1.0-3.0u/ml；血管緊張素轉化酶(ace)活力可達到10-70％，超氧化物歧化酶(t-sod)活力可達到20-30u/ml；γ-氨基丁酸含量(gaba)可達到14-21μg/ml；共軛亞油酸(cla)可達0.01-0.06mg/kg。上述產cla的菌株產量較低。
6.文獻「產共軛亞油酸乾酪乳桿菌的誘變選育[j].食品研究與開發，2010，31(06):28-31」公開了經紫外誘變處理，篩選出一株高產共軛亞油酸的菌株，在亞油酸添加量0.05％，乳糖添加量2％，接種量4％，初始ph6.5，37℃發酵36h時，共軛亞油酸生物合成量可達394.1μg/ml。該方法所產共軛亞油酸量大，但所用菌株為誘變菌，不可應用於食品。
[0007]
因此，現有技術中嘗試將產cla的菌種應用到食品中，但是大部分學者篩選到的產cla的菌株產量過低(誘變菌株產量高，但不安全)，且不耐胃液、腸液，不適合應用到食品中。
技術實現要素：
[0008]
為了解決上述技術問題，本發明提供一種副乾酪乳桿菌及其應用，本發明的副乾酪乳桿菌，在高產cla的同時耐胃液消化，其在食品或保健品等領域具有重要的應用價值。
[0009]
本發明的技術方案為：提供了一種副乾酪乳桿菌yys-69，該菌株的分類命名為：副
乾酪乳桿菌yys-69，拉丁文學名：lactobacillus paracasei，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2022年9月28日，保藏編號：cgmcc no.25837。
[0010]
本發明的另一技術方案為：提供一種上述副乾酪乳桿菌yys-69在生產益生菌產品中的應用。
[0011]
本發明的又一技術方案為：提供上述副乾酪乳桿菌yys-69在生產富含共軛亞油酸的食品中的應用。
[0012]
本發明的又一技術方案為：提供上述副乾酪乳桿菌yys-69在生產耐酸，耐膽鹽的食品中的應用。
[0013]
本發明的又一技術方案為：提供一種菌劑，所述菌劑包含上述副乾酪乳桿菌yys-69。
[0014]
本發明的又一技術方案為：提供一種共軛亞油酸的生產方法，將上述副乾酪乳桿菌yys-69進行發酵，所述發酵所用底物包括亞油酸，得到發酵產物，即得到共軛亞油酸。
[0015]
優選的，上述共軛亞油酸的生產方法中，所述底物中亞油酸濃度為0.5mg/ml。
[0016]
本發明的又一技術方案為：提供一種富含γ-氨基丁酸的發酵果汁的生產方法，將上述的副乾酪乳桿菌yys-69和植物乳桿菌bxm2聯合發酵果汁，得到發酵產物，即得到富含γ-氨基丁酸的發酵果汁。
[0017]
植物乳桿菌bxm2，拉丁文學名：lactobacillus plantarum，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區北辰西路1號院3號，保藏日期：2018年9月6日，保藏編號：cgmcc no.16436。
[0018]
優選的，上述富含γ-氨基丁酸的發酵果汁的生產方法中，所述果汁為菠蘿果汁。
[0019]
本發明的又一技術方案為：提供一種富含共軛亞油酸的發酵產品的生產方法，其特徵在於，將上述的副乾酪乳桿菌yys-69和植物乳桿菌bxm2聯合發酵，得到發酵產物，即得到富含共軛亞油酸的發酵產品。
[0020]
本發明的有益效果：本發明提供的副乾酪乳桿菌yys-69分離於重慶農家自製泡菜汁，其為天然菌種，具有較高食品安全性，在mrs培養基中添加0.5％的亞油酸，轉化生成共軛亞油酸的含量為159.2μg/ml。因此其能夠較為高效的將亞油酸轉化為具有生物活性且對人體健康有益的共軛亞油酸，可應用於生產富含共軛亞油酸的發酵產品。
[0021]
進一步的，本發明的副乾酪乳桿菌具有良好的耐胃酸、耐膽鹽及腸道定植能力，也可應用於益生菌產品，改善腸道菌群結構。本發明的副乾酪乳桿菌與植物乳桿菌bxm2聯合發酵能有效改善飲料的風味口感，能同時生成共軛亞油酸和γ-氨基丁酸，可開發為功能食品。
附圖說明
[0022]
圖1為本發明具體實施方式實施例1的副乾酪乳桿菌yys-69溶鈣圈；
[0023]
圖2為本發明具體實施方式實施例1的副乾酪乳桿菌yys-69的菌落形態；
[0024]
圖3為本發明具體實施方式實施例2的共軛亞油酸(cla)測定標準曲線；
