葡萄球菌屬的兩階段發酵增加硝酸還原酶活性的製作方法

2023-04-23 00:30:36 2

葡萄球菌屬的兩階段發酵增加硝酸還原酶活性的製作方法
【專利摘要】本發明涉及使食品變紅的領域。具體地說，本發明涉及用於增強具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬(Staphylococcus)菌株的硝酸還原酶活性的兩階段發酵方法，所述方法包括不存在硝酸鹽的第一有氧階段和連續進給硝酸鹽並且使用所述葡萄球菌屬菌株使肉製品變紅的第二無氧或限氧階段。
DSM 25789
2012.03.15

DSM 27311
2013.06.11
【專利說明】葡萄球菌屬的兩階段發酵増加硝酸還原酶活性

【技術領域】
[0001] 本發明涉及使食品變紅的領域。具體地說，本發明涉及用於增強具有硝酸還原酶 活性的葡萄球菌屬（Staphylococcus)菌株的硝酸還原酶活性的兩階段發酵方法，所述方 法包括不存在硝酸鹽的第一有氧階段和連續進給硝酸鹽並且使用所述葡萄球菌屬菌株使 肉製品變紅的第二無氧或限氧階段。

【背景技術】
[0002] 顏色形成和顏色穩定性屬於經加工肉製品的最關鍵的質量特性，因此對於肉類工 業極為重要。特徵性的醃製顏色源自血紅素色素（肌紅蛋白、血紅蛋白）的濃集、它們的化 學狀態和諸如氮氧化物和還原劑等添加劑。在諸如薩拉米香腸（salami)等標準的發酵肉 製品中，特徵性的醃製顏色是衍生自所添加亞硝酸鹽/硝酸鹽的化合物與天然存在的紅色 肌紅蛋白之間的化學反應結果，所述反應導致同時形成鮮紅色亞硝醯基肌紅蛋白，其中軸 向配體一氧化氮（NO)與血紅素中的中心Fe 2+配位。
[0003] 雖然具有所有所需的特性（顏色形成、微生物學安全性），但是亞硝酸鹽對人類健 康的安全性已經受到質疑。亞硝酸鹽可導致醃製肉中形成不想要的化合物，像對於健康有 問題的N-亞硝胺類。這些化合物原則上可因為亞硝酸鹽與肌肉蛋白以及胃腸道中的仲胺 和胺基酸反應而形成。
[0004] 葡萄球菌屬菌株用於顏色形成的用途基於它們將無機硝酸鹽還原成亞硝酸鹽的 能力，所述亞硝酸鹽進一步降解成上述一氧化氮（NO)，即顏色形成過程中的活性化合物。硝 酸鹽可以作為硝酸鹽直接提供或以天然硝酸鹽來源（植物粉末）間接提供。即使加入亞硝 酸鹽，也推薦加入葡萄球菌屬菌株，因為亞硝酸鹽被部分地再轉化成硝酸鹽。
[0005] 肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus)和較不常用的木糖葡萄球菌 (Staphylococcus xylosus)是用於硝酸鹽還原和顏色形成目的的標準葡萄球菌屬菌株。這 些菌株在較高的發酵溫度下恰當地工作，但是在低於6°C的低溫下活性較小。因為所述工業 由於衛生原因而優選低的生產溫度，因此想要在低溫下具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬 菌株。
[0006] 小牛葡萄球菌（Staphylococcus vitulinus)是已知在低溫下具有硝酸還原酶活 性的菌株，並且已經將其與乳酸細菌組合用於使肉變紅（W02010/067148)。
[0007] 然而，需要以下方法：所述方法改進食品中的硝酸鹽還原和顏色形成，因此可減少 實現食品所需變紅所必需的生產時間並由此可降低所述產品的生產成本。


【發明內容】

[0008] 本發明的發明人驚訝地發現，當通過兩階段發酵生產具有硝酸還原酶活性的葡萄 球菌屬菌株時，所述葡萄球菌屬菌株產生增加的硝酸還原酶活性，導致當用於使含有肌紅 蛋白的食品著色時變紅增強，其中所述兩階段發酵涉及在不存在硝酸鹽下在高通氣下使所 述菌株發酵的第一階段和在低通氣下同時連續進給硝酸鹽使所述菌株發酵的第二階段。
[0009]因此，在第一個方面，本發明涉及增加具有硝酸還原酶的葡萄球菌屬菌株的硝酸 還原酶活性的方法，其包括以下步驟：
[0010] a)在不存在硝酸鹽下在有氧條件下使所述菌株發酵；
[0011] b)在無氧或限氧條件下同時向發酵培養基中連續進給硝酸鹽使所述菌株發酵； 和
[0012] c)將所述菌株任選地制粒和任選地冷凍乾燥。
[0013] 在第二個方面，本發明涉及可通過根據第一個方面的方法得到的葡萄球菌屬菌 株，其中所述菌株的硝酸還原酶活性不能被改進超過50%。
[0014] 在第三個方面，本發明涉及選自由以保藏號DSM 25789保藏於德國微生物菌種保 藏中心（Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen，DSMZ)的小牛葡萄 球菌菌株CHCC10896和從其衍生的突變體組成的組的小牛葡萄球菌菌株。
[0015] 本發明的第四個方面涉及用於使食品變紅的方法，其包括以下步驟：
[0016] a)根據本發明的第一個方面的方法預處理具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬菌 株；
[0017] b)向食品中加入所述預處理的葡萄球菌屬菌株；和
[0018] c)用所述預處理的葡萄球菌屬菌株對所述食品進行發酵、熟化或醃製。
[0019] 本發明的第五個方面涉及包含根據本發明第二或第三個方面的葡萄球菌屬菌株 的食品。
[0020] 本發明的第六個方面涉及根據第二或第三個方面的葡萄球菌屬菌株用於使食品 變紅的用途。
[0021] 第七個方面涉及可通過根據本發明第一個方面的方法得到的食品或可通過根據 本發明的第六個方面的用途得到的食品。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1描繪在使用小牛葡萄球菌菌株CHCC10896進行標準發酵期間硝酸鹽/亞硝酸 鹽濃度以及硝酸還原酶活性（NRA)的發展。
