浮萍LtP1-L基因在調控浮萍葒草素、異葒草素表達中的應用
2024-04-15 20:19:05 2
浮萍ltp1-l基因在調控浮萍葒草素、異葒草素表達中的應用
技術領域
1.本發明涉及浮萍ltp1-l基因在調控浮萍葒草素、異葒草素表達中的應用，具體涉及過表達浮萍ltp1-l基因在提高浮萍葒草素、異葒草素表達量中的應用，屬於基因工程技術領域。
背景技術：
2.類黃酮化合物是一類天然的植物次生代謝產物，由於它具有抗氧化、抗增生、抗癌、抗病毒和消炎等功效，目前被廣泛應用於製藥、食品飲料、膳食補充劑和化妝品添加劑等領域，具有很高的經濟和社會價值。隨著我國經濟的持續高速發展，國民生活、醫療和健康水平得到不斷提升，市場對類黃酮化合物的需求量也在逐年攀升。類黃酮化合物廣泛存在於各類植物中，包括芸香科、銀杏科、豆科、唇形科和菊科植物等。目前，類黃酮化合物主要是依靠採集自然界中的植物資源進行提取獲得，提取的方法主要有傳統提取法、酶解提取法、超聲輔助提取等各種方法，或者是通過有效的化學手段進行合成。以上方法各有優缺點，但都有提取或合成效率較低，成本較高，容易產生二次汙染等不足之處。利用基因工程技術表達外源生產黃酮的研究尚未見報導。
3.葒草素具有抗菌抗病毒、抗炎鎮痛、神經保護和心臟保護等作用，在臨床上有廣泛的應用。異葒草素是一種木犀草素糖苷類黃酮化合物，存在於多種藥用植物中。異葒草素具有多種藥理活性，如抗氧化、抑制炎症發展、改善胰島素抵抗、弱化肝纖維化發展以及誘導肝癌細胞凋亡等。目前，市場上的類黃酮化合物葒草素和異葒草素主要是通過從植物中提取得到，生產成本較高，商業化的葒草素和異葒草素價格在800元/克。依靠採集自然界中的植物資源進行類黃酮化合物提取的方法，已無法滿足日益增長的市場需求。因此，尋求易於規模化和自動化生產類黃酮化合物的方法是亟待解決的重要課題。
4.浮萍是一種以漂浮為生的高等水生被子植物，是世界上最小的開花被子植物，浮萍作為一種非糧水生植物，具有生長速度快，易繁殖，生產成本低等優勢，並可以實現澱粉及蛋白含量的快速積累。浮萍中含有類黃酮物質葒草素和異葒草素，但其含量很低，葒草素含量為0.38mg/g乾重，異葒草素含量為0.80mg/g乾重。
技術實現要素：
5.針對上述現有技術，為提高浮萍中類黃酮物質葒草素和異葒草素的含量，本發明通過研究，發現過表達浮萍ltp1-l基因，可以有效提高葒草素和異葒草素的表達量。
6.本發明是通過以下技術方案實現的：
7.浮萍ltp1-l基因在調控浮萍葒草素和/或異葒草素表達中的應用，所述浮萍ltp1-l基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。
8.浮萍ltp1-l基因的核苷酸序列如下(seq id no.1所示，方向為5
』‑3』
)：
9.atggggagagcgccttgctgcgagaaggacgggctgaagaaggggagatggactgcggaggaagacaagattctggcgaattatattcgagtcaatggagaaggttcatggagatcgctgccgaagaatgcaggacttcttcga
tgcgggaagagttgcaggctgagatggataaactacctcagatctgacttgaagagaggcaacatttctccggaagaggaggagatgatcgtccggcttcatacttctctcggaaacagatggtctctgatcgccgcccagctgcctgggaggacggataacgagatcaagaactactggaactcccatctgagccgtaggattcaccggtttaagagactcgacgggggcgatggctccacggtgatcgttgacctgagcaagatcgtcggaattccgtgccggcggcgaggaggaagaaaaaagatttcgccaatccaaagcgttgagcccgagagtaaaaaagtcgaccacaaggagatgctgatggagacggcgacgaacgagttgctgagcccgagttgggagagcggcgggtcgatgagctcgtgtacgacgagcgaggagaggaaagacgagccagttccgtcaaaggaaaaacagctctacgctcatggagaagagtgcaacagctctgcaacaacggagggagaaatgcttgacgtggactgggaagccatggctacgaagctttgggataatgacgagatggaggaaatgtggccatggctctgggataatagctcgcatggattccagctcaagtctcatctgcagccgccggagggtgggcaagaggagacagatctcggggaatggatcctctga。
10.進一步地，過表達浮萍ltp1-l基因在提高浮萍中葒草素和/或異葒草素的表達量中的應用。
11.更進一步地，具體應用方式為：將浮萍ltp1-l基因導入浮萍基因組中，使浮萍ltp1-l基因過表達，從而得到葒草素和/或異葒草素的表達量高於野生型植株的浮萍。
12.更進一步地，所述導入，是通過農桿菌介導的方式侵染浮萍愈傷組織。具體地，包括以下步驟：
13.(1)將浮萍ltp1-l基因連接於植物表達載體上，構建含浮萍ltp1-l基因的植物過表達載體；
14.所述浮萍ltp1-l基因是通過pcr擴增得到的，模板可以是浮萍基因組dna，也可以是cdna(通過提取得到浮萍總rna，然後反轉錄得到cdna)；擴增所用的特異性引物可以如下：
15.正向引物p1：5
』‑
atggggagagcgccttgctg-3』；如seq id no.3所示；
16.反向引物p2：5
』‑
tcagaggatccattccccgagatct-3』；如seq id no.4所示；
17.(2)將含浮萍ltp1-l基因的植物過表達載體轉化根癌農桿菌，再轉染浮萍愈傷組織。
18.浮萍ltp1-l蛋白在調控浮萍葒草素和/或異葒草素表達中的應用，所述浮萍ltp1-l蛋白的胺基酸序列如seq id no.2所示。
19.浮萍ltp1-l蛋白的胺基酸序列如下(seq id no.2)：
20.mgrapccekdglkkgrwtaeedkilanyirvngegswrslpknagllrcgkscrlrwinylrsdlkrgnispeeeemivrlhtslgnrwsliaaqlpgrtdneiknywnshlsrrihrfkrldggdgstvivdlskivgipcrrrggrkkispiqsvepeskkvdhkemlmetatnellspswesggsmsscttseerkdepvpskekqlyahgeecnssattegemldvdweamatklwdndemeemwpwlwdnsshgfqlkshlqppeggqeetdlgewil。
21.一種高表達葒草素和/或異葒草素的轉基因浮萍，通過以下方法獲得：將浮萍ltp1-l基因導入浮萍基因組中，使浮萍ltp1-l基因過表達，從而得到葒草素和/或異葒草素的表達量高於野生型植株的轉基因浮萍(基因工程植株)。
22.進一步地，所述導入是通過農桿菌介導的方式侵染浮萍愈傷組織。
23.一種製備葒草素和/或異葒草素的方法：將浮萍ltp1-l基因導入浮萍基因組中，使浮萍ltp1-l基因過表達，從而得到葒草素和/或異葒草素的表達量高於野生型植株的轉基因浮萍；培養該轉基因浮萍，提取獲得葒草素和/或異葒草素。
24.進一步地，培養浮萍得浮萍培養液，從培養液中提取獲得葒草素和/或異葒草素。
25.更進一步地，將浮萍從浮萍培養液中去除(撈出或過濾)，得培養水溶液，從培養水溶液中提取獲得葒草素和/或異葒草素。
26.更進一步地，利用含蔗糖的水溶液培養浮萍。含蔗糖的水溶液中，蔗糖的濃度為1～％(重量體積比，單位g/ml)，優選2％。
27.更進一步地，培養條件為：光周期16h/8h(光亮/黑暗)，25℃。
28.本發明通過研究發現，過表達浮萍ltp1-l基因，可以提高浮萍中類黃酮物質葒草素和異葒草素的表達量，且這兩種類黃酮物質可以在培養浮萍的水溶液中大量釋放，培養的水溶液中葒草素和異葒草素含量顯著升高，純度較高，雜質少。基因工程浮萍或者其水培溶液經過簡單處理後，即可運用到食品工業，保健品，化妝品、飼料生產等工業過程中。本發明的方法大大降低了葒草素和異葒草素的生產成本，具有廣泛的應用前景和較高的經濟價值。