[0025]
圖4為本發明具體實施方式實施例3的副乾酪乳桿菌yys-69的革蘭氏染色；
[0026]
圖5為本發明具體實施方式實施例3的副乾酪乳桿菌yys-69的16s r rna擴增產物
瓊脂糖凝膠電泳；
[0027]
圖6為本發明具體實施方式實施例3的基於16s rrna序列的副乾酪乳桿菌yys-69系統發育樹；
[0028]
圖7為本發明具體實施方式實施例5的γ-氨基丁酸測定標準曲線；
[0029]
圖8為本發明具體實施方式實施例5的γ-氨基丁酸標準品譜圖；
[0030]
圖9為本發明具體實施方式實施例5的yys-69+bxm2聯合發酵菠蘿汁譜圖；
[0031]
圖10為本發明具體實施方式實施例5的yys-69+bxm2聯合發酵植物飲料譜圖。
具體實施方式
[0032]
為詳細說明本發明的技術內容、構造特徵、所實現目的及效果，以下結合實施方式並配合附圖詳予說明。
[0033]
實施例1乳酸菌的分離
[0034]
從重慶農家自製泡菜汁中無菌採樣，採用塗布平板法，取5g泡菜汁樣品放入無菌均質袋中，做好標記，加入45ml 0.85％的生理鹽水後完全拍打混勻。然後吸取100μl樣品進行10倍系列的梯度稀釋，分別吸取稀釋倍數為10-4
、10-5
、10-6
的樣品100μl，塗布於含2.5％ caco3的mrs平板上，37℃倒置培養24h。挑取長勢良好，溶鈣圈大的菌落(如圖1)，通過平板劃線分離法反覆分離純化，直至得到單菌落(如圖2)，將該分離菌株命名為yys-69，-80℃甘油菌庫保藏。
[0035]
實施例2產共軛亞油酸條件的篩選
[0036]
1、cla標準曲線繪製
[0037]
稱取100mg cla標準品和200mg吐溫80，混勻，再溶於水並定容至10ml，充分攪拌乳化後，經0.45μm無菌濾膜過濾除菌後獲得10mg/ml的cla標準儲備液，於-20℃避光保存。分別取以下表1標準儲備液，充分振蕩30s，再靜置2-10min；測定233nm下的吸光值。以cla質量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪製標準曲線(如圖3)。
[0038]
表1cla標準曲線配置表
[0039][0040]
2.2待測樣品的檢測分析
[0041]
(1)底物亞油酸(la)的配製
[0042]
底物la母液的配製(30mg/ml)：按照300mg la，200mg吐溫80的比例蝸旋震蕩混合均勻，用去離子水定容至10ml，常溫磁力攪拌20min至混合物充分乳化，然後混合物經過0.22μm無菌水系濾膜過濾除菌後避光保存於-20℃環境中。為了保證母液不會因反覆凍融
而出現破乳現象，母液使用前需要重新渦旋震蕩10min。
[0043]
底物小麥胚芽粉母液的配製：微粉碎的小麥胚芽粉1g，200mg吐溫80的比例，用去離子水定容至10ml，攪拌均勻，超聲波細胞粉碎機乳化5min。
[0044]
(2)培養基配置
[0045]
按照表2配置各培養基，高溫高壓滅菌鍋121℃滅菌15min。
[0046]
表2培養基配置表
[0047][0048]
(3)樣品檢測
[0049]
將活化好的副乾酪乳桿菌yys-69按照2％的接種量接種至各類mrs培養基中，37℃培養箱中培養72h，以未發酵的空白液為對照，發酵液經過8000g離心10min，收集上清液於乾淨離心管中，按照發酵液：異丙醇：正己烷為3:3:6(v/v/v)的比例進行混合，漩渦震蕩充分混合後，靜止分層，轉移上層的正己烷層於乾淨的儲液瓶中，每個樣品做3個平行，233nm測定吸光值。
[0050]
由測得的標準曲線獲得cla濃度與od
233nm
吸光值之間的線性關係，樣品檢測得出yys-69在底物亞油酸濃度為0.5mg/ml時(la+mrs培養基)，其轉化生成共軛亞油酸(cla)的量可達到159.2μg/ml。
[0051]
實施例3乳酸菌的鑑定
[0052]
(1)生理生化試驗
[0053]
將篩選純化的菌株yys-69進行革蘭氏染色(如圖4)及過氧化氫酶試驗，並對其生理生化指標進行測定，試驗結果對照《伯傑氏系統細菌學手冊第八版》進行菌種的初步判定。試驗得出該篩選菌株yys-69革蘭氏染色為紫色，呈陽性。其細胞形狀為杆狀，接觸酶和氧化酶為陰性，無芽孢形成。
[0054]
