具有葡糖澱粉酶活性的多肽及其製備方法

2023-10-25 12:44:52

具有葡糖澱粉酶活性的多肽及其製備方法
【專利摘要】本發明涉及具有葡糖澱粉酶活性且具有改善的特性的多肽，和涉及包含適用於生產食品、飲料(例如啤酒)、飼料或者生物燃料的這些多肽的組合物。還描述了適用於大規模蛋白質純化程序的用於分離葡糖澱粉酶的改進和成本效益好的方法。此外，公開了例如在釀造工藝中與根據本發明的葡糖澱粉酶有關的不同方法和用途。
【專利說明】具有葡糖澱粉酶活性的多肽及其製備方法[000? ] 序列表的引用
[0002]所附的是包括SEQ ID NO:1_17的序列表，其全文以引用的方式併入本文。
【技術領域】
[0003]本發明涉及具有葡糖澱粉酶活性且具有改善的特性的多肽，和涉及包含適用於生產食品、飲料(例如啤酒)、飼料或者生物燃料的這些多肽的組合物。還描述了適用於大規模蛋白質純化程序的用於分離葡糖澱粉酶的改進的和成本效益好的方法。此外，公開了例如在釀造工藝中與根據本發明的葡糖澱粉酶有關的不同方法和用途。
【背景技術】
[0004]葡糖澱粉酶(葡聚糖1，4_α -葡糖水解酶，EC 3.2.1.3)是澱粉水解外切作用糖酶，其催化從澱粉或相關的寡糖和多糖分子的非還原末端移除連續的葡萄糖單位。葡糖澱粉酶可水解澱粉(如直鏈澱粉和支鏈澱粉)的直鏈的和分支的糖苷鍵。
[0005]葡糖澱粉酶由多種細菌、真菌和植物的株系產生。某些真菌葡糖澱粉酶例如從麴黴菌屬(Aspergillus)的菌株產生和分泌。
[0006]其他真菌(例如紅麴黴(Monascus))在發酵食品的製備中具有悠久的傳統。例如，紅麴黴菌株在中國和日本已 用於製造豆腐。歷史上，真菌主要用作食品添加劑。通常使該生物體在稻米上生長，乾燥並研磨，並且作為「紅米」(RotReis)添加到肉製品。多種食物成分也由紅麴黴物種產生。例如，在家庭和工業中使用的色素由紫紅麴黴(Monascuspurpureus)產生。
[0007]紅麴黴還用作替代藥物。例如，紅曲米是受紫紅麴黴感染的稻米，它是被認識到能降低血液膽固醇的天然食品。活性組分HMG-CoA還原酶抑制劑可降低總的血液膽固醇以及血液LDL膽固醇水平，甚至可逆轉冠狀動脈疾病。由紫紅麴黴製得的產品被稱為莫那可林K (Monacolin K)或紅曲膠囊(Cholestin)(華茂公司(Pharmanex))。
[0008]也已提出將紅麴黴發酵提取物充當抗癌藥物，如美國專利申請公布N0.2004/0081663 Al中所公開的。如美國專利N0.6，613，365所公開的，描述了高粱紅麴黴(Monascus kaoliang)在動物飼料中的用途。
[0009]JP2007097462描述了培養紫紅麴黴以產生液體曲(用於製作發酵食品/飲料)，其具有可檢測的葡糖澱粉酶活性。
[0010]美國專利N0.4.870，014描述了來自糖化酵母(S.diastaticus)的不耐熱葡糖澱粉酶的克隆，以及其在釀酒酵母(S.cerevisiae)中的表達以供在釀造的發酵步驟期間使用。美國專利N0.4.318，989描述了從樹脂枝孢黴(Cladosporiumresinae)產生葡糖澱粉酶(葡糖澱粉酶和外切支鏈澱粉酶)以供在釀造的發酵步驟期間使用的方法。
