一種特異性人肺癌核酸適配體、篩選方法及其應用與流程

2024-04-14 20:10:05

1.本技術涉及生物醫學領域，具體公開了一種特異性人肺癌核酸適配體、篩選方法及其應用。


背景技術：

2.近50年來隨著吸菸者年齡的降低，大氣汙染等環境影響，肺癌是發病率和死亡率增長最快，對人群健康和生命威脅最大的惡性腫瘤之一。許多國家都報導肺癌的發病率和死亡率均明顯增高，男性肺癌發病率和死亡率均佔所有惡性腫瘤的第一位，女性發病率佔第二位，死亡率佔第二位。肺癌患者早期無症狀或症狀不明顯。甚至肺癌轉移患者常以頭痛、嘔吐、面神經麻痺、偏癱、視物模糊、失語、肌肉無力等為首發症狀而被誤診為腦血管病、原發性腦腫瘤、結核性腦膜炎或顱內高壓等。因此早發現、早診斷和早治療仍然是提高患者生存期的最有效途徑。而在癌症患者的癌變組織、血液、唾液、粘液中存在特定的靶標分子，因此，針對這些靶標分子發展能高靈敏度、高特異性識別肺癌細胞的適配體，無疑為對癌症患者的精確診斷與精準治療提供了新的解決思路與方案。
3.指數富集的配基系統進化技術，簡稱selex(systematic evolution of ligandsby exponential enrichment)技術，是近十幾年迅速發展起來的高通量生物文庫篩選技術。應用大容量的隨機寡核苷酸適配體文庫(ssdna或rna)，結合實時螢光pcr技術，篩選出逐步富集的寡核苷酸，經反覆體外篩選、擴增，最終獲得與靶標分子結合呈高特異性、高親和力的寡核苷酸適配體。
4.核酸適體(nucleic acid a ptamers)是採用指數富集配體的系統進化技術(selex)從隨機單鏈核酸庫中篩選出的能與不同靶分子高特異性、高親和力結合的單鏈dna或rna。核酸適體通過特定的空間構象，與靶分子相互作用而發生特異性結合，與抗原-抗體結合的原理相似且與靶分子的親和力可與抗原-抗體相當。通過指數富集配體的系統進化技術(selex)能夠篩選出對應大多數靶蛋白的適體。然而，越來越多的證據表明，針對純化的膜蛋白篩選出來的適體在細胞狀態下失去識別靶蛋白的能力。
5.細胞selex(cell-selex)是將整個細胞作為靶標篩選特異性核酸適體的技術。通常是將相應較單一細胞系被用作靶標，以獲得可將靶細胞從其他細胞中區分開的核酸適體。這種方法存在易操作、快速、成本低等優點。但是，採用較單一細胞系篩選出來的適體往往對血液、唾液、粘液這些易取待檢測樣本的特異性較差，即這些待檢樣本中任何高表達水平的蛋白質都可能是適體的靶分子。
6.淋巴細胞(lymphocyte)是白細胞的一種，是體積最小的白細胞。其由淋巴器官產生，主要存在於淋巴管中循環的淋巴液中，是機體免疫應答功能核心，是淋巴系統幾乎全部免疫功能的主要執行者，是對抗外界感染和監控體內細胞變異的一線「士兵」。而癌症患者首先是自身免疫功能失常，即以淋巴細胞為首的免疫細胞功能失常。在不同組織癌變細胞轉移至淋巴系統會引起差異化的癌變淋巴細胞的理論基礎上，本技術發明人用不同的癌變細胞和正常細胞篩選出具有特異性的核算適配體。
7.胃癌轉移特性：淋巴結轉移是胃癌最主要的一種轉移方式，常見的轉移部位是腹腔、胃左動脈旁以及腹腔動脈旁的淋巴結，也有一部分容易轉移到胃小彎。
8.肺癌轉移特性：淋巴道轉移是肺癌最常見的轉移途徑。癌細胞經支氣管和肺血管周圍的淋巴管，先侵入鄰近的肺段或葉支氣管周圍淋巴結，然後到達肺門或隆突下淋巴結，再侵入縱隔和氣管旁淋巴結，最後累及鎖骨上或頸部淋巴結。
9.乳腺癌轉移特性：當乳腺癌發生癌細胞脫落，可侵犯周圍淋巴管，並向其局部淋巴引流區轉移。初期患者多表現為同側腋窩淋巴結腫大，腫大的淋巴結尚可活動。隨後，淋巴結由小變大、由少變多，最後相互融合固定。當病情繼續發展，可在鎖骨上和對側腋窩摸到轉移的淋巴結。
