一種蜂蜜中硝基呋喃代謝物殘留量的檢測方法與流程
2024-04-13 17:52:05
1.本發明涉及硝基呋喃代謝物的檢測技術領域，具體涉及一種蜂蜜中硝基呋喃代謝物殘留量的檢測方法。
背景技術：
2.蜂蜜主要作為營養滋補品、藥用和加工蜜餞食品及釀造蜜酒之用，也可以替代食糖作調味品，其在清熱、解毒、美容養顏等方面有特別的功效，深受大眾喜愛。然而，現有的蜂蜜產品存在抗生素殘留問題，蜜蜂在養殖過程中易受到微生物和蟎蟲的汙染而引起病害，蜂農為了預防蜜蜂的各種蟲病災害，往往直接飼餵或者在蜂巢中噴灑抗生素，如硝基呋喃類藥物，導致了蜂蜜中硝基呋喃類代謝物的殘留，這些藥物殘留不僅不利於人體的健康,還阻礙了蜂產品的出口。
3.硝基呋喃類藥物是一類具有5-硝基-2-呋喃結構的合成類廣譜抗菌藥物，最常用的硝基呋喃類藥物主要有呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃它酮(furaltadone)、呋喃妥因(nitrofurantoin)、呋喃西林(nitrofurazone)4種，該類藥物曾在養殖業中被應用於豬、牛、水產品以及蜜蜂中用來預防和治療由沙門氏菌和埃希氏菌引起的胃腸道疾病。但是後來發現硝基呋喃類藥物具有嚴重的遺傳毒性和致畸、致癌性，因此世界各國先後頒布了禁止使用硝基呋喃類藥物的相關法令，並規定在動物源性組織中不得檢出硝基呋喃類藥物。由於硝基呋喃類藥物具有抗菌效果好，廣譜抗菌，且價格低廉等優點，在畜禽養殖業、水產養殖業以及蜜蜂養殖業的實際生產過程中仍然存在違法使用的情況，給人類健康造成極大危害。
4.硝基呋喃類藥物在生物體內代謝迅速，代謝的部分化合物分子與細胞膜蛋白結合成為結合態，形成代謝產物，因此對於硝基呋喃類藥物殘留的檢測方法通常是通過檢測其代謝物。呋喃唑酮、呋喃它酮，呋喃妥因、呋喃西林的代謝物分別為3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidine，aoz)、5-甲基嗎啉-3-氨基-2-惡唑烷酮(5-morpholinomethyl-3-amino-2-oxazolidone，amoz)、1-氨基-2-內醯胺(1-aminohydantoin，ahd)、氨基脲(semicarbazide，sem)。檢測技術主要有免疫分析法、高效液相色譜法(hplc)、液相色譜-質譜法(lc-ms)和液相色譜-串聯質譜法(lc-ms/ms)。我國發布了關於蜂蜜中硝基呋喃類代謝物檢測的國家標準如gb/t 18932.24-2005，該標準採用2-硝基苯甲醛作為衍生試劑，採用液相色譜-串聯質譜法上機檢測，外標法定量，但是該方法耗時較長(衍生16小時)，且採用外標法定量，會因樣品前處理過程及人為誤差等原因造成定量不準確，因此，亟需開發一種既能快速檢測又能準確定量蜂蜜中硝基呋喃類代謝物的檢測方法。
技術實現要素：
5.針對現有技術中的缺陷，本發明提供一種蜂蜜中硝基呋喃代謝物殘留量的檢測方法。本發明提供的方法採用超高效液相色譜-串聯三重四極杆質譜儀技術用於蜂蜜中硝基呋喃代謝物的檢測，前處理簡單易操作，檢測速度快，檢測準確度和靈敏度高、重現性好。
6.本發明的目的在於保護一種蜂蜜中硝基呋喃代謝物殘留量的檢測方法，步驟如下：
7.s101.取蜂蜜空白基質，加入硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液和硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液，進行前處理，製得硝基呋喃代謝物工作曲線標液，進行液相色譜串聯質譜分析，繪製蜂蜜中代謝物的標準曲線，得到線性方程、相關係數和線性範圍；
8.s102.取待測蜂蜜樣品，在其中加入硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液，進行前處理，得到前處理後的待測樣品；
9.s103.將前處理後的待測樣品進行液相色譜串聯質譜分析，得到代謝物的峰面積；
10.s104.將步驟s103分析得到的代謝物的峰面積，代入步驟s101得到的標準曲線，得到對應化合物的含量；
