具有改善便秘作用的乾酪乳酪桿菌WFP20及其應用的製作方法

2024-04-15 06:43:05 1

具有改善便秘作用的乾酪乳酪桿菌wfp20及其應用
技術領域
1.本發明涉及微生物領域，具體涉及一株具有改善便秘作用乾酪乳酪桿菌wfp20及其應用。


背景技術：

2.便秘是消化系統常見的功能障礙，臨床主要表現為胃腸蠕動少，排便困難、不適或不頻繁，排便不完全。美國胃腸病學協會研究顯示，正常人群的排便頻率為3次/天或多於3次/周不等，而便秘人群一般每周排便少於3次，排便吃力，糞便為硬塊、水分少，且普遍存在胃腸道功能紊亂以及代謝性疾病。近年來由於受飲食及生活方式不合理等因素影響，便秘的發病率逐漸提升，已成為影響健康的主要因素。臨床治療便秘主要採用瀉藥和改善胃腸動力的藥物，如5-ht等，但長期化學藥物治療無法有效根治便秘，而且會損害結腸神經系統，導致排便減少，便秘加重，同時還會引起藥物依賴、噁心嘔吐、腹痛等副作用。
3.目前諸多研究表明便秘與腸道菌群失調密切相關，益生菌對便秘的緩解和治療有良好效果。與普通藥物相比益生菌更加安全，益生菌可通過改善腸道菌群、抑制潛在病原體、產生有利的代謝物或酶來刺激腸液分泌等自然方式，促進腸道蠕動進而緩解便秘。研究發現補充短雙歧桿菌dsm16604和植物乳桿菌lmg p-21021可改善糞便稠度。兩歧雙歧桿菌ccfm16、嗜酸乳桿菌ncimb 30175、鼠李糖乳桿菌ncimb 30174可產生乙酸、丁酸、乳酸等短鏈脂肪酸能刺激腸道蠕動。長雙歧桿菌ncc3001通過調節中樞神經和腸道神經來治療便秘。
4.益生菌緩解某些疾病前提是能夠耐受胃中較高的酸度和小腸中較高的膽鹽濃度，且能夠保證有一定數量黏附在小腸上皮細胞上。同時，在益生菌生產過程中，各個工藝階段需保證較高活菌收率，才能保證產品質量並具備成本優勢。在益生菌產品流通中則需保證有效菌數，具備較好的儲存穩定性是最終發揮健康功效和產品優勢的重要前提。此外，乳品作為益生菌消費最大載體，益生菌能否適應風味發酵乳和酸乳飲料的生產，是評價其產業化規模和消費市場潛在經濟效益的關鍵因素，而目前市場上多數益生菌並不具備以上全部或多數條件。
5.因此，獲得一株有健康功效，且滿足上述在生產、流通和消費多方面均表現出優秀性狀的益生菌株就顯得十分關鍵和必要。


技術實現要素：

6.（一）解決的技術問題針對現有技術的不足，本發明提供了一株具有改善便秘作用的乾酪乳酪桿菌wfp20及其應用，該乾酪乳酪桿菌wfp20具有極強產酸性能和較高的儲存穩定性，可提高糞便中有機酸的含量及雙歧桿菌的數量，並具有改善便秘的作用，以解決同時滿足上述在兼具緩解便秘功效的情況下，同時保持在生產、流通和消費等方面儲存穩定性的問題。
7.（二）技術方案為實現上述乾酪乳酪桿菌wfp20具有極強產酸性能和在高溫儲存條件下的高存活
性，提高糞便中有機酸、雙歧桿菌含量和改善便秘作用的目的，本發明提供如下技術方案：本發明的第一個目的在於提供一株乾酪乳酪桿菌wfp20，其分類命名為乾酪乳酪桿菌lacticaseibacilluscasei，該菌株於2022年6月30日保藏在廣東省微生物菌種保藏中心，保藏編號為gdmcc no. 62586。
8.優選地，所述乾酪乳酪桿菌wfp20發酵脫脂復原乳72h的酸度不低於550
°
t，所述脫脂復原乳中含有6.0～7.0%蛋白。
9.優選地，所述乾酪乳酪桿菌wfp20凍乾粉在37℃、溼度43%rh條件儲存90d存活率在43%以上。
10.本發明第二個目的在於提供乾酪乳酪桿菌wfp20在食品、保健品或藥品中的應用。