附圖說明
29.圖1：不同植株中總黃酮含量對比示意圖。
30.圖2：不同植株中葒草素、異葒草素含量對比示意圖。
31.圖3：不同植株的水溶液中葒草素、異葒草素含量對比示意圖。
具體實施方式
32.下面結合實施例對本發明作進一步的說明。然而，本發明的範圍並不限於下述實施例。本領域技術人員能夠理解，在不背離本發明的精神和範圍的前提下，可以對本發明進行各種變化和修飾。
33.下述實施例中所涉及的儀器、試劑、材料等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規儀器、試劑、材料等，可通過正規商業途徑獲得。下述實施例中所涉及的實驗方法，檢測方法等，若無特別說明，均為現有技術中已有的常規實驗方法，檢測方法等。
34.實施例1浮萍ltp1-l基因的克隆
35.(1)浮萍培養：浮萍在人工氣候室培養，生長條件為光周期16h/8h(光亮/黑暗)，25℃。
36.(2)浮萍葉片總rna的提取：取100毫克左右幼嫩的浮萍葉片組織材，置於液氮中充分研磨至粉末狀，按照植物總rna提取試劑盒(全式金，北京)說明書的方法，提取葉片總rna；將取3μl總rna進行瓊脂糖凝膠電泳，鑑定總rna的質量，然後在nanodrop(thermo fisher，美國)分光光度計上測定總rna的濃度。
37.(3)基因的克隆：以提取的總rna為模板(500ng)，按照反轉錄試劑盒primescript 1st strand cdna synthesis kit(takara，大連)說明書的方法，反轉錄生產第一鏈cdna；通過設計的特異引物，以cdna為模板進行pcr擴增，特異引物序列如下：
38.正向引物p1：5
』‑
atggggagagcgccttgctg-3』；
39.反向引物p2：5
』‑
tcagaggatccattccccgagatct-3』。
40.pcr反應體系(總體積50μl)為：5μl 10
×
kod緩衝液，5μl dntps，4μl mgso4，1μl正向引物，1μl反向引物，1μl cdna模板，1μl kod酶，ddh2o補齊至50μl。
41.pcr擴增條件為：預變性95℃，3min，35個循環：95℃，30sec；54℃，30sec；68℃，100sec，最後68℃延伸5min。
42.將pcr產物進行回收純化。
43.通過上述方法，獲得了浮萍ltp1-l基因，其核苷酸序列如seq id no.2所示，推導出編碼的蛋白質的胺基酸序列如seq id no.1所示。
44.實施例2含浮萍ltp1-l基因的植物表達載體的構建
45.(1)植物表達載體pcambiazmubi1p經酶切進行線性化，再回收純化。
46.(2)在50℃條件下，使用同源重組酶(諾唯贊，南京)反應30min後，將浮萍ltp1-l基因重組到植物表達載體pcambiazmubi1p上。
47.(3)轉化大腸桿菌dh5α感受態細胞，進行陽性克隆pcr驗證，最終獲得包含有浮萍ltp1-l基因的pcambiazmubi1p-ltp1-l植物表達載體。
48.實施例3基因工程植株的獲得
49.(1)將構建好的pcambiazmubi1p-ltp1-l植物表達載體通過電擊的方式轉入農桿菌，再經pcr驗證獲得陽性農桿菌菌株。
50.(2)過夜培養的農桿菌搖至od
600
≈0.4，加入100μm的乙醯丁香酮，繼續培養2h，離心收集菌體，用轉化液重懸菌體至od
600
≈0.4，將浮萍愈傷組織轉入到菌液中，抽真空10min，超聲5min，再抽真空10min。將愈傷組織取出，鋪於濾紙上，避光暗培養3d後，再轉移至分化培養基上，後經篩選得到基因工程浮萍株系。
51.具體操作如下：將浮萍葉片平鋪於誘導培養基(含有4.52μm 2，4-d、0.45μm tdz和3％蔗糖的ms培養基)上，24℃避光培養3～4周後，出現愈傷組織。而後將愈傷組織轉移到新的誘導培養基上繼續培養4～5周，用於轉化。
