重組新型冠狀病毒S蛋白三聚體疫苗組合物及其應用的製作方法

2024-04-13 02:40:05

重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗組合物及其應用
技術領域
1.本發明涉及生物製品領域，具體地說，涉及一種重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗組合物及其應用。


背景技術：

2.新型冠狀病毒(sars-cov-2)，屬巢病毒目(nidovirales)、冠狀病毒科(coronaviridae)、正冠狀病毒亞科、betacoronavirus屬、sarbecovirus亞屬、類sars病毒種、單股正鏈rna病毒，有包膜，基因組全長約為29.9kb，絕大部分編碼非結構蛋白，參與病毒複製和翻譯等功能，少部分序列編碼結構蛋白，如：s蛋白(spike protein，)、m蛋白(membrane protein)、e蛋白(envelope protein)和n蛋白(nucleo protein)。此外，還有若干附屬蛋白：3a，3b，p6，7a，7b，8b，9b和orf14，這些蛋白均參與病毒組裝。s、m和e蛋白構成病毒囊膜，是病毒引起免疫反應的主要表面抗原。其中s蛋白是一種跨膜糖蛋白，分子量約為150kda，在病毒表面形成突出的同源三聚體。s由兩個功能亞基組成，在s1和s2亞基之間的邊界處(s1/s2裂解點)被切割，這兩個亞基在融合前構象中保持非共價結合。s2亞基也由多個結構域構成，它的功能主要是介導病毒與宿主細胞的融合。遠端s1亞基在結構上分為四個不同的結構域：n端結構域(ntd)、受體結合結構域(rbd)、c端結構域1(ctd1)和c端結構域2(ctd2)，其中rbd主要負責與宿主細胞表面的受體血管緊張素轉換酶2(angiotensinconverting enzyme2，ace2)結合，從而介導病毒侵染宿主細胞，因此s蛋白及rbd均為目前基因工程疫苗研發的主要靶標。
3.根據who劃分的「關切變異株」(voc)和「關注變異株」(voi)，其中voc有5種，分別是在英國發現的b.1.1.7(alpha)、在南非發現的b.1.351(beta)、在巴西發現的p.1(gamma)、在印度發現的b.1.617.2(delta)以及在南非發現的b.1.1.529(omicron)。經過密切的監測以及現有疫苗對新冠變異株保護效果的研究發現，這些變異株的s蛋白穩定遺傳了多種胺基酸突變組合，可導致病毒傳播力、致病性增強以及對治療性抗體和對現有疫苗及恢復期病人血清產生不同程度的免疫逃逸現象。儘管如此，有一些胺基酸突變在多個voc和voi病毒株中交叉出現或同時出現，提示病毒在不斷適應宿主過程中出現的適應性改變和進化規律。
4.新冠病毒屬於rna病毒，較易發生突變，全球已經報導了30000多個新冠病毒突變株，主要突變株包括：alpha(b.1.1.7)突變株、beta(b.1.351)突變株、gamma(p1)突變株、epsilon(b.1.429)突變株、delta(b.1.617.2)突變株、kappa(b.1.617.1)突變株、omicron(b.1.1.529)突變株。這些突變株的突變位點主要位於s蛋白的胺基酸序列上。因此，突變可能會提高病毒與ace2受體的親和力，減弱中和抗體效應，進而增強病毒毒力和傳染力，加速病毒逃逸，降低疫苗保護效果。因此，亟待開發一種針對多種新冠病毒流行株的疫苗。


技術實現要素：

5.本發明的目的是提供一種新型的重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗組合物及其
應用。
6.為了實現本發明目的，第一方面，本發明提供一種重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗組合物，所述疫苗組合物含有重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體和免疫佐劑。
7.所述免疫佐劑為cpg佐劑和/或鋁佐劑。
8.所述重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體的製備方法如下：利用原核表達系統或真核表達系統表達重組新型冠狀病毒s蛋白，重組新型冠狀病毒s蛋白自組裝得到重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體。
9.所述重組新型冠狀病毒s蛋白包含如下的胺基酸序列或由其組成：
10.i)如seq id no：1所示的胺基酸序列；或