[0023] 圖2顯示在使用小牛葡萄球菌菌株CHCC10896進行兩階段發酵期間硝酸鹽/亞硝 酸鹽濃度的發展。在6. 3小時時間點，通氣顯著減少並且開始進給硝酸鹽。沒有向分批培 養基中添加硝酸鹽。
[0024] 圖3描繪使用小牛葡萄球菌菌株CHCC10896進行兩階段發酵期間硝酸鹽/亞硝酸 鹽濃度的發展。在6. 3小時時間點，通氣顯著減少並且開始進給硝酸鹽。向分批培養基中 添加硝酸鹽。
[0025] 圖4顯示在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小 牛葡萄球菌-標準）、通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄 球菌-硝酸鹽進料）或Bactoferm? CS-300(CS-300)於4°C發酵21小時的摩泰臺拉 (mortadella)型香腸中的硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度。
[0026] 圖5顯示在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小 牛葡萄球菌-標準）、通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球 菌-硝酸鹽進料）或Bactoferm? CS-300(CS-300)於12°C發酵21小時的摩泰臺拉型香 腸中的硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度。
[0027] 圖6顯示在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小 牛葡萄球菌-標準）、通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(小牛葡萄球 菌-硝酸鹽進料）或Bactoferm? CS-300(CS-300)於18°C發酵21小時的摩泰臺拉型香 腸中的硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度。
[0028] 圖7描繪在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC10896 (STAvi_標準）、通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896 (STAvi_硝 酸鹽）或Bactoferm? CS-300(CS-300)於4°C、12°C或18°C發酵21小時的摩泰臺拉型香 腸的紅色強度（根據L*a*b*系統的a*值）。
[0029] 圖8顯示在烹飪前使用通過從一開始有硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄 球菌菌株CHCC10896(1)、通過從一開始無硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC10896(2)、Bactoferm? CS-300(3)或TEXEL? NatuRed LT(4)於 4°C達不同孵育間 隔（7小時、12小時和24小時）後的摩泰臺拉型香腸碎末的硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度。
[0030] 圖9描繪在烹飪前使用通過從一開始有硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄 球菌菌株CHCC10896(1)、通過從一開始無硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC10896(2)、Bactoferm? CS-300(3)或TEXEL? NatuRed LT(4)於 4°C、8°C或 12°C 發酵7小時後的摩泰臺拉型香腸的紅色強度（根據L*a*b*系統的a*值）。
[0031] 圖10描繪在烹飪前使用通過從一開始有硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄 球菌菌株CHCC10896(1)、通過從一開始無硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC10896(2)、Bact〇femi? CS-300(3)或TEXEL? NatuRed LT(4)於 4°C、8°C或 12°C 發酵12小時後的摩泰臺拉型香腸的紅色強度（根據L*a*b*系統的a*值）。
[0032] 圖11描繪在烹飪前使用通過從一開始有硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄 球菌菌株CHCC10896(1)、通過從一開始無硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC10896(2)、Bactoferm? CS-300(3)或TEXEL? NatuRed LT(4)於 4°C、8°C或 12°C 發酵24小時後的摩泰臺拉型香腸的紅色強度（根據L*a*b*系統的a*值）
[0033] 圖12描繪使用通過從一開始無硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC10896 (STAvi)或 Bactoferm? CS-299(CS-299)於 6°C發酵 16 小時的熟火腿的紅色強 度（根據L*a*b*系統的a*值）。
[0034] 圖13顯示具有使用Bactoferm? CS-299 (CS-299)或通過從一開始無硝酸鹽的兩 階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896 (小牛葡萄球菌CHCC10896)發酵的研碎的熟 火腿的培養皿。