52.將帶有浮萍ltp1-l基因的植物過表達載體的根癌農菌的單個菌落轉移到含有50mg/l卡那黴素和25mg/l利福平的液體lb培養基中。將培養物在28℃下振蕩(200rpm)生長，直到od
600
達到0.4。將新製備的100μm乙醯丁香酮(30，50二甲氧基-40-羥基苯酮，acros organics，morris plains，nj，usa)加入培養物中，並將混合物繼續振蕩2小時。然後2400g、離心15分鐘收集菌體，並重新懸浮在誘導培養基中。將重新懸浮的農桿菌的密度(od
600
)調整為約0.4，用於侵染浮萍愈傷組織。
53.將愈傷組織浸入350ml組織培養瓶中的農桿菌懸浮液中。將瓶子置於真空室中並施加真空10分鐘。然後，將瓶子置於浴式超聲波儀(branson超聲波清潔器cpx2800，branson ultrasonics corp.，danbury，ct，usa)中，然後在17℃下以40khz的頻率進行超聲波處理5分鐘。超聲處理後，將瓶子再次真空滲透10分鐘。釋放真空後，將愈傷組織塊和農桿菌輕輕搖動孵育30分鐘。培養後，通過將感染的愈傷組織塊轉移到用誘導培養基潤溼的濾紙上，並將其置於25℃黑暗中的空培養皿中進行共培養。共培養三天後，將感染的愈傷組織轉移到再生培養基(gamborg’s b5基礎培養基，補充4.65μm激動素、2.57μm吲哚-3-乙酸、1％蔗糖、9.48μm潮黴素(phytotechnology laboratories，shawnee mission，ks，usa)、600μm timentin並用7.9g/l瓊脂固化)上。在黑暗中的瓊脂上培養1周後，在約50μmol/m2/s白光的16小時光周期下培養愈傷組織4周。將再生的浮萍葉片轉移到保存培養基(含有0.6％蔗糖和300μm timentin的sh培養基，並用7.9g/l瓊脂固化)上，等待浮萍生長增殖。
54.實施例4基因工程植株中葒草素和異葒草素含量的測定
55.收集實施例3中培養2周的基因工程植株(共得到2個株系，分別命名為ltp1-lox-1和ltp1-lox-2)，凍幹後使用80％甲醇超聲提取總黃酮，再經hplc分析葒草素和異葒草素的含量。以培養未經轉染的愈傷組織得到的浮萍(野生型)為對照。
56.結果：如圖1、圖2所示，對於總黃酮，野生型的含量為6.06％(總黃酮的重量佔植物乾重的百分比)，ltp1-lox-1的含量為16.79％，ltp1-lox-2的含量為18.93％。對於葒草素，野生型中的含量為0.04％(葒草素的重量佔植物乾重的百分比)，ltp1-lox-1中的含量為0.29％、ltp1-lox-2中的含量為0.37％。對於異葒草素，野生型中的含量為0.08％(異葒草素的重量佔植物乾重的百分比)，ltp1-lox-1中的含量為0.53％、ltp1-lox-2中的含量為0.73％。可見，基因工程株系中總黃酮、葒草素和異葒草素的含量與野生型相比，總黃酮含量提高了2.5～3倍，葒草素、異葒草素的含量提高了6～10倍，有顯著提升。
57.實施例5基因工程植株培養液中葒草素和異葒草素含量的測定
58.將4克鮮重的野生型浮萍、ltp1-lox-1和ltp1-lox-2株系(各設置3組)放入20ml含有2％(重量體積比，單位g/ml)蔗糖的水溶液中培養，培養條件為光周期16h/8h(光亮/黑暗)，25℃。培養7d後，過濾去除浮萍，得培養水溶液。通過hplc分析培養水溶液中葒草素和異葒草素的含量。
59.結果：如圖3所示，野生型浮萍的培養水溶液中，葒草素的含量為0.84mg/l，異葒草素的含量為0.73mg/l；ltp1-lox-1中葒草素的含量分別為16.83mg/，異葒草素的含量分別為24.89mg/l；ltp1-lox-2中葒草素的含量分別為22.38mg/l，異葒草素的含量分別為30.54mg/l。可見，各株系的培養水溶液中葒草素和異葒草素的含量較高，可以直接從培養水溶液中提取得到葒草素和異葒草素，該發現為意外發現，相比從浮萍葉片中提取，大大簡化了提取步驟，提取成本大幅度降低。
60.給本領域技術人員提供上述實施例，以完全公開和描述如何實施和使用所主張的實施方案，而不是用於限制本文公開的範圍。對於本領域技術人員而言顯而易見的修飾將在所附權利要求的範圍內。