11.優選地，所述乾酪乳酪桿菌wfp20在製備具有改善便秘作用的食品、保健品或藥品中應用。
12.優選地，所述乾酪乳酪桿菌wfp20用於製備膳食補充劑、風味發酵酸乳、乳飲料。
13.本發明第三個目的在於，提供含有所述乾酪乳酪桿菌wfp20的組合物。
14.優選地，為同時含有所述乾酪乳酪桿菌wfp20和雙歧桿菌的複合菌劑。
15.優選地，凍幹的乾酪乳酪桿菌wfp20中活菌數不小於3
×
107cfu/g。
16.優選地，含有食品或藥品上可接受的載體或輔料。
17.優選地，所述乾酪乳酪桿菌wfp20的16s rdna核苷酸序列表中序列1所示。
18.優選地，所述乾酪乳酪桿菌wfp20菌落為乳白色，中等大小，中間凸起呈類圓形，直徑1-2mm，邊緣不光滑；菌體杆狀，長短不均一，少彎曲鮮分叉，成單，成雙或成串存在。
19.優選地，所述的乾酪乳酪桿菌wfp20可提高糞便中有機酸及雙歧桿菌數量。
20.優選地，所述的乾酪乳酪桿菌wfp20具有提高排便頻率，達到改善便秘的作用。
21.（三）有益效果與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：1、乾酪乳酪桿菌wfp20篩選自西藏自然發酵酥油，來源安全、天然，具有極強產酸性能，能夠用於製備風味發酵乳或飲料，減少調配中酸味劑用量，提升穩定體系。
22.2、通過乾酪乳酪桿菌wfp20菌株對模擬胃液和腸液耐受性的試驗表明該菌株具有較好耐受性。同時，其凍乾粉在37℃的高溫儲存條件下有較高的存活率，使其能夠適用於常溫條件下的加工、運輸、存儲、消費等環節，不必進行低溫儲藏，既可以降低菌種儲存成本，也能夠為上述環節提供更加寬鬆的條件。此外，通過實驗證明該菌株能提高糞便中有機酸和雙歧桿菌數量，提高排便頻率，可用於製備食品、保健品或藥品，有利於更好發揮改善便秘效果，具有極好的應用價值。
附圖說明
23.圖1為乾酪乳酪桿菌wfp20平板菌落形態圖。
24.圖2為乾酪乳酪桿菌wfp20菌體鏡檢圖。
25.圖3為乾酪乳酪桿菌wfp20產酸性能效果圖。
26.圖4為乾酪乳酪桿菌wfp20在模擬胃液和腸液存活率效果圖。
27.圖5為乾酪乳酪桿菌wfp20在37℃、90d存活率效果圖。
28.圖6為乾酪乳酪桿菌wfp20的酸乳飲料在37℃下保存180d的實際效果圖。
29.圖7為攝入乾酪乳酪桿菌wfp20的小鼠糞便中雙歧桿菌mrna表達水平；其中，a為qpcr擴增曲線c
t
值曲線圖，b為qpcr擴增熔解曲線單峰。
具體實施方式
30.下面結合本發明實施例中的附圖，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。
31.在以下實施例中，菌粉的生產過程中所用的改良後mrs液體培養基配方為：葡萄糖70.0g/l，酵母浸粉30.0g/l，蛋白腖10.0g/l，檸檬酸鈉6.0g/l，磷酸氫二鉀2.0g/l，乙酸鈉5.0g/l，硫酸鎂0.1g/l，硫酸錳0.05g/l，吐溫801.0g/l。
32.菌泥凍幹過程中所用的凍幹保護劑配方為：脫脂乳粉120.0g/l，海藻糖200.0g/l，甘油30g/l，組氨酸10g/l，異抗壞血酸鈉1.0g/l。