[0035] 圖14描繪在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC111576 (CHCC11576 -標準）、通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC11576(CHCC11576 -進料）或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌）於 4°C發酵20小時的摩泰臺拉型香腸的紅色強度（根據L*a*b*系統的a*值）。
[0036] 圖15描繪在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC111576 (CHCC11576 -標準）、通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCCl 1576 (CHCC11576 -進料）、或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌菌株A (肉葡萄球菌） 於8°C發酵18小時的摩泰臺拉型香腸的紅色強度（根據L*a*b*系統的a*值）。
[0037] 圖16顯示在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC111576 (CHCC11576 -標準）、通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC11576(CHCC11576 -進料）或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌-標 準）於4°C發酵20小時的摩泰臺拉型香腸。
[0038] 圖17顯示在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC111576 (CHCC11576 -標準）、通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC11576(CHCC11576 -進料）或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌-標 準）於8°C發酵18小時的摩泰臺拉型香腸。
[0039] 圖18描繪在烹飪前使用通過標準發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC111576(1)、 通過兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576 (2)或通過標準發酵生產的肉葡萄球 菌菌株A(3)於4°C發酵20小時（4°C)或於8°C發酵18小時（8°C)的摩泰臺拉型香腸中 的硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度。
[0040] 圖19描繪在烹飪前使用通過僅在第二階段開始時給予一次高濃度的硝酸 鹽摻料（spike)的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896 -摻 料）、通過在第二階段期間連續進給硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株 CHCC10896(CHCC10896-進料）、或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌菌株A (肉葡萄球菌）於 4°C發酵20小時的摩泰臺拉型香腸的紅色強度（根據L*a*b*系統的a*值）。
[0041] 圖20描繪在烹飪前使用通過僅在第二階段開始時給予一次高濃度硝酸鹽摻料的 兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896 -摻料）、通過在第二階段期 間連續進給硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896-進料） 或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌）於8°C發酵18小時的摩泰臺拉型 香腸的紅色強度（根據L*a*b*系統的a*值）。
[0042] 圖21顯示在烹飪前使用通過僅在第二階段開始時給予一次高濃度硝酸鹽摻料的 兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896 -摻料）、通過在第二階段期 間連續進給硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896-進料） 或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌-標準）於4°C發酵20小時的摩泰 臺拉型香腸。
[0043] 圖22顯示在烹飪前使用通過僅在第二階段開始時給予一次高濃度硝酸鹽摻料的 兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896 -摻料）、通過在第二階段期 間連續進給硝酸鹽的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(CHCC10896-進料） 或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌菌株A(肉葡萄球菌-標準）於8°C發酵18小時的摩泰 臺拉型香腸。