(2)16s r rna鑑定
[0055]
根據細菌基因dna提取試劑盒說明提取yys-69該未知菌株基因dna，以基因dna為模板進行16s r rna基因的pcr擴增。
[0056]
擴增引物使用通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-tacggctaccttgttacgactt-3')。
[0057]
其中pcr反應體系：dna 2μl，27f 2μl，1492r 2μl，premix ex taq 25μl，ddh2o 19μl。pcr反應條件：94℃預變性3min；94℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，30次循環；最後72℃延伸5min。yys-69提取dna基因組後16s r rna擴增片段如圖5所示。然後將pcr擴增產物送去dna測序(廣州擎科生物工程有限公司)。測序序列結果在ncbi資料庫中用blast軟體搜索近似序列，將所測得的序列和從基因庫中獲得的相關種屬的16s r rna基因序列進行比對，運用mega7.0軟體構建系統發育樹，結果如圖6所示。
[0058]
27f：5'-agagtttgatcctggctcag-3'(seq id no.1)。
[0059]
1492r：5'-tacggctaccttgttacgactt-3'(seq id no.2)。
[0060]
16s r rna基因序列測定結果如下：
[0061]
cgtgagtgaagaaggctttcgggtcgtaaaactctgttgttggagaagaatggtcggcagagtaactgttgtcggcgtgacggtatccaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttatccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggttttttaagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaagcgcatcggaaactgggaaactgtcgaacgagttctcgttgatgatcggtgcttgcaccgagattcaacatggaacgagtggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccttaagtgggggataacatttggaaacagatgctaataccgcatagatccaagaaccgcatggttcttggctgaaagatggcgtaagctatcgcttttggatggacccgcggcgtattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgatgatacgtagccgaactgagaggttgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgtgagtgcagaagaggacagtggaactccatgtgtagcggtgaaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctgtctggtctgtaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgaatgctaggtgttggagggtttccgcccttcagtgccgcagctaacgcattaagcattccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcttttgatcacctgagagatcaggtttccccttcgggggcaaaatgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttatgactagttgccagcatttagttgggcactctagtaagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggatggtacaacgagttgcgagaccgcgaggtcaagctaatctcttaaagccattctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagtcggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgagagtttgtaacacccgaagccggtggcgtaacccttttagggagcgagccgt(seq id no.3)。
