一種生物墨水的製備方法、細胞支架的製備方法
2024-04-14 01:03:05
1.本發明屬於醫用可降解材料製備技術領域，特別涉及一種生物墨水的製備方法、細胞支架的製備方法。
背景技術：
2.在我國70歲以上老人中約有80％患有骨關節炎，如何有效治療骨關節炎至今仍是一件非常棘手的問題。臨床中常見的治療手段有微骨折法和自體細胞移植術，都在一定程度上起到了緩解病症的作用，但不能完全代替天然軟骨。軟骨組織工程技術著眼於將損傷後的軟骨恢復到其天然狀態，將由生物材料、細胞和生長因子組合形成的三維立體支架植入軟骨缺損處，引導缺損部位軟骨組織重新生長。因此，生物墨水除了應具備良好的可塑性外，還應該起到在支架列印過程中保護細胞的作用。由生物墨水列印的組織工程支架應當複合天然軟骨特性的力學性以及可控的尺寸大小，支架的降解速率應該與軟骨組織的生長速率呈負相關。並且，支架作為細胞和其他生物活性因子的載體，還需要具有良好的生物相容性和互相連通的內部孔隙結構。
3.目前，公開號為cn 107744602 a的專利文獻公開了一種可用於3d列印的生物墨水材料的製備方法，所述製備方法主要包括改性海藻酸鈉的製備及生物墨水材料的製備。所述的一種可用於3d列印的生物墨水材料的製備方法由活性細胞，細胞培養基，光引發劑，改性海藻酸鈉及抗氧化酶組成。此生物材料與活性細胞具有良好的生物相容性，可實現活性列印。但是，所這種製備方法製備的生物墨水同時具有藥物突釋、剪切變稀特性差等問題。
技術實現要素：
4.針對上述技術問題，本發明提供了一種生物墨水的製備方法，使製備的生物墨水具有良好的剪切變稀特性和可塑性；本發明同時提供了細胞支架的製備方法，此方法製備的細胞支架具有藥物緩釋性好、空隙率高的優點。
5.本發明的上述技術目的是通過以下技術方案得以實現的：
6.一種生物墨水的製備方法，包括以下步驟：
7.s1:將乙醇滴加到絲素蛋白溶液中，攪拌均勻後將混合物冷藏，解凍後進行離心、乾燥得到絲素蛋白微球；
8.s2:將白藜蘆醇溶解於乙醇溶液中，再將步驟s1中得到的絲素蛋白微球置於白藜蘆醇與乙醇的混合溶液中，密封避光攪拌，攪拌完成後離心、乾燥，得到載藥微球；
9.s3:將明膠、海藻酸鈉和步驟s2中得到的載藥微球用梯度加熱法混合均勻，再將混合液與含atdc-5細胞的細胞懸液混合得到生物墨水。
10.進一步優選，步驟s1中所述的冷藏溫度為﹣20℃，冷藏時間為24h；步驟s1中的溫度條件為37℃，攪拌時間為24h，
11.進一步優選，步驟s1中所述的絲素蛋白溶液體積濃度為4.5％～5.5％，乙醇溶液與絲素蛋白溶液的體積比為1∶5～1∶9，乙醇溶液體積濃度大於99.8％。
12.進一步優選，所述絲素蛋白溶液的配製方法包括以下步驟：
13.s11:將蠶殼剪碎投入到質量濃度為0.05％的na2co3溶液中，加熱煮沸後，得到絲素纖維；
14.s12:將絲素纖維用去離子水搓洗，烘乾；
15.s13:將乾燥完成的絲素纖維放入9mol/l的溴化鋰溶液中，使絲素纖維完全溶解後，得到溶解液；
16.s14:將溶解液加入透析袋中，在去離子水中透析；
17.s15:將透析完成後的液體離心，去除不溶雜質，得到絲素蛋白溶液。
18.進一步優選，步驟s11中沸騰時間60～90min；步驟s12中搓洗5～6次，將雜質洗淨，烘乾溫度為60℃，烘乾時間為24h；步驟13中的溫度條件為60℃；步驟s14中透析袋的規格為截留分子量12kd，透析時間為72h，透析期間每隔3h換一次去離子水。
19.進一步優選，步驟s2中所述的乙醇溶液體積為1～1.5ml、白藜蘆醇質量為2～5mg、絲素蛋白微球質量為16～25mg、攪拌轉速為80～160rmp、乙醇溶液的體積濃度大於99.8％。
20.進一步優選，步驟s3中所述的梯度加熱法包括以下步驟：
21.s31:在去離子水中加入明膠，攪拌；
22.s32:攪拌完成後冷卻，加入海藻酸鈉和的去離子水，攪拌；
23.s33:攪拌完成後冷卻，加入去離子水、載藥微球超聲混合均勻；
24.s34:將混合完成的液體加入試管中，溫攪拌，攪拌完成後冷卻至室溫。
25.進一步優選，步驟s31中的攪拌溫度為80℃，攪拌時間為1h；步驟s32中的冷卻溫度為室溫，攪拌溫度為80℃，攪拌時間為1h；步驟s34中的試管用去2ml離子水洗淨，以保證材料濃度不變，攪拌溫度為40℃，攪拌時間為1h。