10.肝癌：可分為原發性和繼發性兩大類。原發性肝臟惡性腫瘤起源於肝臟的上皮或間葉組織，是我國高發的，危害極大的惡性腫瘤；肝癌容易經血液轉移，最常見的轉移部位是肺。
11.由此可見，肺癌、乳腺癌、肝癌具有相似的侵襲特性，那就是容易轉移至淋巴或血液從而進入循環系統。特別是肝臟和肺臟，他們都是人體的主要代謝器官，特別容易相互轉移。因此能夠在發病早期，特異性識別他們就顯得尤為重要，例如能夠將他們特異性區分開無疑會為靶向治療指明方向。


技術實現要素：

12.為了解決上述問題，本技術提供了一種特異性人肺癌核酸適配體、篩選方法及其應用，以解決上述背景技術中提出的問題。
13.為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：
14.一種特異性人肺癌核酸適配體，核酸適配體的核苷酸序列是指如下序列所示的dna片段：序列seq id no.1：5
』‑
tatagttctatgagcatt，atactgaaacattgactgggctgttcttctgt-3』，其對應rna具有5
』‑
uauaguucuaugagcauuauacugaaacauugacugggcuguucuucugu-3』序列。
15.或(2)在嚴格條件下能夠與seq id no:1所示的dan序列雜交且具有特異性結合人肺癌細胞功能的核酸適配體；或與seq id no:1所示的核苷酸序列有85％以上(更佳地90％以上；進一步更佳地95％以上)相同性且具有特異性結合人肺癌細胞功能的核糖核酸適配體；
16.或(3)seq id no:1所示的核苷酸序列的截短體，且具有特異性結合人肺癌細胞功能的核糖核酸適配體；
17.或核苷酸序列與(1)-(3)任一限定的核糖核酸適配體的核苷酸序列互補的核糖核酸適配體。
18.在本發明的了另一方面，提供所述的核糖核酸適配體的用途，用於製備特異性肺癌靶向治療藥物。
19.進一步的，上述核酸適配體用於人肺癌細胞的識別以及應用在製備早期診斷人肺癌試劑盒中。
20.進一步的，本技術還提供了一種核酸適配體的篩選方法，利用cell-selex技術原理篩選獲得所述寡核苷酸適配體的序列，具體的以肺癌細胞、肺癌腋下淋巴轉移細胞培養
液為正篩靶標，以肺上皮細胞、乳腺癌細胞、胃癌細胞、肝癌細胞為反篩靶標，經過多輪反覆孵育，洗脫，擴增，篩選出適配體序列s-9。並用肺癌血清、健康血清、乳腺癌血清、胃癌血清、肝癌血清對所得適配體的特異性和親和力進行驗證。結果發現，本技術核酸適配體表現出對肺癌血清具有高親和力的特性，同時還鑑定出本技術核酸適配體與肺癌血清具有很強的特異性。
21.更具體的本方法包括如下步驟：
22.s1合成以下序列所示的隨機單鏈dna文庫和引物
23.隨機文庫：
[0024]5』‑
cactaatacgactcactaggagagacaatgacctngagtgcattgcatcacgtcagtag-3』(seq id no:2)
[0025]5』
引物：5-fam-cactaatacgactcactaggagagacaatg-3』(seq id no:3)；
[0026]3』
引物：5
』‑
biotin-ctactgacgtgatgcaatgcactc-3』(seq id no:4)。
[0027]
s2文庫處理條件：隨機初級文庫及每輪篩選所得文庫，用depc水溶解，90℃變性15min後立即冰浴10min，使ssdna恢復三維空間結構。
[0028]
s3正篩：將所述正選肺癌人肺癌細胞a427和zzfa分別與隨機ssdna文庫混合進行陽性孵育，37℃旋轉孵育2h，去除未與所述正選細胞繫結合的ssdna，得到正向篩選的適配體文庫。
[0029]
s4反篩：將經過兩種正選細胞正選過的正向篩選適配體文庫與反篩細胞共同孵育，37℃旋轉孵育2h，得到反篩適配體文庫。反篩細胞包括正常人肺上皮細胞hlf-a、人乳腺癌細胞efm-192a、人胃腺癌細胞snu-1、人肝癌細胞heparg，他們之間不存在篩選先後順序。