[0044] 圖23描繪在烹飪前使用通過僅在第二階段開始時給予一次高濃度硝酸鹽摻料的 兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896 (1)、通過在第二階段期間連續進給硝酸鹽 的兩階段發酵生產的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896(2)或通過標準發酵生產的肉葡萄球菌 菌株A(3)於4°C發酵20小時（4°C)或於8°C發酵18小時（8°C)的摩泰臺拉型香腸中的 硝酸鹽/亞硝酸鹽濃度。

【具體實施方式】
[0045] 除非本文另外指出或上下文明顯矛盾，否則在描述本發明的上下文中（尤其是在 下文權利要求書的上下文中）使用的術語"一（a或an)"和"所述"以及相似指代物應當解 釋為涵蓋單數和複數兩者。除非另外指出，否則術語"包含"、"具有"、"包括"和"含有"應 當解釋為開放性的術語（即，意指"包括但不限於"）。除非本文另外指出，否則本文中敘述 的值的範圍僅僅打算作為個別地指處於該範圍內的每個單獨值的簡化方法，並且每個單獨 值都被併入本說明書中，就如同其在本文中被個別地敘述一樣。除非本文另外指出或上下 文明顯矛盾，否則本文所述的所有方法都可以按任何適合的順序進行。除非另外要求，否則 使用本文所提供的任何和所有示例或示例性用語（例如，"諸如"）僅僅打算用於更好地闡 明本發明，而並不對本發明的範圍構成限制。本說明書中的用語都不應當解釋為表明是任 何非實施本發明必不可少的要求要素。
[0046] 本發明涉及使具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬菌株在某些條件下發酵以增加 葡萄球菌屬菌株的硝酸還原酶活性的方法。
[0047] 如本文所使用的術語"具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬菌株"是指能夠將硝酸 鹽轉化成亞硝酸鹽的葡萄球菌屬菌株。
[0048] 發酵是作為兩階段發酵實施的，其中第一階段包括在不存在硝酸鹽下在有氧條件 下使菌株發酵並且其中第二階段包括在無氧或限氧條件下同時向發酵培養基中連續進給 硝酸鹽使菌株發酵。最後，可任選地將菌株制粒和/或冷凍乾燥。
[0049] 如本文所使用的術語"在不存在硝酸鹽下"是指在沒有加入硝酸鹽的發酵培養基 中實施的發酵。
[0050] 術語"發酵培養基"打算意指允許細菌代謝物產生和/或生物量生長的發酵培養 基。
[0051] 在優選的實施方案中，第一階段的有氧條件包括在至少0. 5vvm(每分鐘每體積的 體積）、諸如至少〇. 6vvm、諸如至少0. 7vvm、諸如至少0. 8vvm的高通氣下使菌株發酵。
[0052] 在優選的實施方案中，第一階段持續5至12小時，諸如6至10小時。
[0053] 在另一個優選實施方案中，第一階段持續直到培養基的氧分壓（PO2)達到0。
[0054] 發酵培養基的P02可以用如本文實施例2中所述的光學溶解氧傳感器測量。
[0055] 如本文所使用的術語"連續進給硝酸鹽"是指向發酵培養基穩定地添加硝酸鹽或 以每次添加恆定量硝酸鹽之間不長於15分鐘的脈衝向發酵培養基添加硝酸鹽。
[0056] 在優選的實施方案中，硝酸鹽以不長於10分鐘的脈衝、諸如不長於8分鐘的脈衝、 諸如不長於6分鐘的脈衝、諸如不長於5分鐘的脈衝添加。
[0057] 可用於根據本發明方法的硝酸鹽可以是化學來源的。它們可以是例如硝酸鉀、硝 酸鈉、硝石及其混合物。
[0058] 硝酸鹽還可以是天然來源的。它們可以通過例如植物和/或植物提取物提供，所 述植物有利地選自天然富含硝酸鹽的植物，例如韭菜、芹菜、洋蔥、菠菜和捲心菜。
[0059] 硝酸鹽可以以液體和固體形式提供。
[0060] 在優選的實施方案中，第二階段中硝酸鹽的進給速率為0. 5gAl*h)至2. Og/ (l*h)，諸如 0· 8g/(l*h)至 I. 8g/(l*h)。
[0061] 如本文所使用的術語"限氧條件"打算涵蓋通常通過受控的通氧限制可用氧的任 何條件，包括使得菌株有效地經歷接近無氧生長的低通氣。
[0062] 在優選的實施方案中，第二無氧或限氧階段包括在至多0.08wm、諸如至多 0. 07vvm、諸如至多0. 06vvm、諸如至多0. 05vvm、諸如至多0. 04vvm、諸如至多0. 03vvm的通 氣下使菌株發酵。
[0063] 不希望受理論束縛，據信第二階段中氧的缺乏迫使菌株增加負責硝酸還原酶活性 的nar操縱子的表達，所述硝酸還原酶活性受持續高濃度的硝酸鹽的促進。在有氧呼吸期 間，由電子供體如NADH提供的電子通過電子傳遞鏈轉移至末端還原酶，再轉移至最終的電 子受體O 2。在該過程中，通過膜分開電子和質子而形成蛋白質基序力。通過質子經由膜結 合的ATP-合酶流入細胞中而形成ATP。在無氧條件下，在氧缺乏期間，需要替代的電子受體 來保持該過程運行，例如硝酸鹽。由此，硝酸還原酶將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽。
[0064] 葡萄球菌屬菌株可以是任何具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬菌株，例如小牛葡 萄球菌菌株、肉葡萄球菌菌株或木糖葡萄球菌菌株。
[0065] 在本發明的優選的實施方案中，具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬菌株是具有硝 酸還原酶活性的小牛葡萄球菌菌株或肉葡萄球菌菌株。
[0066] 在更優選的實施方案中，具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬菌株是小牛葡萄球菌 菌株。
