轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用於種子包衣添加劑的製作方法
2023-10-06 15:35:19
專利名稱：轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用於種子包衣添加劑的製作方法
技術領域：
本發明涉及種子包衣技術，特別是轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用於種子包衣添加劑。
農作植物病害包括細菌、真菌和病毒病害。青枯病是一種細菌性病害，對馬鈴薯危害可減產25％，嚴重時導致絕收。中國農科院生物技術研究中心將人工合成抗菌肽基因導入我國馬鈴薯主栽品種米拉，獲得抗病性提高1-Ⅲ級的轉基因馬鈴薯株系。目前，抗菌肽基因，已經供給國內外10多個研究單位，進行抗水稻白葉枯病、馬鈴薯軟腐病、花生和番茄的青枯病、大白菜軟腐病、柑桔細菌性潰瘍病、桑樹和桉樹青枯病、櫻桃根腫病等基因工程的研究。
抗真菌病害的基因工程研究近幾年很活躍，科學家們已經把幾丁質酶基因、葡聚糖酶基因轉入菸草，轉基因菸草表現抗病作用。此外，抗病毒的基因工程國內進展也很快。中科院微生物研究所、北京大學已得到抗菸草花葉病毒和黃瓜花葉病毒的轉基因菸草，並在東北、山東、河南等地區大面積試種。在水稻研究中已獲得了抗矮縮病毒的基因工程植株。不少單位也將抗菌肽基因相繼在水稻、大豆、番茄等作物上做試驗獲得很好效果，將抗菌肽基因轉到水稻裡，培育出的植株能抗水稻常見的白葉枯病，並能穩定遺傳。
目前防治農作物病害仍然大量使用噴灑型、帶毒性的化學農藥為主，對環境有嚴重汙染，嚴重危害人類的生存和健康。轉基因技術將抗病基因直接轉入農作物中，因它是取之自然物種，方法先進，貼近自然，對環境和人類健康意義重大。現在研究證實1、抗菌肽廣泛存在於動物(昆蟲)、植物和微生物體內，採用一般提取純化方法難於獲取大量抗菌肽。
2、正常生物體內抗菌肽降低或消失，就會出現細菌、真菌、病毒等感染而發生病害。
3、生物體在一定條件誘導下如物理學、化學、生物學等都能提高抗菌肽含量。用現代生物技術，重組抗菌肽基因均能在不同生物體內互相轉移一即轉基因抗菌肽，如柞蠶抗菌基因可轉入沙田柚。
4、提取、純化的抗菌肽包括天然的、合成的、基因的，其結構功能和特異性差異很小，也就是說種屬差異性不明顯，只有因抗菌肽種類不同作用強弱，範圍有存在差異。因此，同一種抗菌肽可以用於不同動、植物和微生物，如基因酵母菌抗菌肽可以抗植物的病原微物。
本發明的目的是利用種子包衣技術，提供一種轉基因家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用於種包衣添加劑，來防治農作物病蟲害，取代現代化學藥物。
轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用於種子包衣添加劑，每100ml中包括，抗菌肽500-1000單位，吸水劑0-1％，磷礦粉2.5％,1065粉2.5％，硫酸鋅1％，甲基纖維4％，硼砂0-1.5％，石膏粉0-5％，加水至100ml。
按每公斤包衣劑加5000-10000單位基因抗菌肽活性蛋白，用0.5％-1％的吸水劑進行種子塗層處理，晾乾，再將可作粘著劑用的4％甲基纖維素溶液按40ml拌0.5kg種子的比例充分拌勻，放入包衣機，邊旋轉邊加入製衣材料，並不斷稍加(在包衣中)噴水，待種料比1∶(4-5)時即可。
一、轉基因抗菌肽蠅蛆繁育提取工藝流程家蠅雖然沒有完善的免疫防禦體系，但卻具有高效的無細胞免疫系統。抗菌肽是家蠅免疫後血淋巴中的一類抗菌多肽，它具有分子量小，熱穩定，水溶性好，無免疫原性，抗菌譜廣等特點。現在，它被認為是從細菌到高等哺乳動物普遍存在的一類防禦性多肽，稱之為「第二防禦體系」。抗菌肽不僅抗菌譜廣，而且可以抑殺某些真菌、病毒及原蟲，並對多種癌細胞及動物實全瘤有明顯的殺傷作用，而不破壞正常細胞。
抗菌肽即將成為一代新的抗菌、抗病毒抗癌藥物。但天然抗菌肽的來源少，成本高，無法滿足實際應用的需要。因此我們通過DNA重組技術實現轉基因抗菌肽蠅蛆繁育家蠅收集蠅蛆獲得大量抗菌肽已成為現實。其工藝流程是抗菌肽基因工程家蠅的構建→擴大工程蠅繁育→收集蠅蛆→蠅蛆滅菌技術處理→蠅蛆抗菌肽含量測試→低溫深凍、貯存原料→低溫粉碎、製成超微勻漿→抽提去除雜質→濃縮→分離乾燥→鑑定各項指標→調配不同規格製品→用於科子包衣添加劑。
該工藝具有如下顯著優點工藝過程簡便；技術穩定，具有很高的重複性；表達效率高，抗菌肽的收率可達到0.60mg/ml；規模靈活，改變工藝規模時不需要重新通過中試校驗工藝參數；轉基因工程家蠅蠅蛆繁育快，含量高，原料供應豐富並且價格低廉，適宜規模化生產。