33.實施例1、乾酪乳酪桿菌wfp20分離鑑定1、菌株的分離、篩選和鑑定以來源於西藏阿里地區藏民家中自然發酵酥油為樣品，稱取1g樣品溶解到9ml 0.85%無菌生理鹽水中，震蕩使其充分混勻，吸取200μl混合液分別塗布於商業mrs（桿菌分離）和m17（球菌分離）固體培養基，於37℃恆溫培養箱中培養72h。培養結束後，挑取不同菌落形態的單菌，分別在對應固體培養基上劃線分純，此步驟重複2-3次，直至菌落特徵一致。將已純化單菌接種於相應液體培養基中在37℃下培養16h，用60%甘油保存，於-80℃冰箱凍存備用。
34.以2%的接種量將凍存管中的菌種接種於質量濃度12g/100ml滅菌脫脂乳中，於37℃培養48h進行活化，再連續傳代3次，初步篩選每代均能凝乳且凝乳結構良好菌株，得到3株單菌，分別為鏈球菌s6、長桿菌83和桿菌253。將初篩菌株接種於7.0%蛋白含量的脫脂復原乳發酵72h，測試發酵乳ph和酸度，結果表1所示。從表1中可知，桿菌253發酵乳ph最低，酸度為555
°
t，顯著高於鏈球s6和長桿菌83產酸能力，因此將桿菌253重新標記為wfp20。
35.表1. 初篩獲得的三株菌發酵72h的ph和酸度菌株原始編號ph滴定酸度（
°
t）桿菌2533.49555鏈球菌s63.83193長桿菌833.533272、形態學特徵經過鏡檢，菌株wfp20形態學特徵如圖1和圖2所示。從圖中可知，菌株wfp20在固體培養基上菌落為乳白色，中等大小，中間凸起呈類圓形，直徑1-2mm，邊緣不光滑；革蘭氏染色陽性，在油鏡下菌體呈杆狀，長短不均一，少彎曲鮮分叉，成單，成雙或成串存在。
36.3、菌株16s rdna鑑定將上述保存的菌株wfp20凍存管低溫送至上海生工生物工程有限公司進行序列測定，菌株wfp20的16s rdna的核苷酸序列如核苷酸序列表的序列1所示。blast比對結果表明，菌株wfp20與lacticaseibacilluscasei同源性超過99%，因此鑑定其為乾酪乳酪桿菌，
命名為乾酪乳酪桿菌wfp20。
37.將篩選得到菌株wfp20進行菌種保藏，其保藏單位為：廣東省微生物菌種保藏中心（gdmcc）；地址：廣東省廣州市越秀區先烈中路100號；保藏日期：2022年6月30日；乾酪乳酪桿菌wfp20保藏編號為gdmcc no. 62586。
38.實施例2、乾酪乳酪桿菌wfp20生理生化特徵1、產酸特性將乾酪乳酪桿菌wfp20凍存管按2%接種量接種於質量濃度12g/100ml脫脂復原乳中，37℃恆溫培養16h，連續活化3代，以4%接種量接種於6.0%蛋白含量的脫脂復原乳進行發酵。採用法國icinac乳發酵監測儀測試其在發酵48h過程中每2h的產酸性能，評價產酸特性（產酸速度和後酸化水平）。
39.結果如圖3所示，乾酪乳酪桿菌wfp20在前6h產酸速度較慢，ph僅降低0.2，隨後進入快速產酸期，發酵乳ph在14h從5.6迅速降至3.9左右。在20-48h產酸速度逐漸趨緩，但仍有較強繼續產酸能力，使發酵乳ph從3.9降至3.39，後酸化水平一般。
40.2、模擬胃液和模擬腸液耐受性將乾酪乳酪桿菌wfp20凍存管按2%的接種量接種於商業mrs液體培養基中活化傳代3次獲得菌液。在4℃、4000
×
g條件離心10min收集菌體，用無菌水洗滌2次等體積重懸於模擬胃液或模擬腸液；在模擬胃液和模擬腸液中分別孵育30、60、90和300min。取重懸液10倍梯度稀釋後傾注於mrs瓊脂培養基平板，37℃培養48h進行活菌計數，計算菌株存活率。其中，模擬胃液配方為：氯化鈉2.0g/l、濃鹽酸7mg/l、無菌超純水、ph 2.0；模擬腸液配方為：磷酸二氫鉀6.8g/l、0.2n氫氧化鈉77mg/l、ph 6.8
±
0.1。菌株存活率的存活率按如下公式計算：菌株存活率（%）＝b1/b0×