[0062]
根據該菌株的細胞形態、生理生化特徵、16s r rna基因序列等數據綜合分析，參考《伯傑氏系統細菌學手冊第八版》，鑑定該菌株為副乾酪乳桿菌(lactobacillus paracasei)yys-69。
[0063]
實施例4菌株模擬胃液耐酸性和腸液耐膽鹽試驗
[0064]
1、菌株模擬胃液耐酸性試驗
[0065]
稱取0.2g nacl與0.35g胃蛋白酶溶解於適量蒸餾水中，用1mol/l鹽酸調節ph值為1.5、2.5、3.5，用100ml容量瓶定容至刻度。將副乾酪乳桿菌yys-69活化後培養24h的發酵液按2％接種量分別接入不同ph值的模擬人工胃酸溶液中，37℃水浴恆溫處理0、2、4h後，分別十倍梯度稀釋，振蕩均勻後取100μl菌液倒板，37℃下培養24h，計算yys-69活菌數和存活率。
[0066]
表2菌株模擬胃液耐酸性試驗統計表
[0067][0068]
由表2可得副乾酪乳桿菌yys-69在不同模擬人工胃液ph下都有很高的存活率，表明副乾酪乳桿菌yys-69胃酸耐受良好。
[0069]
2、菌株模擬腸液耐膽鹽試驗
[0070]
將副乾酪乳桿菌yys-69活化後培養24h的發酵液按2％接種量分別接入0.3％、0.5％與0.7％質量濃度的豬膽鹽溶液中，37℃水浴恆溫處理0、2、4h後，分別十倍梯度稀釋，振蕩均勻後取100μl菌液倒板，37℃下培養24h後，計算yys-69活菌數和存活率。
[0071]
表3菌株模擬腸液耐膽鹽試驗統計表
[0072][0073]
由表3可得副乾酪乳桿菌yys-69隨著膽鹽質量濃度的增加，存活率在不斷下降，當0.7％膽鹽濃度4小時時，存活率為33.3％。
[0074]
實施例5利用本發明副乾酪乳桿菌yys-69製備發酵食品
[0075]
實驗一、發酵菠蘿汁
[0076]
(1)將菠蘿去皮，榨汁，得到菠蘿汁，向菠蘿汁中加入10wt％白砂糖，混勻，於121℃下滅菌15min。接種副乾酪乳桿菌yys-69和植物乳桿菌bxm2的複合均，接種比例為1：2，接種量5％，發酵時間22h。在該條件下得到的發酵菠蘿汁味道酸甜適中，口感柔和濃鬱。取發酵後的菠蘿汁測定γ-氨基丁酸含量(標準曲線如圖7，標準品譜圖如圖8)。
[0077]
以不滅菌果汁作為對照，發現副乾酪乳桿菌yys-69和植物乳桿菌bxm2均能對滅菌和不滅菌的果汁進行發酵。發酵後的菠蘿汁與未發酵相比味道酸甜適中，口感柔和濃鬱。經hplc測定發酵菠蘿汁γ-氨基丁酸含量為27.615mg/kg(如圖9)。發酵所得的活菌數達5.7
×
107cfu/ml，可溶性固形物為21.75
±
0.25，滴定酸為0.828g/kg，產品ph值為3.56。發酵果汁酸甜適中，口感柔和，該複合菌能作為發酵菌種應用於菠蘿果汁的發酵生產中。
[0078]
實驗二、發酵複合植物
[0079]
(2)取花生20份，火麻仁5份，紅參5份，綠豆10份，黃豆10份，添加100份純水，100攝氏度微沸煮60min，放涼後300目過濾。加入益生元(低聚果)10份和0.2wt％的亞油酸為底物，加入5wt％比例為1：2的副乾酪乳桿菌yys-69和植物乳桿菌bxm2，在37℃下發酵20h。取發酵後的發酵液測定共軛亞油酸(cla)和γ-氨基丁酸含量。
[0080]
經發酵後的植物飲料，與未發酵前相比較味道更加豐鬱濃厚，酸甜適中。其中共軛亞油酸含量為100.8μg/ml，γ-氨基丁酸含量為44.028mg/kg(如圖10)。試驗結果表明經副乾酪乳桿菌yys-69和植物乳桿菌bxm2發酵後能有效改善風味口感，同時轉化生成共軛亞油酸和γ-氨基丁酸，對飲料的營養價值起到增效作用。
[0081]