二、基因抗菌肽用於種類包衣添加劑的作用特點抗菌肽是一種有35個胺基酸組成的多肽化合物，其分子量為3835道爾頓，等電點大約為10左右，具有優良的耐熱性，對極端的PH值環境和離子強度環境也具有優良的抗性，同時，抗菌肽對胃蛋白酶具有一定程度的耐受性。
抗菌肽N端富含賴氨酸和精氨酸等陽離子型胺基酸，C端富含丙氨酸、纈氨酸和甘氨酸等非極性胺基酸並且醯胺化，其中間部墜毀則富含脯氨酸。通過對抗菌肽的圓二色性分析，抗菌肽表明能夠在一事實上條件下形成α-螺旋和β-摺疊。抗菌肽的α-螺旋具有近科完美的兩親性，被普遍認為是抗菌肽活性的結構基礎。抗菌肽除了表現出對細菌具有強大的殺傷作用外，還表現出了對腫瘤細胞和真菌以及部分病毒的強大殺傷作用。種子進行種衣劑包衣，是集多學科成果於一體的綜合性高新技術，基因抗菌肽作為添加劑是增加科技含量的重要組成部分，也是防制農作物病害重要措施，有十分顯著的經濟效益。
三、基因抗菌肽種子包衣添加劑的應用範圍將基因抗菌肽現代生物工程技術應用於種子包衣，是一種新型種衣添加劑可廣泛用於小麥、玉米、花生、芝麻、大豆以及蔬菜、水果、花卉等和種衣添加劑。它是一種可有效殺死真菌的蛋白質，殺菌力強，抗菌譜廣，分子量小。對動物(包括人體)及植物無毒、無害，對環境也不會造成汙染，是一種符合現代農業要求的環保型生物農藥。
實施例1芝麻是重要的經濟作物，為了解決與小麥騰薦接口，控制病害發生，提高單位產量，節省種子，用基因抗菌肽製作芝麻的包衣，這是因為包衣處理芝麻給芝麻穿上一層融吸水、營養、殺蟲殺藥保護衣，對苗期病菌害防治效果達100％，增產效果達45％以上，而且籽粒飽滿，成熟度高，1000粒增重明顯，具體實施方法是按每公斤包衣劑加8000單位活性基因抗菌肽蛋白，用1％吸水劑進行芝麻種子淨層處理，晾乾，再將4％甲基纖維溶解液粘著劑按40ml拌0.5公斤芝麻種子的比例充分拌勻放入大盆，用棒旋轉攪拌使其將種子均勻，此不斷加2.5％磷礦粉，2.5％1065粉，1％硫酸鋅，邊加邊噴水，待種料成1∶6即可。用此種辦法處理，可隨處理隨時播種，也可存放20天內，若長期貯存可在最後工序中加膜製劑使芝麻種子外形成一層膜，以保護營養水份及相關成分不丟失和失活。
實施例21、首先稱取10公斤待包衣種子，置於盆式器皿中或足夠大的塑料薄膜上。然後將含有8000單位基因抗菌肽，1公斤乳劑倒在種子上，用不傷害種子的木棍或其它可以攪拌的工具，將種子與乳劑攪拌，或用手看著塑料薄膜的四個角反覆折混，直到包衣均勻。
2、將包了衣的種子分散攤放在塑料薄膜上或乾淨的地面上，在無陽光直接照射的地方，自然風乾後即可播種。
3、最好在播種前一天包衣，風乾至不粘即可播種。若有必要可以採用機械方法按上述過程包衣。
注乳劑中可按一定上比例複合配有強力吸收劑，微肥，稀土元素、微量元素，植物調節劑、抗菌肽生物農藥，抗旱節水，營養調節為一體，獲更大經濟效益，社會效益與環境效益。
權利要求
1.轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用於種子包衣添加劑，每100ml中包括，抗菌肽500-1000單位，吸水劑0-1％，磷礦粉2.5％1065粉2.5％，硫酸鋅1％，甲基纖維4％，硼砂0-1.5％，石膏粉0-5％，加水至100ml。
2.根據權利要求1所述的基因抗菌肽用於種子包衣添加劑，按每公斤包衣劑加5000-10000單位基因抗菌肽活性蛋白，用0.5％-1％的吸水劑進行種子塗層處理，晾乾，再將可作粘著劑用的4％甲基纖維素溶液按40ml拌0.5kg種子的比例充分拌勻，放入包衣機，邊旋轉邊加入製衣材料，並不斷稍加(在包衣中)噴水，待種料比1∶(4-5)時即可。
3.根據權利要求1所述的基因抗菌肽用於種子包衣添加劑，按每公斤包衣劑加8000單位活性基因抗菌肽蛋白，用1％吸水劑進行芝麻種子淨層處理，晾乾，再將4％甲基纖維溶解液粘著劑按40ml拌0.5公斤芝麻種子的比例充分拌勻放入大盆，用棒旋轉攪拌使其將種子均勻，不斷加2.5％磷礦粉，2.5％1065粉，1％硫酸鋅，邊加邊噴水，待種料成1∶6即可。
4.轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用於種子包衣添加劑，含轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽和種子包衣添加劑可接受的載體。
全文摘要
本發明涉及種子包衣技術,特別是轉基因抗菌肽家蠅繁育蠅蛆中提取基因抗菌肽用於種子包衣添加劑。用蠅蛆原料提取,真空冷凍乾燥成為基因抗菌肽生物製品,用於種子包衣添加劑,抗農作物細菌、病毒和真菌,取代化學農藥,它有效殺死真菌蛋白質,殺菌力強,抗菌譜廣,分子量小,對人、動物和植物無毒、無害、無環境汙染,是符合現代農業要求的環保型生物農藥。
文檔編號A01N59/26GK1312003SQ0110636
公開日2001年9月12日 申請日期2001年3月26日 優先權日2001年3月26日
發明者苟仕金, 苟鴻鷹, 王成餘 申請人:遼寧天成生物製藥研究所