11.其中，所述的硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液中包括：aoz、amoz、ahd、sem；所述的硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液中包括：aoz-d4、amoz-d5、ahd-13
c3、、sem-hcl-(
13
c,
15
n2)。
12.優選地，所述的硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液中aoz、amoz、ahd、sem的濃度均為100ng/ml；所述的硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液中aoz-d4、amoz-d5、ahd-13
c3、sem-hcl-(
13
c,
15
n2)的濃度均為100ng/ml。
13.優選地，步驟s101中，所述的硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液和硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液的濃度比為1：1。
14.優選地，步驟s101和步驟s102中，所述的前處理，具體步驟如下：
15.s201.加入5％三氯乙酸溶液，渦旋混勻，加入0.2mol/l的2-氯苯甲醛，第二次渦旋混勻，恆溫超聲，恆溫震蕩，靜置降溫，製得衍生液；
16.s202.在衍生液中加入0.1mol/l的磷酸氫二鉀溶液，調節ph，再加入乙酸乙酯，渦旋混勻，加入飽合nacl溶液，第二次渦旋混勻，離心，取上層乙酸乙酯置於離心管中，在氮吹儀上水浴吹乾，加入0.1％的甲酸乙腈水溶液溶解，第三次渦旋混勻後，過有機濾膜。
17.進一步優選地，步驟s201中，所述的恆溫超聲為45℃下超聲10min，所述的恆溫震蕩為45℃下避光震蕩衍生2h，所述的靜置降溫為靜置降溫至20-30℃。
18.進一步優選地，步驟s202中，所述的甲酸乙腈水溶液中甲酸、乙腈和水的體積比為0.01：1：9；所述的調節ph為採用採用2mol/l的naoh溶液調節ph至ph值為7.4
±
0.2；所述的離心為以5000r/min的速率離心5mim；所述的過有機濾膜為過0.22μm有機濾膜。
19.進一步優選地，步驟s201和s202中，所述的5％三氯乙酸溶液、0.2mol/l的2-氯苯甲醛、0.1mol/l的磷酸氫二鉀溶液、乙酸乙酯、飽合nacl溶液和0.1％甲酸乙腈水溶液的體積比為10：0.1：1：10：3：1。
20.優選地，所述的液相色譜的條件：色譜柱為a venusil mp c18色譜柱，2.1*100mm，粒度3μm；柱溫40℃，進樣體積5μl；流動相由a相+b相組成，a相為含0.1％甲酸的3mm甲酸銨溶液，b相為乙腈，流速為0.3ml/min，採用梯度洗脫。
21.進一步優選地，所述的梯度洗脫條件：0-1min，a相90％，b相10％；1-2min，a相70％，b相30％；2-3min，a相10％，b相90％；3-5min，a相10％，b相90％；5-6min，a相90％，b相10％。
22.優選地，所述的質譜的條件：電噴霧電離esi，正離子模式，多反應監測mrm；離子化
電壓5.5kv；離子源溫度500℃。
23.本發明的有益效果體現在：
24.(1)本發明提供的方法中採用的前處理方法與淨化方法簡單，採用三氯乙酸作為酸化液，既可以沉澱蛋白還能提供酸性環境，以2-氯苯甲醛作為衍生試劑，衍生溫度為45℃，大大縮短衍生時間，方法簡單易於操作，檢測靈敏度高，準確性好，且能夠快速、高效的開展工作，可以更靈敏、更快速地檢測出蜂蜜中硝基呋喃代謝物含量，極具推廣價值。
25.(2)本發明提供的方法單日處理樣品批次可達100批，降低了測試人員的勞動強度，在減少檢測成本的同時也極大地提高了分析檢測效率。
附圖說明
26.為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。在所有附圖中，類似的元件或部分一般由類似的附圖標記標識。附圖中，各元件或部分並不一定按照實際的比例繪製。
27.圖1為試驗例1總離子流圖。