11.ii)在i)的n端和/或c端連接標籤得到的胺基酸序列；或
12.iii)i)或ii)的胺基酸序列經取代、缺失和/或增加一個或多個胺基酸得到的具有相同功能的蛋白。
13.進一步地，所述重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體的製備方法如下：
14.1)根據重組新型冠狀病毒s蛋白的胺基酸序列，通過密碼子對應關係和宿主表達頻率，利用pcr方法、dna重組法或人工合成的方法，獲得並優化編碼所述重組新型冠狀病毒s蛋白的核酸；
15.2)將核酸克隆入表達載體，再轉化或轉染宿主細胞，隨宿主細胞的增殖，從而實現重組新型冠狀病毒s蛋白在宿主細胞中的表達，重組新型冠狀病毒s蛋白自組裝得到重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體；
16.3)從細胞培養物中分離純化重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體。
17.其中，所述宿主細胞為大腸桿菌，酵母細胞、昆蟲細胞或哺乳動物細胞，優選cho細胞。
18.優選地，編碼所述重組新型冠狀病毒s蛋白的核酸序列如seq id no：2所示。
19.所述cpg佐劑為含cpg的單鏈脫氧核苷酸，優選地，所述單鏈脫氧核苷酸的序列為：5
′‑
tcgacgttcgtcgttcgtcgttc-3
′
(5
′‑
dtsdcsdgsdasdcsdgsdtsdtsdcsdgsdtsdcsdgsdtsdtsdcsdgsdtsdcsdgsdtsdtsdcs-3
′
)。
20.所述鋁佐劑為氫氧化鋁佐劑。
21.進一步地，所述疫苗組合物中所述重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體的含量為2.5-250ug/ml。
22.進一步地，所述疫苗組合物中所述cpg佐劑的含量為0.1-0.7mg/ml。
23.進一步地，所述疫苗組合物中所述鋁佐劑的含量為0.4-1.2mg/ml。
24.第二方面，本發明提供所述疫苗組合物在製備預防和/或治療新型冠狀病毒感染以及由新型冠狀病毒感染引起的疾病的藥物中的應用。
25.所述新型冠狀病毒包括新型冠狀病毒野毒株和突變株。
26.進一步地，所述突變株包括但不限於alpha突變株、beta突變株、gamma突變株、epsilon突變株、delta突變株、kappa突變株、omicron突變株。
27.藉由上述技術方案，本發明至少具有下列優點及有益效果：
28.(一)利用本發明重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體製備的疫苗組合物能夠有效誘導機體產生細胞免疫和體液免疫。通過測定抗體滴度，結果顯示該疫苗可以產生高水平igg，
針對不同新冠毒株(wild-type株、beta突變株、delta突變株)中和抗體滴度高，對上述野生株和變異株均具有中和保護效果。可用於預防新型冠狀病毒(sars-cov-2)感染和/或治療由新型冠狀病毒所致疾病，為新型冠狀病毒sars-cov-2疫情的防控提供技術保障。
29.(二)重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗組合物中重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體與cpg佐劑和/或鋁佐劑的組合可誘導產生協同的免疫效果。
30.(三)通過測定重組新型冠狀病毒s蛋白結合效價、ace2競爭結合、中和抗體滴度，結果顯示該疫苗可以igg產生水平高(普遍高於200000)、競爭結合高、針對不同新冠毒株中和抗體滴度高(beta突變株高於4000，wild-type株高於2000，delta突變株高於1400)；通過測定inf-γ\il2\il4\il6細胞因子，結果顯示細胞免疫原性好；進一步對k-18轉基因小鼠進行攻毒試驗，結果顯示在對beta突變株和delta突變株保護率高，中和抗體滴度好，肺部和腦部病毒基因拷貝數對比下降明顯，高於3個log值。
附圖說明
31.圖1為本發明較佳實施例中預測的重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體結構。
32.圖2為本發明較佳實施例中zyb0029表達質粒(zyb0029-b)圖譜。
33.圖3為本發明較佳實施例中s蛋白抗原透射電鏡照片。
34.圖4為本發明較佳實施例中s蛋白抗原2d分類結果。
具體實施方式
35.本發明提供一種重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗組合物，其包含cpg和鋁佐劑。