26.進一步優選，所述的明膠質量濃度為6.67％～8.88％，海藻酸鈉質量濃度為3.33％～5.62％，載藥微球質量濃度為0.33％～0.67％。
27.進一步優選，步驟s3中所述的明膠、海藻酸鈉和載藥微球按照原濃度兩倍混合，將明膠、海藻酸鈉和載藥微球的混合液與atdc-5細胞懸液以1∶1的體積比混合，製得生物墨水。
28.進一步優選，所述的atdc-5細胞懸液通過細胞培養、胰蛋白酶脫壁、稀釋後得到。
29.進一步優選，所述的atdc-5細胞懸液的細胞密度為2
×
106kg/m3。
30.一種細胞支架的製備方法，包括以下步驟：
31.s01:採用如權利要求1-8任一項所述生物墨水的製備方法所製備的生物墨水為原料；
32.s02:在計算機中構建模型，通過3d列印，在無菌的條件下列印出細胞支架。
33.進一步優選，所述的3d列印參數為：輪廓的填充速度10～15mm/s，噴頭跳轉速度60～70mm/s，擠料速度0.26～0.37mm/s，成型室溫24～28℃。
34.綜上所述，本發明具有以下有益效果：
35.1、本發明生物墨水的製備方法所製備的生物墨水具有良好的剪切變稀特性和可塑性，能夠在細胞支架列印過程中保證支架成型良好的同時，減少對細胞的損傷。
36.2、本發明細胞支架的製備方法採用上述生物墨水為原料，結合3d列印的方式製備細胞支架，這種細胞支架具有藥物緩釋性好、空隙率高的優點。
附圖說明
37.圖1是絲素蛋白微球的sem圖；
38.圖2是絲素蛋白微球、白藜蘆醇、載藥微球的傅立葉紅外光譜圖；
39.圖3是優選實施例生物墨水粘度隨剪切速率對數變化的流變特性曲線圖；
40.圖4是優選實施例細胞支架俯視圖；
41.圖5是優選實施例細胞支架的表面圖；
42.圖6是優選實施例細胞支架的截面sem圖；
43.圖7是優選實施例細胞支架的應力-應變曲線圖；
44.圖8是優選實施例細胞支架的降解率示意圖；
45.圖9是優選實施例細胞支架的溶脹性示意圖；
46.圖10是優選實施例細胞支架的藥物累計釋放量隨時間變化趨勢圖；
47.圖11是與優選實施例細胞支架共培養下和普通培養下的細胞吸光度對比圖；
48.圖12是載細胞支架3天、5天、7天時的染色圖。
具體實施方式
49.以下結合優選實施例並配合附圖對本發明作詳細說明。
50.一種優選實施例生物墨水的製備方法，包括以下步驟：
51.s1:在燒杯中加入絲素蛋白溶液，將乙醇溶液滴加到燒杯中，攪拌均勻後將混合物置於﹣20℃的條件下冷藏，24h後取出，解凍、離心、乾燥後得到絲素蛋白微球；
52.s2:將白藜蘆醇溶解於乙醇溶液中，再將步驟s1中得到的絲素蛋白微球置於混合溶液中，溫度37℃的條件下密封避光攪拌，24h後停止攪拌，離心、乾燥後得到載藥微球；
53.s3:將明膠、海藻酸鈉和步驟s2中得到的載藥微球用梯度加熱法以原濃度兩倍質量混合均勻，將明膠、海藻酸鈉和載藥微球混合液與細胞密度為2
×
106的atdc-5細胞懸液以1∶1的體積比混合，得到生物墨水。
54.步驟s1中絲素蛋白溶液的配置方法如下：
55.s11:將蠶殼剪碎投入到質量濃度為0.05％的na2co3溶液中，加熱煮沸後保持沸騰60～90min，得到絲素纖維；
56.s12:將絲素纖維用去離子水搓洗5～6次後，置於溫度為60℃的烘乾箱中乾燥24h；
57.s13:將乾燥完成的絲素纖維放入9mol/l的溴化鋰溶液中，溫度60℃的條件下使絲素纖維完全溶解，得到溶解液；
58.s14:將溶解液加入截留分子量為12kd的透析袋中，在去離子水中透析72h，透析期間每隔3h更換一次去離子水；
59.s15:將透析完成後的液體加入離心管中，離心去除不溶雜質，得到絲素蛋白溶液，4℃保存備用。
60.步驟s1中的絲素蛋白微球的具體製備方法如下：
61.s111:取10ml上述絲素蛋白溶液，轉速為160～240r/min的條件下均勻攪拌，同時緩慢滴加2ml乙醇；
62.s112:將攪拌好的溶液在室溫下靜置3～5min，再將溶液放置於溫度﹣20℃的條件下冷藏24h；
63.s113:將冷藏後凝固的溶液放置於室溫下自然融化，融化後得到淡藍色懸浮液；
64.s114:將淡藍色懸浮液在轉速10000r/min的條件下離心15min後，冷凍乾燥24h得到乾燥穩定的絲素蛋白微球備用。