100其中，b0為菌懸液初始菌數/（cfu/ml）；b1為模擬胃液或腸液處理後菌數/（cfu/ml）。
41.結果如圖4所示，乾酪乳酪桿菌wfp20對ph2.0模擬胃液和ph6.8
±
0.1模擬腸液有較好耐受性，菌體在模擬胃液中30min存活率為91.54%，而在模擬腸液中5h存活率為100%，表明乾酪乳酪桿菌wfp20能較好在腸道中定植。
42.實施例3、乾酪乳酪桿菌wfp20菌粉生產及儲存穩定性1、菌粉生產將乾酪乳酪桿菌wfp20凍存管按2%接種量接種於商業mrs液體培養基中活化傳代3次，再以4%接種量接種於改良mrs液體培養基進行擴大培養，以氨水作為中和液，恆定ph5.5，37℃培養15h得到發酵液；在4-10℃離心20min收穫菌泥，將菌泥與凍幹保護劑以1:1.2質量比充分混勻，製成乳化液，經真空冷凍乾燥後獲得乾酪乳酪桿菌wfp20凍幹菌粉，菌粉生產結果如表2所示，各工藝階段指標表明乾酪乳酪桿菌wfp20具有極好生產經濟效益。
43.表2. 乾酪乳酪桿菌wfp20凍乾粉的生產結果
2、菌粉儲存穩定性取乾酪乳酪桿菌wfp20凍幹菌粉1g裝入雙層鋁箔袋，真空密封，放置於37℃、43%rh恆溫條件儲存，分別於0、15、30、45、60、75和90d取樣，參照gb 4789.35—2016《食品安全國家標準食品微生物學檢驗乳酸菌檢驗》測定活菌數，菌粉存活率如圖5所示，乾酪乳酪桿菌wfp20儲存穩定性較好，在90d菌粉存活率為43.07%，說明該菌種的存儲穩定性很高，能夠耐受較高的存儲溫度，並可實現交上時間的存儲，為該菌株在生產、貯藏、運輸、銷售乃至消費的各個環節提供了較為寬鬆的應用條件。
44.實施例4、乾酪乳酪桿菌wfp20生產酸乳飲料稱取脫脂奶粉180g、濃縮乳清蛋白13.5g、葡萄糖45g，加水至900g溶解（55℃，15min），均質（60~65℃，25mpa），定容至1000ml，殺菌（95℃，240min），冷卻至37℃按3
×
107cfu/g接種乾酪乳酪桿菌wfp20，發酵至550
°
t破乳、均質（15~20mpa）待用。稱取羧甲基纖維素鈉4g、果膠3g、檸檬酸鈉1g加水溶解（85℃，40min），與澱粉9g、白砂糖400g、酸奶1000g混合均勻後加入23.91g檸檬酸調整酸度至220
°
t，定容至4000ml，熱灌裝（95℃，30s）經噴淋隧道殺菌（85~87℃，≥16min）製成酸乳飲料。
45.利用乾酪乳酪桿菌wfp20生產酸乳飲料，口感細膩，風味濃鬱，在37℃條件保存180d，不析水（如圖6所示）。在相同條件下，與科漢森公司市售酸乳發酵劑乾酪乳酪桿菌01、乾酪乳酪桿菌431的效果相比，乾酪乳酪桿菌wfp20產酸量最高，其能夠有效降低調配過程中加酸量對體系破壞，使離心沉澱率最低，產品結構最穩定。
46.表3. 含乾酪乳酪桿菌wfp20的酸乳飲料離心沉澱率菌株滴定酸度（
°
t）酸添加量（g）離心沉澱率%乾酪乳酪桿菌wfp2055523.910.9%乾酪乳酪桿菌0138036.231.3%乾酪乳酪桿菌43142333.121.25%實施例5、乾酪乳酪桿菌wfp20對糞便中有機酸含量、雙歧桿菌數量和便秘的影響1、供試樣品1g/袋含乾酪乳酪桿菌wfp20固體飲料（麥芽糊精0.39g、低聚半乳糖0.32g、菊粉0.17、木糖醇0.1g、乾酪乳酪桿菌wfp20 0.02g）和安慰劑為供試樣品，樣品中含乾酪乳酪桿菌wfp20不低於1.5
×
10
10
cfu/g，安慰劑不含乾酪乳酪桿菌wfp20，其它配方與供試樣品一致。