[0030]
s5：pcr擴增所述反向篩選的適配體文庫，並製備ssdna候選物文庫；
[0031]
s6：將所述ssdna候選物文庫代替所述隨機ssdna文庫返回步驟(2)並循環進行步驟s2至s5的操作。
[0032]
為了達到理想的篩選效果，步驟s5中，步驟s3至s5的循環次數可以為4～30輪，直到所得ssdna候選物文庫與正選細胞的結合力達到飽和即可終止篩選。
[0033]
與現有技術相比，本發明的有益效果是：
[0034]
1、本技術最為突出首要的有益效果為從均具有淋巴、血液轉移特性的的肺癌、胃癌、肝癌患者中特異性選擇肺癌患者。
[0035]
2、本技術通過cell-selex技術篩選得到的核酸適配體，具有可人工合成、核酸鏈短、結構功能完整、簡單、親和力高、特異性強，能更好的與肺癌患者檢測樣本結合。
[0036]
3、本技術的核酸適配體進行肺癌細胞檢測時，操作簡潔方便、成本低、周期短、準確性高等優點，利用本發明的核酸適配體對其結合的靶分子進行研究，可以得到肺癌特異性腫瘤標誌物，這對於的早期診斷、分期分析等方面應用提供了一種有效的工具和手段。
[0037]
4、本技術的核酸適配體為製備肺癌靶向藥物提供了新的藥物載體。
附圖說明
[0038]
圖1mfold軟體對本技術的序列進行二級結構模擬後的結構示意圖。
[0039]
圖1-1至圖1-3為mfold軟體對本技術的序列進行二級結構模擬後生成的三種可能結構圖。
[0040]
圖2為肺癌血清候選核酸適配體seq-9與靶標結合的kd解離常數。
[0041]
圖3為肺癌核酸適配體與靶標結合的特異性驗證。
[0042]
圖3-1為13例肺癌血清陽性平均ct值與13例健康受試者平均ct值比較圖。
[0043]
圖3-2肺癌血清陽性平均ct值與13例乳腺癌患者平均ct值比較圖。
[0044]
圖3-3肺癌血清陽性平均ct與13例胃癌患者平均ct值比較圖。
[0045]
圖3-4肺癌血清陽性平均ct與13例肝癌患者平均ct值比較圖。
具體實施方式
[0046]
下面將結合本技術附圖對本技術的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，實施例僅是本技術技術方案的代表，而不是全部技術方案。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他技術方案，都屬於本發明保護的範圍。
[0047]
實驗材料來源：
[0048]
本技術中除特殊說明之外，各實驗材料均為市售產品。
[0049][0050]
人肺癌腋下淋巴轉移細胞，用代號zzfa表示，供者，女，56歲，暨南大學附屬復大腫瘤醫院，培養條件：dmem高糖培養基(不含丙酮酸鈉)+10％fbs+1％三抗+溫度37℃培養，二氧化碳濃度5％，貼壁培養，倍增時間40h。
[0051]
實施例1適配體的製備
[0052]
隨機文庫：
[0053]5』‑
cactaatacgactcactaggagagacaatgacctngagtgcattgcatcacgtcagtag-3』(seq id no:2)
[0054]5』
引物：5-fam-cactaatacgactcactaggagagacaatg-3』(seq id no:3)；
[0055]3』
引物：5
』‑
biotin-ctactgacgtgatgcaatgcactc-3』(seq id no:4)。
[0056]
將上述隨機ssdna文庫用depc水溶解，90℃變性15min後立即冰浴10min，使ssdna恢復三維空間結構。在100mm培養皿中與正選細胞混合進行陽性孵育，在37℃下培養2h。
[0057]