具體實施方式
28.下面將結合附圖對本發明技術方案的實施例進行詳細的描述。以下實施例僅用於更加清楚地說明本發明的技術方案，因此只作為示例，而不能以此來限制本發明的保護範圍。
29.需要注意的是，除非另有說明，本技術使用的技術術語或者科學術語應當為本發明所屬領域技術人員所理解的通常意義。
30.實施例
31.本實施例採用的儀器與試劑如下：
32.儀器：
33.三重四級杆串聯質譜聯用儀(triple quadtm 4500,美國ab sciex公司)；
34.a venusil mp c18色譜柱(2.1*100mm,3μm,美國phenomenex)；
35.v2s025渦旋混合器(德國ika公司)；
36.ld5-2b低速離心機(北京京立離心機有限公司)；
37.jp-100s超聲波清洗機(深圳市潔盟清洗設備有限公司)。
38.試劑：
39.乙腈、甲醇、乙酸乙酯均為色譜純，購自上海安譜實驗科技有限公司；
40.三氯乙酸、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、氯化鈉均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司；
41.2-氯苯甲醛(純度：98％)購自鄭州阿爾法化工有限公司，
42.aoz、amoz、ahd、sem(濃度100μg/ml)四種混合外標，即硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液，購自上海安譜實驗科技有限公司；
43.amoz-d5、ahd-13c3、aoz-d4、sem-hcl-(
13
c,
15
n2)(濃度100μg/ml)四種混合內標，即硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液，購自上海安譜實驗科技有限公司。
44.本實施例提供了一種蜂蜜中硝基呋喃代謝物殘留量的檢測方法，步驟如下：
45.s101.取蜂蜜空白基質，加入硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液和硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液，進行前處理，製得硝基呋喃代謝物工作曲線標液，進行液相色譜串聯質譜分析，繪製蜂蜜中代謝物的標準曲線，得到線性方程、相關係數和線性範圍；
46.s102.取待測蜂蜜樣品，在其中加入硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液，進行前處理，得到前處理後的待測樣品；
47.s103.將前處理後的待測樣品進行液相色譜串聯質譜分析，得到代謝物的峰面積；
48.s104.將步驟s103分析得到的代謝物的峰面積，代入步驟s101得到的標準曲線，得到對應化合物的含量；
49.其中，硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液中包括：aoz、amoz、ahd、sem；硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液中包括：aoz-d4、amoz-d5、ahd-13
c3、sem-hcl-(
13
c,
15
n2)。
50.硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液中aoz、amoz、ahd、sem的濃度均為100ng/ml；硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液中aoz-d4、amoz-d5、ahd-13
c3、sem-hcl-(
13
c,
15
n2)的濃度均為100ng/ml。
51.步驟s101中，硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液和硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液的濃度比為1：1。
52.步驟s101和步驟s102中，前處理，具體步驟如下：