36.本發明還提供所述重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗組合物在製備用於預防和/或治療sars-cov-2感染引起的疾病的藥物中的應用。
37.本發明還提供cpg和鋁佐劑作為重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗的免疫增強劑或免疫佐劑的應用，或者在提高重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體疫苗的抗原或疫苗的免疫原性中的應用。
38.本發明採用如下技術方案：
39.1、抗原的設計
40.選擇新冠病毒spike蛋白全長(胞外區域)作為靶標抗原，利用cho真核表達系統進行穩定細胞系的篩選和表達。疫苗抗原是基於voc 202012/01(alpha株)、501y.v2(beta株)以及p.1變異株(gamma株)三種voc變異株對引起抗體產生逃逸和現有疫苗產生抗體交叉中和保護有所下降的s蛋白突變位點所設計，為了保持新冠病毒s蛋白天然的三聚體構象，通過對特定區域進行胺基酸的突變以阻止病毒發生融合後構象改變以及維持其三聚體結構的外源基因的加入，使得s蛋白處於穩定的融合前三聚體構象。
41.2、化學名稱和結構
42.重組新型冠狀病毒s蛋白單體(zyb0029)分子式：c
6090h9329n1597o1833s40
，理論分子量：135.5kd。
43.三聚體分子式：c
18270h27987n4791o5499s120
，理論分子量：406.6kd。
44.預測的三聚體結構如圖1所示，zyb0029單體由1224個胺基酸組成，包括新冠病毒
(sars-cov-2)spike蛋白(s蛋白)和t4噬菌體纖維蛋白結構域(foldon)。
45.具體地，zyb0029單體是基於beta(b.1.351lineage)突變株關鍵突變位點所設計的，可以使s蛋白處於穩定的融合前三聚體構象(除去跨膜區，tm)，s蛋白相對原始株sars-cov-2突變設計如下：
46.(1)涵蓋beta(b.1.351lineage)突變株s蛋白區域突變位點：l18f、d80a、d215g、del-l241l242a243、r246i、k417n、e484k、n501y、d614g、a701v。
47.(2)在s1和s2之間的furin蛋白酶切位點處引入三個突變(s蛋白第682～685位胺基酸由rrar突變為qqaq)，以阻斷抗原製備表達過程中及人體內furin蛋白酶對本品酶切；以使其維持在融合前構象。
48.(3)在s2片段引入k986p和v987p突變，提高s蛋白的穩定性。
49.(4)加入t4 foldon基序：替換s蛋白tm跨膜區，利用gs linker連接t4 foldon基序，使其有助於蛋白形成三聚體結構。
50.利用所述重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體製備的疫苗，可有效誘導機體產生細胞免疫和體液免疫。通過測定抗體滴度，結果顯示該疫苗可以產生高水平igg，針對不同新冠毒株(wild-type株、beta突變株、delta突變株)中和抗體滴度高。
51.以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrook jrussell dw，molecular cloning：a laboratory manual，2001)，或按照製造廠商說明書建議的條件。
52.實施例1重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體目的基因的合成與載體構建
53.在優化後的序列(seq id no：2)兩端分別引入ecori、hindiii酶切位點進行合成，為方便試驗順利操作進行，質粒構建過程中使用到的工具載體zy-cdmo(由北京昭衍生物技術有限公司自行構建，參見cn201910738072.9)經突變酶切位點及功能原件改造後，將合成的zyb0029序列5』端帶有ecori酶切位點，3』端帶有hindiii酶切位點，插入到載體的ecori和hindiii之間，構建獲得zyb0029表達質粒。提取的質粒，用ecori/hindiii進行酶切鑑定，瓊脂糖電泳鑑定結果顯示陽性克隆可以酶切出大小約為5925bp和3748bp的目的片段。經酶切鑑定正確的克隆進行測序，測序正確的克隆命名為zyb0029-b。zyb0029表達質粒(即zyb0029-b)圖譜見圖2，主要構建元件見表1。s蛋白抗原透射電鏡照片見圖3。s蛋白抗原2d分類結果見圖4。