[0067] 在本發明的非常優選的實施方案中，小牛葡萄球菌菌株選自由以保藏號DSM 25789保藏於德國微生物菌種保藏中心（DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏號 DSM 27311保藏於德國微生物菌種保藏中心（DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576和從其 衍生的突變體組成的組。
[0068] 在本上下文中，術語"突變體"應當理解為藉助例如基因工程、放射和/或化學處 理從本發明的菌株衍生的菌株。優選地，突變體是功能上等效的突變體，例如具有與親本菌 株基本上相同或改進的性質（例如關於硝酸還原酶活性）的突變體。所述突變體是本發明 的一部分。特別地，術語"突變體"是指通過使本發明的菌株經受任何常規使用的誘變處理 (包括用諸如甲磺酸乙酯（EMS)或N-甲基-Ν' -硝基-N-硝基胍（NTG)等化學誘變劑、UV 光處理）而得到的菌株，或自發地發生的突變體。突變體可能已經經受數次誘變處理（單 次處理應當理解為一個誘變步驟，之後是一個篩選/選擇步驟），但是目前優選實施不超 過20次、或不超過10次、或不超過5次處理（或篩選/選擇步驟）。在目前優選的突變體 中，與親本菌株相比，細菌基因組中小於1%、小於0. 1、小於0.01、小於0.001%或甚至小於 0. OOOl %的核苷酸已經被另一種核苷酸替換，或被缺失。
[0069] 本發明還涉及可通過上述方法得到的葡萄球菌屬菌株。已經經受上述兩階段發酵 方法的葡萄球菌屬菌株的硝酸還原酶活性不能被改進到與沒有經受本發明的兩階段發酵 的葡萄球菌屬菌株的硝酸還原酶活性相同的程度。
[0070] 因此，使已經經受一次兩階段發酵方法的葡萄球菌屬菌株在接下來的數小時內經 受例如第二輪兩階段發酵方法不會將所述菌株的硝酸還原酶活性改進到與使所述菌株第 一次經受兩階段發酵方法時相同的程度。菌株經受第一輪和第二輪兩階段發酵方法並且仍 維持高的硝酸還原酶活性的時間點之間的確切時段取決於多種條件，例如氧的存在和保持 樣品時的溫度。
[0071] 優選地，使菌株經受兩階段發酵方法在產生菌株後不超過3小時將菌株保持在低 於5°C的溫度和無氧條件下來確定硝酸還原酶活性可被改進的百分數。
[0072] 不希望受理論束縛，據信除了本發明的兩階段發酵方法之外，還可存在用於將硝 酸還原酶活性增加至高於通過葡萄球菌屬菌株標準發酵所實現水平的水平的其它方法。可 例如通過使菌株經受其它應激因素來誘導負責硝酸還原酶活性的nar操縱子。
[0073] 在優選的實施方案中，不能將菌株的硝酸還原酶活性改進超過50%，諸如超過 40 %，諸如超過30 %，諸如超過20 %，諸如超過10 %。
[0074] 所討論的葡萄球菌屬菌株的硝酸還原酶活性改進百分數可以通過使用如本文實 施例中所述的用於確定硝酸還原酶活性的方法來容易地確定：確定所討論的菌株在經受根 據本發明的兩階段發酵方法之前和之後的硝酸還原酶活性，並且可通過確定硝酸還原酶活 性的增加來計算硝酸還原酶活性的改進。
[0075] 在優選的實施方案中，通過上述方法得到葡萄球菌屬菌株。
[0076] 在另一個優選的實施方案中，當以3. 6X101(lCFU/kg肉的量加入並且用於在12°C 發酵21小時製備摩泰臺拉型香腸時，葡萄球菌屬菌株能夠使肉變紅至根據L*a*b*系統至 少14的紅色強度（a*值）。
[0077] 摩泰臺拉型香腸可以根據本文實施例3和4製備。
[0078] 在本發明的再一優選實施方案中，當以1.5X101(lCFU/kg肉的量加入並且用於在 6°C發酵16小時製備熟火腿時，葡萄球菌屬菌株能夠使肉變紅至根據L*a*b*系統至少10、 諸如至少11、諸如至少12的紅色強度（a*值）。
[0079] 熟火腿可以根據本文實施例5製備。
[0080] 本發明還涉及選自由以保藏號DSM 25789保藏於德國微生物菌種保藏中心 (DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896和從其衍生的突變體的小牛葡萄球菌菌株組成的 組。
[0081] 在本上下文中，術語"突變體"應當理解為藉助例如基因工程、放射和/或化學處 理從本發明的菌株衍生的菌株。優選地，突變體是功能上等效的突變體，例如具有與親本菌 株基本上相同或改進的性質（例如關於硝酸還原酶活性）的突變體。所述突變體是本發明 的一部分。特別地，術語"突變體"是指通過使本發明的菌株經受任何常規使用的誘變處理 (包括用諸如甲磺酸乙酯（EMS)或N-甲基-Ν' -硝基-N-硝基胍（NTG)等化學誘變劑、UV 光處理）而得到的菌株，或自發地發生的突變體。突變體可能已經經受數次誘變處理（單 次處理應當理解為一個誘變步驟，之後是一個篩選/選擇步驟），但是目前優選實施不超 過20次、或不超過10次、或不超過5次處理（或篩選/選擇步驟）。在目前優選的突變體 中，與親本菌株相比，細菌基因組中小於1%、小於0. 1、小於0.01、小於0.001%或甚至小於 0. 0001 %的核苷酸已經被另一種核苷酸替換，或被缺失。
[0082] 此外，本發明涉及用於使食品變紅的方法，其包括以下步驟：根據上述使具有硝酸 還原酶活性的葡萄球菌屬菌株發酵的方法預處理具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬菌株， 向食品中加入所述預處理的葡萄球菌屬，和用所述預處理的葡萄球菌屬菌株對所述食品進 行發酵、熟化或醃製。
[0083] 食品可以是基於含有肌紅蛋白的食物來源的任何產品。
[0084] 在優選的實施方案中，食品是肉製品。
[0085] 肉製品可以是具有一定含量的肉的任何產品。肉可以是牛肉、豬肉、家禽肉、野味 肉或任何其它種類的肉。
[0086] 食品還可以是基於魚和/或基於甲殼類的產品。
[0087] 在優選的實施方案中，葡萄球菌屬菌株以1.0X108CFU/kg至1.0X10 12CFU/kg、諸 如I. OX 109CFU/kg至I. OX 10nCFU/kg的量加入。優選地，葡萄球菌屬菌株以2. OX IO9CFU/ kg 至 5. OX 101(lCFU/kg 的量加入。