53.s201.加入5％三氯乙酸溶液，渦旋混勻，加入0.2mol/l的2-氯苯甲醛，第二次渦旋混勻，恆溫超聲，恆溫震蕩，靜置降溫，製得衍生產物溶液；
54.s202.在衍生產物溶液中加入0.1mol/l的磷酸氫二鉀溶液，調節ph，再加入乙酸乙酯，渦旋混勻，加入飽合nacl溶液，第二次渦旋混勻，離心，取上層乙酸乙酯置於離心管中，在氮吹儀上水浴吹乾，加入0.1％的甲酸乙腈水溶液溶解，第三次渦旋混勻後，過有機濾膜。
55.步驟s201中，恆溫超聲為45℃下超聲10min，恆溫震蕩為45℃下避光震蕩衍生2h，所述的靜置降溫為靜置降溫至20-30℃。
56.步驟s202中，甲酸乙腈水溶液中甲酸、乙腈和水的體積比為0.01:1：9；調節ph為採用採用2mol/l的naoh溶液調節ph至ph值為7.4
±
0.2；離心為以5000r/min的速率離心5mim；過有機濾膜為過0.22μm有機濾膜。
57.步驟s201和s202中，5％三氯乙酸溶液、0.2mol/l的2-氯苯甲醛、0.1mol/l的磷酸氫二鉀溶液、乙酸乙酯、飽合nacl溶液和0.1％甲酸乙腈水溶液的體積比為10：0.1：1：10：3：1。
58.液相色譜的條件：色譜柱為a venusil mp c18色譜柱，2.1*100mm，粒度3μm；柱溫40℃，進樣體積5μl；流動相由a相+b相組成，a相為含0.1％甲酸的3mm甲酸銨溶液，b相為乙腈，流速為0.3ml/min，採用梯度洗脫。
59.梯度洗脫條件：0-1min，a相90％，b相10％；1-2min，a相70％，b相30％；2-3min，a相10％，b相90％；3-5min，a相10％，b相90％；5-6min，a相90％，b相10％。
60.質譜的條件：電噴霧電離esi，正離子模式，多反應監測mrm；離子化電壓5.5kv；離子源溫度500℃；其它質譜參數見表1。
61.表1
[0062][0063][0064]
其中，(a)為定量離子對，(b)為定性離子對。
[0065]
試驗例1
[0066]
線性範圍和檢測限
[0067]
測試方法：稱取蜂蜜陰性空白2g共8份，分別加入0、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20、50.0ng硝基呋喃代謝物外標混合標準溶液和各加入5ng硝基呋喃代謝物內標混合標準溶液，按照實施例的檢測方法進行前處理，製得0,0.25,0.5,1.0,2.5,5.0,10.0,25.0μg/kg硝基呋喃代謝物工作曲線標液,按照按照實施例的檢測方法的色譜條件進行分析,到的線性回歸方程，線性相關係數r》0.995,見表2,總離子流圖見圖1。
[0068]
測試結果：表2可知，以最低添加水平0.25μg/kg(n＝10)對應的色譜圖的3倍信噪比(s/n)和10倍信噪比計算，得出aoz、amoz、sem、ahd中的lod(檢出限)分別為0.1、0.1、0.3、0.1μg/kg和loq(定量限)分別為0.3、0.3、0.9、0.3μg/kg。
[0069]
表2
[0070][0071]
試驗例2
[0072]
測試實施例的檢測方法的加標回收率、精密度
[0073]
在空白蜂蜜基質中添加四種硝基呋喃進行檢測,在添加水平為1.0,2.5,5.0μg/kg
時的平均回收率為78.6％～106.2％,相對標準偏差(rsd)為1.3％～5.4％，結果見表3。
[0074]
表3
[0075][0076]
綜上，從試驗例1-2可知，本發明提供的方法採用超高效液相色譜-串聯三重四極杆質譜儀技術用於蜂蜜中硝基呋喃代謝物的檢測，前處理簡單易操作，檢測速度快，檢測準確度和靈敏度高、重現性好。
[0077]
最後應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發明的技術方案，而非對其限制；儘管參照前述各實施例對本發明進行了詳細的說明，本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特徵進行等同替換；而這些修改或者替換，並不使相應技術方案的本質脫離本發明各實施例技術方案的範圍，其均應涵蓋在本發明的權利要求和說明書的範圍當中。