47.2、研究計劃及攝入劑量市購40隻清潔級大鼠，並採用複方地芬諾酯灌胃法構建大鼠便秘模型。構建方法是將市售的複方地芬諾酯，研磨成粉後，按照15mg/kg的劑量給經過12h禁食後的大鼠灌胃，每日一次，給藥周期為6周，造模成功標準為給藥後小鼠具有明顯減少排便次數、粒數或乾粉狀糞便等。將構建好的便秘實驗鼠隨機平分兩組，採用雙盲、安慰劑對照交叉方法，63d實
驗周期包括14d未攝入1期、14d攝入1期（供試樣品、安慰劑）、21d未攝入2期、14d攝入2期（供試樣品、安慰劑），實驗設計見表4，對比方法：供試樣攝入1期（1st week）與未攝入1期、供試樣攝入1期（2nd week）與未攝入1期、供試樣攝入1期（1st week）與安慰劑攝入1期（1st week）、供試樣攝入1期（2nd week）與安慰劑攝入1期（2nd week）、安慰劑攝入2期（1st week）與未攝入2期、安慰劑攝入2期（2nd week）與未攝入2期、安慰劑攝入1期（1st week）與未攝入1期、安慰劑攝入1期（2nd week）與未攝入1期、供試樣攝入2期（1st week）與未攝入2期、供試樣攝入2期（2nd week）與未攝入2期；在攝入期要求實驗鼠保持正常飼餵方式，實驗鼠樣品用量為1g/d。
48.表4.實驗設計第一組第二組實驗鼠（20隻）實驗鼠（20隻）未攝入1期未攝入1期供試樣攝入1期（1stweek）安慰劑攝入1期（1stweek）供試樣攝入1期（2ndweek）安慰劑攝入1期（2ndweek）未攝入2期未攝入2期安慰劑攝入2期（1stweek）供試樣攝入2期（1stweek）安慰劑攝入2期（2ndweek）供試樣攝入2期（2ndweek）3、研究方法和結果（1）.hplc測定糞便中有機酸取2g糞便樣品，加100ml提取液（檸檬酸5.91g/l、磷酸氫二鈉2.38g/l、乙腈500ml/l），旋渦震蕩60s，超聲提取15min，於10℃、8000r/min離心10min，上清液用超純水配製成20mg/ml樣品溶液，用0.22μm濾膜過濾待用。
49.準確稱取乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、琥珀酸、乳酸、甲酸、戊酸和異戊酸各10mg，用超純水溶解定容至100ml棕色容量瓶，配製100mg/l混合標準液，再將有機酸混合標準液配製成濃度為0.01、0.05、0.10、0.50、1.00、5.00mg/ml有機酸混合標準液，用0.22μm濾膜過濾連續進樣進行測定。
50.色譜柱為agilent zorbax sb-c18液相色譜柱，流動相為15mm高氯酸和7%乙腈溶液，流速1.0ml/min，柱溫42℃，進樣量5μl，等梯度洗脫，紫外檢測器波長210nm。
51.實驗結果見表5，攝入含乾酪乳酪桿菌wfp20樣品14d，實驗組小鼠糞便中乙酸和異戊酸含量顯著高於未攝入期和安慰劑組，實驗組的丙酸含量顯著高於未攝入期，結果表明乾酪乳酪桿菌wfp20能促進腸道有機酸的產生。結果表明作為益生菌的乾酪乳酪桿菌可能產生短鏈脂肪酸，降低腸道ph值，促進腸道蠕動，進而減少腸道運轉時間，有利於改善便秘。
52.表5. 糞便中有機酸濃度