54.表1 zyb0029表達載體主要構建元件描述
[0055][0056]
實施例2重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體的製備
[0057]
1、表達重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體的重組cho細胞的構建
[0058]
將含有zyb0029目的基因序列的表達質粒，通過電轉方式導入cho-k1宿主細胞，24-48小時後，用含蛋氨酸亞碸75μm(msx)的篩選培養基進行有限稀釋，按1
×
10
4-1.5
×
104cell/孔鋪板96孔板，置37℃，5％co2培養箱靜止培養。培養約兩周後，顯微鏡下觀察96孔培養板中細胞形狀和大小，通過elisa篩選，將高表達克隆轉移至24孔板中，採用同樣的方法進行6孔板的篩選和擴增，zyb0029工程細胞株的建立共進行4個批次的穩定轉染，經過96孔板、24孔板及6孔板的elisa篩選共篩選出8株pool細胞進行下一步實驗。根據蛋白表達和細胞生長狀況，從6孔板中挑選8個pool細胞進行亞克隆，採用單細胞印表機及克隆成像方法，以每孔1個細胞鋪96孔板，靜止培養後分別於dayl(鋪板當日)、day2、day3、day7、dayl3進行克隆成像；通過克隆成像數據挑選合格的單克隆進行elisa篩選，將高表達單克隆轉移至24孔板中。採用同樣的方法進行6孔板和搖瓶的篩選和擴增。經96孔板、24孔板、6孔板和搖瓶梯度篩選後，從8株pool細胞中共篩選出28株單克隆株單克隆細胞。篩選出的28株單克隆通過sds-page檢測篩選出9株單克隆進行細胞基因組測序，以確定篩選的細胞株正確表達目的基因。篩選出來的單克隆細胞，在advanced cho fed-batch medium+50μm msx培養液中培養。當細胞數量足夠時，保存於90％新鮮培養基+20％dmso凍存液中，以1.0
×
107vc/ml/支的細胞密度製備細胞庫。
[0059]
2、重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體的表達及純化
[0060]
(1)細胞復甦培養：通過使用直接解凍法解凍1支細胞，用1ml基礎培養基重懸後將細胞加入含有24ml基礎培養基的無菌一次性培養搖瓶(125ml)。初始活細胞密度為0.2
×
10
6-0.7
×
106/ml。125ml搖瓶在37.0℃、5.0％co2和80％相對溼度(rh)的條件下於搖床中培
養4天。當活細胞密度達到2.0
×
10
6-6.0
×
106/ml且細胞存活率大於95％時，進行細胞傳代。傳代至一次性培養搖瓶(500ml)後體積為100-150ml，傳代的接種活細胞密度應為0.5
×
10
6-1.5
×
106/ml。500ml搖瓶在37.0℃、5.0％co2和80％相對溼度(rh)的條件下於搖床中培養4天。當活細胞密度達到2.0-6.0
×
106/ml且細胞存活率大於95％時，進行細胞傳代。傳代至一次性培養搖瓶(2000l)，工作體積在400-600ml，傳代的接種活細胞密度應為0.5
×
10
6-1.5
×
106/ml。2000ml搖瓶在37.0℃、5.0％co2和80％相對溼度(rh)的條件下於搖床中培養4天。當活細胞密度達到2.0
×
10
6-6.0
×
106/ml且細胞存活率大於95％時，補充培養基至1200ml，繼續培養3天，最終細胞密度達到4.0
×
10
6-8.0
×
106/ml。進行細胞傳代。相同的基礎培養基，培養條件和傳代標準適用於整個搖瓶傳代階段。取工作細胞株進行復甦培養，得到細胞復甦培養物。
[0061]
(2)細胞擴增培養：在搖瓶傳代結束後，將搖瓶培養後的細胞置於生物反應器進行擴增培養，使用50l生物反應器(工作體積10～20l)，使用基礎培養基，接種活細胞密度為0.5
×
10
6-1.5
×
106/ml。細胞於生物反應器培養4天後，當細胞密度達到2.0
×
106～6.0
×
106/ml，活率＞95％時，補加基礎培養基，將細胞密度稀釋至0.5
×
10
6-1.5
×
106/ml，完成基礎培養基添加，培養體積20-35l。在生物反應器中培養2天後當細胞密度達到2.0
×
106～6.0
×
106/ml，活率＞95％時，準備接種到200升生物反應器。
[0062]
(3)罐培養：將生物反應器中的細胞接種到200l生物反應器中，此時反應器的工作體積60-105l，使用相同的基礎培養基進行補料分批生產，接種活細胞密度應為1.5
±
0.3
×
106/ml。溫度控制策略為35.0
±