[0088] 在優選的實施方案中，用預處理的葡萄球菌屬菌株對食品發酵、熟化或醃製在4°C 至45°C的溫度下，諸如在4°C至30°C的溫度下，諸如在4°C至25°C的溫度下進行。
[0089] 食品的發酵、熟化或醃製可以持續8小時至數天/數周。
[0090] 在優選的實施方案中，葡萄球菌屬菌株是小牛葡萄球菌菌株或肉葡萄球菌菌株。
[0091] 在更優選的實施方案中，葡萄球菌屬菌株是小牛葡萄球菌菌株。
[0092] 在非常優選的實施方案中，小牛葡萄球菌菌株選自由以保藏號DSM 25789保藏於 德國微生物菌種保藏中心（DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏號DSM 27311保 藏於德國微生物菌種保藏中心（DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576和從其衍生的突變 體組成的組。
[0093] 在本上下文中，術語"突變體"應當理解為藉助例如基因工程、放射和/或化學處 理從本發明的菌株衍生的菌株。優選地，突變體是功能上等效的突變體，例如具有與親本菌 株基本上相同或改進的性質（例如關於硝酸還原酶活性）的突變體。所述突變體是本發 明的一部分。特別地，術語"突變體"是指通過使本發明的菌株經受任何常規使用的誘變處 理（包括用諸如甲磺酸乙酯（EMS)或N-甲基-Ν' -硝基-N-硝基胍（NTG)等化學誘變劑、 UV光處理）而得到的菌株，或自發地發生的突變體。突變體可以是已經經受數次誘變處理 (單次處理應當理解為一個誘變步驟，之後是一個篩選/選擇步驟），但是目前優選實施不 超過20次、或不超過10次、或不超過5次處理（或篩選/選擇步驟）。在目前優選的突變 體中，與親本菌株相比，細菌基因組中小於1%、小於〇. 1、小於0.01、小於0.001%或甚至小 於0. 0001 %的核苷酸已經被另一種核苷酸替換，或被缺失。
[0094] 此外，本發明涉及包含葡萄球菌屬菌株的食品，所述葡萄球菌屬菌株是可通過如 上所述的兩階段發酵方法得到的葡萄球菌屬菌株、或選自由已經經受如上所述的兩階段發 酵方法的以保藏號DSM 25789保藏於DSMZ的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、以保藏號DSM 27311保藏於德國微生物菌種保藏中心（DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576和從其衍生 的突變體組成的組的葡萄球菌屬菌株。
[0095] 在本發明的優選的實施方案中，通過如上所述的兩階段發酵方法得到葡萄球菌屬 菌株。
[0096] 在優選的實施方案中，食品是肉製品。
[0097] 在優選的實施方案中，肉製品是摩泰臺拉型香腸，其中所述摩泰臺拉型香腸具有 根據L*a*b*系統至少14的紅色強度（a*值）。
[0098] 在另一個優選的實施方案中，肉製品是熟火腿，其中所述熟火腿具有根據L*a*b* 系統至少10、諸如至少11、諸如至少12的紅色強度（a*值）。
[0099] 此外，本發明涉及葡萄球菌屬菌株用於使食品變紅的用途，所述葡萄球菌屬菌株 是可通過如上所述的兩階段發酵方法得到的葡萄球菌屬菌株、或已經經受如上所述的兩階 段發酵方法並且選自由以保藏號DSM 25789保藏於DSMZ的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、 以保藏號DSM 27311保藏於德國微生物菌種保藏中心（DSMZ)的小牛葡萄球菌菌株 CHCCl 1576和從其衍生的突變體組成的組的葡萄球菌屬菌株。
[0100] 在優選的實施方案中，通過如上所述的兩階段發酵方法得到葡萄球菌屬菌株。
[0101] 優選地，食品是肉製品。
[0102] 本發明還涉及可通過上述使食品變紅的方法得到的食品或可通過上述用途得到 的食品。
[0103] 下面以非限定性實施例的方式來描述本發明的實施方案。
[0104] 實施例
[0105] 確定硝酸還原酶活性的方法
[0106] 可使用下列方法來確定硝酸還原酶活性（NRA):
[0107] 在第一步中，在Eppendorf反應杯中將約5X 108cfu/ml在誘導緩衝液（10g/l胰蛋 白腖，Ig半胱氨酸，Ig ΚΝ03;ρΗ 7.0)中於30°C靜止孵育。溫度和孵育時間針對要評價的特 定問題來調整。重要的是通過例如通過使用礦物油進行覆蓋使懸浮液上方的空氣相最小化 來將誘導緩衝液內細胞的氧供應減少至最低。因為每次使用相同的細胞計數、孵育時間和 溫度，所以一次測定與另一次測定之間的結果是相當的，但如果需要快速分析並且沒有細 胞計數可利用時，則通過OD 6tltl測量來測定細胞的劑量也是合適的。例如當要測試瓊脂板上 儲存的分離物的硝酸還原酶活性時，應當根據〇D_測量來實施誘導緩衝液的接種。這裡重 要的是在合適培養基中將來自瓊脂平皿的菌落孵育一天並且在傍晚接種合適體積的新鮮 培養基，然後孵育過夜。將要彼此進行比較的樣品應當具有相當的光密度，使得可按照以下 假定進行比較：所有樣品均顯示大致相同的活細胞與死細胞的比率，這使得通過〇D_測量 進行劑量測定是可行的。可將這些過夜培養物接種到誘導緩衝液中至所有樣品的〇D_相 同。〇D_應當不超過0. 6,因為高於0. 6的光密度影響結果。
[0108] 誘導步驟是重要的，因為它以某種方式模擬了當為了顏色穩定性而在肉中應用培 養物時在終產品中也會發生的情況。葡萄球菌的硝酸還原酶系統被存在硝酸鹽的無氧條件 誘導，如同肉製品內的情況那樣。誘導硝酸鹽還原系統的調節過程（轉錄、蛋白質生物合 成）在肉製品內需要一些時間，因此認為使用誘導步驟來給予細胞時間去"再活化"硝酸鹽 還原系統，如會在肉製品中發生的那樣。