*表示與非攝入期相比具有顯著性差異（p《0.05）；#表示供試樣與安慰劑相比具有顯著差異（p《0.05）（2）. 糞便中雙歧桿菌相對表達量測定qpcr在 dna 擴增反應中，以螢光標記寡核苷酸，利用螢光信號的變化實時監測聚合酶鏈式反應（pcr）中每個循環擴增產物量的變化，通過內參法對待測樣品中特定 dna 序列進行定性或定量分析，操作如下：1）糞便總rna提取按照上海碧雲天trizol試劑盒說明操作；2）雙歧桿菌特異性引物設計、合成由上海生工生物工程有限公司完成；3）取1）中rna 1μl加入到491μlrnase-free water中進行50倍稀釋，充分混勻後通過微量分光光度計檢測rna濃度和純度。a260/a280作為核酸檢測指示值，比值位於1.9~2.1之間表明rna純度較高，可進行後續試驗；4）rna反轉錄成cdna按照南京諾唯贊hiscriptlllall-in-one rt supermix perfect for qpcr試劑盒說明操作，按反應程序50℃反應15 min，85℃反應5s，得到cdna於-30~-15℃密封保存；5）qpcr反應體系（20μl）和條件按南京諾唯贊taq pro uninersal sybr qpcr master mix預混液說明操作：2
×
taq pro uninersal sybr qpcr master mix，10μl；10μmol/l上遊、下遊引物各0.4μl0.4μl；模板（cdna）2μl；用無菌超純水補足，qpcr反應條件見表6。
53.表6. qpcr擴增條件stage1預變性reps:195℃30secstage2循環反應reps:4095℃10sec
ꢀꢀꢀ
60℃30secstage3融解曲線reps:195℃15sec
ꢀꢀꢀ
60℃60sec
ꢀꢀꢀ
95℃15sec6）以gapdh為內參基因，根據公式2
‑△△
ct
計算目的基因mrna相對表達量圖7顯示qpcr擴增曲線c
t
值21~28，熔解曲線單峰，說明c
t
值有效，無非特異性擴增產物。實驗結果見表7，攝入含乾酪乳酪桿菌wfp20樣品7d，實驗組雙歧桿菌相對表達量顯著高於未攝入期，而安慰劑組雙歧桿菌相對表達量顯著高於未攝入期可能與攝入低聚半乳糖和菊粉，促進腸道雙歧桿菌生長有關；攝入含乾酪乳酪桿菌wfp20樣品14d，實驗組雙歧桿菌相對表達量顯著高於未攝入期和安慰劑組，均表明攝入乾酪乳酪桿菌wfp20可顯著提高腸道雙歧桿菌數量。有大量研究表明便秘人群雙歧桿菌、乳桿菌、厭氧菌等有益菌較健康人群下調，並且雙歧桿菌和乳桿菌等能提高短鏈脂肪酸產量，改善便秘症狀，因此實驗結果說明乾酪乳酪桿菌提高雙歧桿菌數量的同時可能間接提高有機酸含量，與表1中實驗結果一致，均起到緩解便秘作用。
54.表7. 糞便中雙歧桿菌相對表達量*表示與非攝入期相比具有顯著性差異（p《0.05）；#表示供試樣與安慰劑相比具有顯著差異（p《0.05）（3）排便頻率的測定結果見表8，攝入含乾酪乳酪桿菌wfp20樣品7d，實驗組每周排便頻率、每周排便天數顯著高於未攝入期。攝入含乾酪乳酪桿菌wfp20樣品14d，實驗組每周排便頻率極顯著高於未攝入期，顯著高於安慰劑組；實驗組每周排便天數，顯著高於未攝入期。實驗結果說明乾酪乳酪桿菌wfp20可明顯提高排便頻率，並且攝入其14d具有更好改善便秘效果。
55.表8. 不同實驗組排便頻率情況*表示與非攝入期相比具有顯著性差異（p《0.05）；**表示與非攝入期相比具有極顯著性差異（p《0.01）；#表示供試樣與安慰劑相比具有顯著差異（p《0.05）
儘管已經示出和描述了本發明的實施例，對於本領域的普通技術人員而言，可以理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換和變型，本發明的範圍由所附權利要求及其等同物限定。