65.步驟s2中載藥微球的具體製備方法如下：
66.s21:將5mg白藜蘆醇加入在1ml乙醇溶液中，完全溶解後加入16mg絲素蛋白微球，混合均勻得到混合液；
67.s22:將混合液於轉速80r/min、密封避光的條件下孵育24h；
68.s23:將步驟s22中的產物在轉速12000r/min的條件下離心，並加入乙醇洗去未被封包的絲素蛋白微球，冷凍乾燥備用。
69.s3中的梯度加熱法包括以下步驟：
70.s31:在15ml去離子水中加入4g明膠，溫度80℃的條件下攪拌1h；
71.s32:攪拌完成後，冷卻至室溫，加入2g海藻酸鈉和10ml的去離子水，溫度60℃的條件下攪拌1h；
72.s33:攪拌完成後，冷卻至室溫，加入3ml去離子水、0.2g載藥微球超聲混合均勻；
73.s34:將混合完成的液體加入用2ml去離子水洗淨的試管中，溫度40℃的條件下攪拌1h，攪拌完成後冷卻至室溫，得到混合液；
74.s35:將混合液與細胞密度為2
×
106的atdc-5細胞懸液以1∶1的體積比混合。
75.一種優選實施例細胞支架的製備方法：
76.s01:採用上述生物墨水為原料；
77.s02:在soildworks中繪製出支架的三維結構，並以stl文件格式導出，將導出文件導入到aurora中對三維結構進行切片分層，並以cli格式導出，再將所得文件導入到控制執行軟體cark中，並設定執行參數。
78.執行參數為：噴頭25g，輪廓、填充速度為10mm/s，噴頭跳轉速度為60mm/s，擠料速度為0.26mm/s，成型室溫為10℃。在無菌的條件下列印細胞支架。
79.性能測試試驗
80.上述製備得到的絲素蛋白微球和載藥微球表徵；
81.如圖1所示，使用掃描電子顯微鏡(sigma-300，德國zeiss公司)對絲素蛋白微球進行形貌觀察，確認其成球良好。
82.使用傅立葉紅外光譜儀(nicolet-is20，美國thermo公司)分別測量絲素蛋白微球、白藜蘆醇和載藥微球的紅外光譜，確認白藜蘆醇成功嵌入進了絲素蛋白微球，如圖2所示。
83.上述製備得到的生物墨水性能表徵：
84.使用流變儀(haake mars-40，美國thermo公司)，選用直徑為50mm的平行板，對生物墨水進行對數剪切速率掃描。如圖3所示，在剪切速率為0.1～1000(s-1
)的範圍內，測量溫度為24℃條件下對樣品旋轉模式的動力學粘度進行檢測，確認該生物墨水在具有可塑性的同時具有優秀的剪切變稀特性，能夠在列印過程中給細胞提供足夠的保護。
85.上述製備得到的細胞支架性能表徵：
86.使用掃描電鏡對支架的表面和截面結構進行形貌觀察。如圖5和圖6所示，可見支架表面突出的微球結構，支架內部有明顯的孔隙結構，適合細胞的黏附和生長。
87.使用電子萬能試驗機將支架垂直壓縮90％，通過其應力-應變曲線來計算各組支架溼態下的楊氏模量，如圖7所示，可見該支架力學性能達到了軟骨組織力學性能要求。
88.通過測量各組支架在磷酸鹽緩衝溶液中浸泡不同時間重量的變化來計算其溶脹率。如圖9所示，可見該支架具有優秀的吸收能利，能夠及時的為細胞生長提供營養物質。
89.將支架置於磷酸鹽緩衝溶液中，並在37℃、二氧化碳濃度為5％的恆溫細胞培養箱中進行培養，通過分析不同時間段乾燥後支架的質量以及磷酸鹽緩衝溶液中白藜蘆醇的含量，並結合白藜蘆醇在磷酸鹽緩衝溶液中的紫外光吸收擬合直線分別計算支架的體外降解率和藥物釋放性能。如圖8和圖10所示，可見該支架降解速度是可以與細胞生長和軟骨組織修復的速率相匹配的，微球支架的結構有效緩解了因水凝膠降解導致的白藜蘆醇爆釋問題，延長了其在軟骨修復中的作用時間。
90.上述製備得到的生物支架細胞毒性測試：
91.如圖11所示，圖中的#和*表示顯著性，使用cck-8對載細胞的生物支架進行細胞活性測試，可見該支架並為對細胞生長產生抑制作用，並且提高了細胞活性。
92.使用活/死染色劑對載細胞生物支架進行螢光染色，觀察3天、5天、7天時的情況，如圖12所示，可見該支架利於細胞的貼壁生長。
93.上述的實施方式僅僅是對本發明的解釋，其並不是對本發明的限制，本領域技術人員在閱讀完本說明書後可以根據需要對本實施方式做出沒有創造性貢獻的修改，但只要在本發明的權利要求範圍內都受到專利法的保護。