綜上所述，本發明提供的副乾酪乳桿菌yys-69分離篩選自雲南省玉溪市易門縣油坊油料中，本發明提供的副乾酪乳桿菌yys-69分離篩選自雲南省玉溪市易門縣油坊油料中，為天然菌種，具有較高食品安全性，在底物亞油酸濃度為0.5mg/ml時，其轉化生成共軛亞油酸(cla)的量最大，為205.4μg/ml，轉化率約為41.1％，其改善了食品風味，也提高了食品的營養健康功效。
[0082]
實施例6利用本發明副乾酪乳桿菌yys-69製備菌劑
[0083]
將副乾酪乳桿菌yys-69按照以培養基質量的3％的接種量接種於121℃滅菌15min的培養基中，以培養基總質量添加10％酶水解脫脂乳、0.5％葡萄糖、1.5％胰蛋白腖、0.3％酵母浸膏和餘量水組成，調節ph6.8。然後，在溫度37℃下培養18h後，於4℃下6000r/min離心20min，棄上清，加入ph 7.2磷酸鹽緩衝液清洗2-4次，得到菌泥，再用保護劑重懸菌液濃度為10
10
cfu/ml。所述的保護劑含有100g/l脫脂奶粉、30ml/l甘油、100g/l麥芽糊精、150g/l海藻糖與10g/l l-穀氨酸鈉。
[0084]
然後，將該懸浮液在溫度37℃下預培養60min，再進行冷凍乾燥，得到所述的副乾酪乳桿菌yys-69菌劑。利用上述方法製備的菌劑中含有大於1
×
10
10
cfu/g的活性副乾酪乳桿菌yys-69。
[0085]
實施例7利用本發明副乾酪乳桿菌yys-69製備益生菌產品
[0086]
所述益生菌產品為副乾酪乳桿菌yys-69與其他配料的組合物；所述產品中，副乾酪乳桿菌yys-69的活菌數不低於1
×
106cfu/ml或1
×
106cfu/g。所述配料包含益生元、填充劑、酸味劑、溶劑、拋射劑、增溶劑、助溶劑、乳化劑、著色劑、黏合劑、崩解劑、潤滑劑、潤溼劑、滲透壓調節劑、穩定劑、助流劑、矯味劑、防腐劑、包衣材料、芳香劑、抗黏合劑、整合劑、滲透促進劑、ph值調節劑、緩衝劑、增塑劑、表面活性劑、消泡劑、增稠劑、包合劑、保溼劑、吸收劑、稀釋劑、絮凝劑與反絮凝劑以及助濾劑中的一種或幾種。
[0087]
所述益生菌產品的劑型可以為固體飲料、飲料、壓片糖果、顆粒劑、膠囊劑、片劑、丸劑或口服液。
[0088]
更為具體的是，一種副乾酪乳桿菌yys-69固體飲料的製造方法，將所述副乾酪乳桿菌yys-69菌種用液體培養基培養，收集和洗滌菌體，添加輔料，乾燥製備成活性菌粉；取菌粉10份，木糖醇24份，全脂奶粉24份，發酵獼猴桃粉13.705份，麥芽糊精21.6份，低聚半乳糖6.1份，低聚果糖0.1份，無水檸檬酸0.495份，混合均勻，得到副乾酪乳桿菌yys-69固體飲料。所述固體飲料中副乾酪乳桿菌yys-69活菌數不低於1
×
108cfu/g。
[0089]
綜上所述，本發明提供的副乾酪乳桿菌yys-69分離於重慶農家自製泡菜汁，其為天然菌種，具有較高食品安全性，在mrs培養基中添加0.5％的亞油酸，轉化生成共軛亞油酸
的含量為159.2μg/ml。因此其能夠較為高效的將亞油酸轉化為具有生物活性且對人體健康有益的共軛亞油酸，可應用於生產富含共軛亞油酸的發酵產品。
[0090]
進一步的，本發明的副乾酪乳桿菌yys-69具有一定的耐胃酸，耐膽鹽作用，可在人體腸道中定植，起到改善腸道菌群結構的作用，具有較高的商業應用價值。本發明的副乾酪乳桿菌與植物乳桿菌bxm2聯合發酵可生產富含γ-氨基丁酸的菠蘿發酵汁和聯產共軛亞油酸和γ-氨基丁酸的植物發酵飲料，能有效改善風味口感，同時轉化生成共軛亞油酸和γ-氨基丁酸，對飲料的營養價值起到增效作用。
[0091]
如未明確指出，以下實施例中涉及的實驗操作方法為本領域常規的實驗操作方法，涉及的試劑或儀器均可從正規渠道商購獲得。
[0092]
試驗用到的菌種及其培養基如表4所示。
[0093]
表4試驗菌種及培養基
[0094][0095]
本發明實施例中所涉及的培養基：mrs液體培養基：葡萄糖20.0g，胰蛋白腖10.0g，牛肉膏10.0g，酵母浸粉5.0g，吐溫80 1.0m l，磷酸氫二鉀2.0g，檸檬酸銨2.0g，無水乙酸鈉5.0g，硫酸鎂0.5g，一水硫酸錳0.25g，去離子水1l，ph 6.5(加1.5％瓊脂為固體培養基)。
[0096]
以上所述僅為本發明的實施例，並非因此限制本發明的專利範圍，凡是利用本發明說明書及附圖內容所作的等同變換，或直接或間接運用在相關的技術領域，均同理包括在本發明的專利保護範圍內。