[0109] 測定本身基於 Lowe 和 Evans (Lowe 和 Evans (1964) · Biochimica et biophysica acta 85 ;377-389)研發的方法，其中通過測量連二亞硫酸鹽/苄基紫精系統內亞硝酸鹽自 硝酸鹽的產量來確定反應速度。
[0110] 使用由磷酸鉀緩衝液（IOOmM ;pH 7. 0)、作為人工電子供體的苄基紫精（30mM)、硝 酸鉀（12mM)和還原劑連二亞硫酸鹽（HlmM)組成的反應混合物。加入過量的連二亞硫酸 鹽有助於無缺氧室的實驗室條件下的操作。通過加入細菌細胞開始反應。
[0111] 反應混合物:
[0112] 0. 2ml 預先誘導的細胞懸浮液
[0113] 10. 8ml 磷酸鉀緩衝液（IOOmM ;pH 7. 0)
[0114] 0.4ml KNO3溶液（12mM)
[0115] 0.4ml 苄基紫精溶液（30mM)
[0116] 通過緩慢攪拌將試管於30°C水浴中預熱2分鐘。
[0117] 0.4ml 連二亞硫酸鹽溶液（HlmM)
[0118] ?將試管在水浴內孵育並且以不同時間間隔（例如0分鐘、5分鐘、10分鐘、20分 鍾、30分鐘和60分鐘）將0. 4ml該溶液轉移至Eppendorf杯中
[0119] ?應當通過在取樣後立即搖動對樣品通氧直到還原的苄基紫精退色
[0120] ?然後將杯以10, 000 Xg離心3分鐘
[0121] ?將50 μ 1上清液轉移至96孔微量滴定板的孔（至少5個孔）中
[0122] ?向每一孔中加入250 μ 1格裡斯（Griess)試劑
[0123] ?將板在黑暗中儲存10分鐘
[0124] ?用微孔板閱讀儀讀取540nm下的吸光度
[0125] ?吸光度應當不超過0. 8,否則需要稀釋
[0126] 各注
[0127] 作為對照合適的是不加入任何細胞或硝酸鹽。可以使用已知亞硝酸鹽濃度的樣品 產生標準曲線，並且計算對應於所述線的斜率的摩爾消光係數。藉助於摩爾消光係數和測 量的吸光度可以計算特定時間下的亞硝酸鹽濃度。雖然通過執行時間因素可以計算酶活 性，但是僅採用540nm下的吸光度作為硝酸還原酶活性的直接指示也是合適的。
[0128] 確定肉和肉製品中硝酸鹽和亞硝酸鹽的方法。
[0129] 可以使用下列方法來確定硝酸鹽和亞硝酸鹽的濃度：
[0130] 確定原理
[0131] 將樣品用熱水提取並且在蛋白質內容物變性後將提取物過濾。濾液含有提取的硝 酸鹽和亞硝酸鹽。亞硝酸鹽可以通過加入磺胺（顯色試劑I)和N-(1-萘基-)-乙二銨二 氯化物（顯色試劑II)進行格裡斯反應來直接確定。該反應的產物是在546nm下具有最大 吸收的發色團（chromphor)，其顯示粉紅色並且可以通過分光光度法確定。硝酸鹽不能直接 確定，必須首先將其還原成亞硝酸鹽。通過使濾液流經含金屬鎘作為還原劑的還原柱進行 還原。經由鎘柱還原後確定的亞硝酸鹽的量（總亞硝酸鹽）減去提取後立即在濾液內確定 的量（亞硝酸鹽）的差得到樣品內硝酸鹽的量。
[0132] 實驗
[0133] 通過將60-70g硫酸鎘（3CdS04X8H20)溶解於600ml去離子水中來製備鎘漿。為 了使鎘沉澱，將3-5個鋅棒浸泡到所述溶液中。在6-8小時後通過傾析收穫沉澱的鎘。將 沉澱物在2 X IOOOml去離子水中洗滌。將洗滌的沉澱物與400ml0. IM HCl混合併且在HCl 中孵育過夜。
[0134] 通過將玻璃棉放置到玻璃柱錐形體內用於保持鎘漿來準備還原柱。在HCl傾析之 後，用去離子水將鎘漿洗滌到柱中直到達到約170mm的高度。應當避免夾雜物和氣泡，如果 出現，則需要去除。所述柱應當允許6-9ml/min的流經量。
[0135] 通過研磨將肉樣品均質化。將約IOg樣品（記錄確切重量用於計算）稱入IOOml 錐形瓶中。
[0136] 加入IOml飽和硼酸鈉溶液（50g/l四硼酸二鈉-十水合物溶解於加熱的去離子水 中）和50ml去離子水。將懸浮液充分混合併加熱到95°C達15分鐘。然後，將懸浮液定量 轉移至200ml容量瓶中並再次於95°C加熱15分鐘。將懸浮液定期混合。接著加入5ml卡 利茲（Carrez) I溶液（106g/l六氰鐵（II)酸鉀-三水合物溶解於去離子水中；溶液必須儲 存在棕色瓶中並且必須每周製備）和卡利茲II溶液（220g乙酸鋅於30ml純乙酸中並用去 離子水填充至1000ml)使殘留的蛋白質變性。將懸浮液充分混合。如果需要，取決於樣品 的性質（例如高脂肪含量），可以增加卡利茲溶液的量。在冷卻至室溫後，將容量瓶用去離 子水填充至標記處並混合。通過用於中細沉澱物的過濾器將樣品溶液過濾。丟棄濾液的第 一部分；濾液必須是澄清的和無色的。
[0137] 對於亞硝酸鹽的確定來說，將IOml濾液轉移至IOOml燒瓶中，加入5ml顯色 試劑I (通過加熱將6g磺胺溶解於500ml去離子水中，冷卻後通過持續攪拌加入250ml HCl (37% )，然後冷卻並用去離子水填充至1000ml)和顯色試劑11(0. 25g N-(1-萘基）乙 二銨二氯化物溶解於250ml去離子水中；溶液必須儲存在棕色瓶中並且必須每周製備）。將 溶液在黑暗中在室溫下孵育30分鐘。接著使用通過分光光度法相對於盲對照（blind) (1:2 比例的顯色試劑I和11+去離子水）在546nm下確定溶液的消光度。
[0138] 對於硝酸鹽的確定來說，將20ml濾液轉移至IOOml燒瓶中，加入5ml氨緩衝液 (20ml HCl (37% )稀釋於 500ml 去離子水中，加入 IOg Titriplex III(EDTA)和 55ml 氨溶 液（25% )並用去離子水填充至1000ml ;pH 9,. 6-9.，7)。將混合的溶液轉移至還原柱。柱 必須之前通過流經25ml HCl (0. 1M)、50ml去離子水和25ml稀釋的氨緩衝液溶液（以1:10 稀釋於去離子水中）來準備。所述柱應決不在乾燥下運行。將用於硝酸鹽確定的洗脫液收 集在IOOml容量瓶中。在加入全部濾液之後，將柱用約15ml去離子水洗滌3-4次。還將流 經物收集在容量瓶中。將現已含有還原的樣品溶液的容量瓶用去離子水填充至標記處並充 分混合。