0.5℃，維持此溫度至最終收穫；溶氧控制在50
±
5％；ph控制在7.2
±
0.2。監測細胞液液面泡沫高度並適當補加消泡劑。每48小時添加培養基體積5％的濃縮培養基，細胞培養周期為14天，或細胞活率低於80％時終止培養。最終收穫體積80-140l，細胞密度在0.5
×
10
7-1.3
×
107/ml。
[0063]
(4)純化：採用全自動深層過濾系統去除200l生物反應器細胞培養液中的細胞和細胞碎片，然後進行澄清過濾、分子篩、病毒滅活、疏水層析、超濾/滲濾、陰離子交換層析、除病毒過濾即得到蛋白原液，最終經0.2μm過濾器過濾後，放入無菌預組裝冷凍袋中，在-70℃以下長期冷凍保存。
[0064]
預測的重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體的結構如圖4所示。
[0065]
實施例3重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體與不同佐劑配伍的免疫效果比較
[0066]
1、實驗目的：比較氫氧化鋁佐劑加cpg佐劑，氫氧化鋁佐劑，角鯊烯成份swe佐劑，聚肌胞，皂苷佐劑配伍對疫苗的作用。
[0067]
以下各疫苗中，cpg寡聚脫氧核苷酸(佐劑)的序列為：5
′‑
dtsdcsdgsdasdcsdgsdtsdtsdcsdgsdtsdcsdgsdtsdtsdcsdgsdtsdcsdgsdtsdtsdcs-3
′
。
[0068]
(1)氫氧化鋁佐劑+cpg佐劑疫苗
[0069]
將cpg佐劑和氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使cpg佐劑濃度為0.1mg/ml，氫氧化鋁佐劑含量為1mg/ml，疫苗抗原含量10ug/ml。將本疫苗編號記為b1；
[0070]
將cpg佐劑和氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使cpg佐劑濃度為0.1mg/ml，氫氧化鋁佐劑含量為1mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。將本疫苗編號記為b2；
[0071]
將cpg佐劑和氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使cpg佐劑濃度為0.1mg/ml，氫氧化鋁佐劑含量為1mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。將本疫苗編號記為b3；
[0072]
將cpg佐劑和氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使cpg佐劑濃度為0.1mg/ml，氫氧化鋁佐劑含量為1mg/ml，疫苗抗原含量100ug/ml。將本疫苗編號記為b4；
[0073]
將cpg佐劑和氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使cpg佐劑濃度為0.1mg/ml，氫氧化鋁佐劑含量為1mg/ml，疫苗抗原含量250ug/ml。將本疫苗編號記為b5。
[0074]
(2)角鯊烯成份swe佐劑疫苗
[0075]
將swe佐劑加入疫苗原液，使swe佐劑濃度為0.5mg/ml，疫苗抗原含量10ug/ml。將本疫苗編號記為a1；
[0076]
將swe佐劑加入疫苗原液，使swe佐劑濃度為0.5mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。將本疫苗編號記為a2；
[0077]
將swe佐劑加入疫苗原液，使swe佐劑濃度為0.5mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。將本疫苗編號記為a3；
[0078]
將swe佐劑加入疫苗原液，使swe佐劑濃度為0.5mg/ml，疫苗抗原含量100ug/ml。將本疫苗編號記為a4；
[0079]
將swe佐劑加入疫苗原液，使swe佐劑濃度為0.5mg/ml，疫苗抗原含量250ug/ml。將本疫苗編號記為a5。
[0080]
(3)鋁佐劑疫苗
[0081]
將氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使氫氧化鋁佐劑濃度為1mg/ml，疫苗抗原含量10ug/ml。將本疫苗編號記為c1；
[0082]
將氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使氫氧化鋁佐劑濃度為1mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。將本疫苗編號記為c2；