除去上清液，用洗滌緩衝液洗滌細胞並轉移至500μl水中，在95℃加熱10min收集得到細胞結合的dna。將該細胞結合的dna用作模板，用fam標記的正向引物和生物素標記的反向引物通過pcr製備進化的dna庫(95℃，30秒，60℃，30秒，70℃，30秒，70℃，5分鐘，5～15個循環)。然後通過鏈黴親和素磁珠將dsdna產物與pcr溶液分離。在用0.2m naoh處理後，將fam標記的ssdna與另一條鏈分離，脫鹽並凍幹用於下一輪篩選。從第三輪開始，首先將上一輪得到的ssdna文庫與60mm培養皿中的反選細胞系混合進行陰性孵育，在4℃下培養1h。然後收集未結合的ssdna並將其應用於正選細胞。隨著選擇輪數的增加，陽性孵育時間從2h縮短至1h，洗滌時間也延長為2～3倍；同時，陰性孵育時間從0.5h逐漸增加到2h。循環15輪後，將從富集最後一輪的ssdna文庫進行pcr擴增，然後使用進行高通量測序。
[0058]
本技術的核酸適配體的序列如下(seq id no:1)：
[0059]
seq id no.1：5
』‑
tatagttctatgagcattatactgaaacattgactgggctgttcttctgt-3』。用mfold軟體對本技術的核酸適配體進行二級結構模擬，結構模擬後有三種可能的結構示意圖如圖1所示。
[0060]
實施例2通過螢光標記法檢測核酸適配體s-9與肺癌血清的結合能力
[0061]
(1)血清的處理：按血清：水：乙腈＝1：2：1(體積比)配製，水浴超聲5min，15000g，離心30min，棄去沉澱，收集上清。
[0062]
(2)根據步驟(1)所述的方法將已處理過的肺癌血清和磁珠37℃旋轉孵育2h，形成磁珠-血清複合物。
[0063]
將適配體用fam標記，配置等體積不同濃度梯度的帶fam標記的核酸適配體，並分別與磁珠-血清複合物37℃旋轉孵育0.5h，pbs洗3次，以去除與非靶標蛋白非特異結合的核酸適配體。
[0064]
(3)將步驟(2)中與核酸適配體孵育後的磁珠-血清複合物重懸於超純水中，加入微孔板中，使用多功能酶標儀在450nm處進行螢光測定，螢光值-適配體濃度曲線，結果如圖2所示，得到核酸適配體s-9的平衡解離常數(kd)為kd＝10.287
±
3.23nm。
[0065]
實施例3通過pcr法驗證核酸適配體s-9與肺癌血清的特異識別
[0066]
(1)血清的處理：按血清：水：乙腈＝1：2：1(體積比)配製，水浴超聲5min，15000g，離心30min，棄去沉澱，收集上清。
[0067]
(2)按步驟(1)所述方法將已處理過的肺癌血清、健康血清、乳腺癌血清、胃癌血清、肝癌血清分別與磁珠37℃旋轉孵育2h，形成磁珠-肺癌、磁珠-健康、磁珠-乳腺癌、磁珠-胃癌、磁珠-肝癌血清複合物。
[0068]
(3)將適配體進行濃度比例稀釋，分別與磁珠-肺癌血清、磁珠-健康、磁珠-乳腺癌、磁珠-胃癌、磁珠-肝癌血清複合物於37℃旋轉孵育0.5h。
[0069]
(5)pbs洗5次，加10μl超純水95℃高溫變性5min，收集上清，進行pcr檢測(pcr條件如實施例1所示)。將肺癌患者ct值降序排列，與其他對照患者的ct值升值排列進行對比，結果如表1和圖3所示。
[0070]
表1為肺癌核酸適配體與靶標結合的特異性驗證ct值
[0071][0072]
由表1和圖3可以看出，雖然樣本數量有限，但是可以明顯看出13例肺癌血清陽性ct值平均顯著小於健康、乳腺癌、胃癌、以及肝癌患者的ct值，由此可以得出適配體s-9對肺癌血清具有強特異性結合能力。
[0073]
本具體實施例僅僅是對本技術的解釋，其並不是對本技術的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施例做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本技術的權利要求範圍內都受到專利法的保護。