[0139] 對於亞硝酸鹽/還原的硝酸鹽的確定來說，將IOml濾液轉移至IOOml燒瓶中，加 入5ml顯色試劑I和II。將溶液在黑暗中在室溫下孵育30分鐘。接著，通過分光光度法相 對於盲對照（1:2比例的顯色試劑I和11+去離子水）在546nm下確定溶液的消光度。
[0140] 計筧
[0141] 表示為NaNO2 (ppm) [mg/kg]的亞硝酸鹽濃度計算如下：
[0142] 亞硝酸鹽濃度[ppm] = a*V/Ew，其中
[0143] a :提取後立即於樣品內的μ g NaNO2(該值可以從確定樣品在546nm下的消光度 之後的校準線直接讀取。該校準線是通過確定具有已知亞硝酸鹽濃度的溶液在547nm下的 消光度產生的）。
[0144] V :稀釋因子。
[0145] Ew:樣品重量（g)。
[0146] 表示為NaNO2 (ppm) [mg/kg]的總亞硝酸鹽濃度計算如下：
[0147] 總亞硝酸鹽濃度[ppm] = b*V/Ew，其中
[0148] b:樣品中最初的μ g NaNO2 (該值可以從確定樣品在546nm下的消光度之後的校 準線直接讀取。該校準線是通過確定具有已知亞硝酸鹽濃度的溶液在547nm下的消光度產 生的）加上通過鎘柱還原從硝酸鹽衍生的亞硝酸鹽。
[0149] V :稀釋因子。
[0150] Ew:樣品重量（g)。
[0151] 表示為KNO3(Ppm) [mg/kg]的硝酸鹽濃度計算如下：
[0152] 來自硝酸鹽的亞硝酸鹽濃度[ppm]=總亞硝酸鹽濃度[ppm]-亞硝酸鹽濃度 [ppm]
[0153] 硝酸鹽濃度[ppm]=來自硝酸鹽的亞硝酸鹽濃度[ppm] X 1. 465 (從亞硝酸鹽轉化 成硝酸鹽的轉化因子）
[0154] 實施例1 :用於葡萄球菌屬種的標準發酵程序
[0155] 實驗：
[0156] 在用於肉葡萄球菌MIII的改良形式的標準甘油培養基中實施發酵。甘油含量與 用於肉葡萄球菌MIII的標準培養基相比降低以確保充足的氧供應。
[0157] 發酵培養基：
[0158]

【權利要求】
1. 一種增加具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬（Staphylococcus)菌株的硝酸還原酶 活性的方法，其包括W下步驟： a) 在不存在硝酸鹽下在有氧條件下使所述菌株發酵； b) 在無氧或限氧條件下同時向發酵培養基中連續進給硝酸鹽使所述菌株發酵；和 C)將所述菌株任選地制粒和任選地冷凍乾燥。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中所述具有硝酸還原酶活性的葡萄球菌屬菌株是小 牛葡萄球菌（Staphylococ州S vi1:ulinus)菌株或肉葡萄球菌（Staphylococ州S carnosus) 菌株。
3. 根據權利要求2所述的方法，其中所述小牛葡萄球菌菌株選自由W保藏號DSM 25789保藏於德國微生物菌種保藏中屯、值SMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896、W保藏號 DSM 27311保藏於德國微生物菌種保藏中屯、值SMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC11576、和從 其衍生的突變體組成的組。
4. 一種可通過根據權利要求1到3中任一權利要求所述的方法得到的葡萄球菌屬菌 株，其中所述菌株的所述硝酸還原酶活性不能被改進超過50%。
5. -種小牛葡萄球菌菌株，其選自由W保藏號DSM 25789保藏於德國微生物菌種保藏 中屯、值SMZ)的小牛葡萄球菌菌株CHCC10896和從其衍生的突變體組成的組。
6. -種使食品變紅的方法，其包括W下步驟： a) 根據權利要求1到3中任一權利要求所述的方法預處理具有硝酸還原酶活性的葡萄 球菌屬菌株； b) 向肉製品中加入所述預處理的葡萄球菌屬菌株；和 C)用所述預處理的葡萄球菌屬菌株對所述肉製品進行發酵、熟化或胳制。
7. 根據權利要求6所述的方法，其中所述食品是肉製品。
8. 根據權利要求6或7中任一權利要求所述的方法，其中所述葡萄球菌屬菌株是小牛 葡萄球菌菌株或肉葡萄球菌菌株。
9. 根據權利要求6到8中任一權利要求所述的方法，其中所述小牛葡萄球菌菌株選 自由W保藏號DSM 25789保藏於德國微生物菌種保藏中屯、值SMZ)的小牛葡萄球菌菌株 CHCC10896、W保藏號DSM 27311保藏於德國微生物菌種保藏中屯、值SMZ)的小牛葡萄球菌 菌株CHCC11576、和從其衍生的突變體組成的組。
10. -種包含葡萄球菌屬菌株的食品，所述葡萄球菌屬菌株可通過根據權利要求1到3 中任一權利要求所述的方法得到。
11. 根據權利要求10所述的食品，其中所述食品是肉製品。
12. 根據權利要求11所述的肉製品，其中所述肉製品是摩泰臺拉型香腸並且其中所述 摩泰臺拉型香腸具有根據L相衝*系統至少14的紅色強度（a*值）。
13. 根據權利要求11所述的肉製品，其中所述肉製品是熟火腿並且其中所述熟火腿具 有根據L*a*b*系統至少10的紅色強度（a*值）。
14. 可通過根據權利要求1到3中任一權利要求所述方法得到的葡萄球菌屬菌株用於 使食品變紅的用途。
15. -種食品，其可通過根據權利要求6到9中任一權利要求所述的方法或通過根據權 利要求14所述的用途得到。
【文檔編號】C12N9/06GK104471056SQ201380030236
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年6月14日 優先權日:2012年6月15日
【發明者】C·尼森, T·M·塞伯特 申請人:科.漢森有限公司