[0083]
將氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使氫氧化鋁佐劑濃度為1mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。將本疫苗編號記為c3；
[0084]
將氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使氫氧化鋁佐劑濃度為1mg/ml，疫苗抗原含量100ug/ml。將本疫苗編號記為c4；
[0085]
將氫氧化鋁佐劑加入疫苗原液，使氫氧化鋁佐劑濃度為1mg/ml，疫苗抗原含量250ug/ml。將本疫苗編號記為c5。
[0086]
(4)聚肌胞佐劑疫苗
[0087]
將聚肌胞佐劑加入疫苗原液，使聚肌胞佐劑濃度為0.8mg/ml，疫苗抗原含量10ug/ml。將本疫苗編號記為d1；
[0088]
將聚肌胞佐劑加入疫苗原液，使聚肌胞佐劑濃度為0.8mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。將本疫苗編號記為d2；
[0089]
將聚肌胞佐劑加入疫苗原液，使聚肌胞佐劑濃度為0.8mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。將本疫苗編號記為d3；
[0090]
將聚肌胞佐劑加入疫苗原液，使聚肌胞佐劑濃度為0.8mg/ml，疫苗抗原含量100ug/ml。將本疫苗編號記為d4；
[0091]
將聚肌胞佐劑加入疫苗原液，使聚肌胞佐劑濃度為0.8mg/ml，疫苗抗原含量250ug/ml。將本疫苗編號記為d5。
[0092]
(3)皂苷佐劑疫苗
[0093]
將皂苷佐劑加入疫苗原液，使皂苷佐劑濃度為0.5mg/ml，疫苗抗原含量25ug/ml。
將本疫苗編號記為e1；
[0094]
將皂苷佐劑加入疫苗原液，使皂苷佐劑濃度為0.5mg/ml，疫苗抗原含量50ug/ml。將本疫苗編號記為e2。
[0095]
2、實驗方法：將製備的不同佐劑和不同抗原含量的疫苗，分別經肌肉注射免疫balb/c小鼠(購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，spf級，雌性，7-8周齡)，分別在0、21d各免疫1針，劑量100μl，分別在14d和35d取血清，測量動物血清與抗原結合效價、ace2競爭結合、中和抗體滴度。sars-cov-2voc不同變異beta株(gd2021，b.1.351)、wild-type株(hub01，lineage b)、delta株(cq2021，b.1.617.2)和omicron株(ba.1strain(omi-2))均由中國疾控中心病毒病所分離並保存。
[0096]
表2統計結果表明，在結合效價指標上，加入佐劑後可以有效刺激小鼠體內產生更高的抗體水平，cpg+鋁佐劑+抗原組高於swe佐劑組，高於鋁佐劑+抗原組；相比只配伍鋁佐劑組，swe和cpg+鋁佐劑可以明顯降低抗原的使用劑量。
[0097]
實施例5疫苗不同抗原劑量和免疫方案的免疫學效果評價
[0098]
將cpg含量為0.1mg/ml和氫氧化鋁佐劑含量為1mg/ml，且分別含有18ug/ml、36ug/ml、72ug/ml重組新型冠狀病毒s蛋白三聚體抗原的疫苗，分別經肌肉注射免疫balb/c小鼠(購自斯貝福(北京)生物技術有限公司，spf級，雌性，6-8周齡)，免疫和取材具體時間見表3。處死的小鼠取外周血血清和脾臟，製備脾單細胞懸液，開展ifn-γ，il-4，il-2和il-6elispot分析。
[0099]
不同時間點各組疫苗免疫小鼠脾細胞中分泌細胞因子的抗原特異性t細胞頻數匯總見表4。
[0100]
免疫期間，小鼠對所有疫苗產品均表現出很好的耐受性，各組小鼠體重正常，無異常表現，一般狀態良好。
[0101]
關於elispot結果，各佐劑配伍抗原免疫小鼠可誘導非常明顯的細胞免疫應答。從劑量方面看，抗原劑量3是最佳劑量。佐劑配伍抗原免疫可以更好的誘導偏向th1的免疫反應，且減少和平衡th2的免疫反應。
[0102]
表3動物免疫方案
[0103]
[0104][0105]
表4抗原特異性t細胞頻數匯總表(平均值
±
標準差)
[0106][0107]
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之做一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
[0108]
[0109]