[0011]公認的是，葡糖澱粉酶是十分重要的商品酶並且已用於需要對澱粉進行水解(例如，用於從澱粉產生葡萄糖和其他單糖)的廣泛的各種應用中。然而，大部分商品葡糖澱粉酶由黑麴黴(Aspergillusniger)的真菌菌株產生。[0012]來自這些真菌源的分泌的蛋白產物的很大一部分為α -澱粉酶，當目標是分離葡糖澱粉酶時其為不期望的產物。這些不需要的酶和其他背景蛋白質產物的存在減慢了分離所需葡糖澱粉酶的過程，並且不可避免地減小每批次的總產率。因此，仍然需要製備和分離高品質產率的葡糖澱粉酶，同時減少製備過程中的不需要的產物。
[0013]已公開了來自高粱紅麴黴的兩種形式的葡糖澱粉酶的純化和特性(Iizuka etal.，(1977)，J.Gen.Appl.Microbiol.,23(5):217-230 (Iizuka 等人，1977 年，《普通與應用微生物學雜誌》，第 23 卷，第 5 期，第 217-230 頁)；Iizukaet al.，(1978)，J.Gen.Appl.Microbiol.,24:185-192 (Iizuka等人，1978年，《普通與應用微生物學雜誌》，第24卷，第185-192頁))。兩種葡糖澱粉酶據稱在最高至50°C下是穩定的，但是在約60°C _70°C的溫度下葡糖澱粉酶活性急劇下降。兩種形式的葡糖澱粉酶的序列在此文章中或在隨後的出版物中均未公開。 [0014]在澱粉衍生的碳水化合物的水解中使用葡糖澱粉酶在釀造工業中越來越重要，特別是用於生產高發酵度(有時稱為低卡路裡)啤酒。出於與產品穩定性和法規有關的原因，重要的是在最終啤酒中所添加的酶活性被除去/滅活。遺憾的是，當葡糖澱粉酶源自通常來源麴黴屬菌種(Aspergillus spp.),例如黑麴黴(A.niger)和泡盛麴黴(A.awamori)；腐質黴屬菌種(Humicola spp.);籃狀菌屬菌種(Talaromyces spp.),例如埃默森籃狀菌(T.emersonii);阿太菌屬菌種(Athelia spp.),例如羅氏阿太菌(A.rolfsii);青黴屬菌種(Penicillium spp.),例如產黃青黴(P.chrysogenum),並且所述酶在釀造過程中被添加到發酵容器(FV)中時，由於所述酶的熱穩定性，該要求難以滿足。
[0015]雖然將葡糖澱粉酶添加到糖化醪製備容器中，或在麥芽汁煮沸前的任何階段添加，可以避免該問題，但是這引入了其他實際困難。美國專利N0.4，666，718描述了採用包括釀造酶葡糖澱粉酶的反應器的釀造工藝，該釀造酶葡糖澱粉酶固定在固體載體上，由此可從產物回收酶。美國專利N0.5，422，267A描述了採用表達重組葡糖澱粉酶的基因工程酵母的釀造工藝，但是其中該酶由酵母分泌。
[0016]因此，仍然需要例如具有葡糖澱粉酶活性的組合物形式的多肽，其可添加到使用常規設備來製備發酵飲料(例如啤酒)的常規工藝中的任何階段，並且其活性可從最終產物安全地除去。
[0017]將例如組合物形式的具有葡糖澱粉酶活性的多肽添加到在製備發酵飲料中使用的發酵容器(FV)中是特別有效的。益處為例如酶劑量降低、澱粉向可發酵碳水化合物的轉化增加(例如因為異麥芽糖產生量低)，以及酵母應激降低。這種方法並不常用的原因是，活性酶於是可存在於最終產物中，如上所述這是不期望的。市售葡糖澱粉酶一般是熱穩定的，並且在發酵飲料的巴氏滅菌過程中施加的能量不足以使酶失活。因此，還需要不耐熱的葡糖澱粉酶，其可在發酵之後通過巴氏滅菌來滅活。

【發明內容】

[0018]本發明涉及具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，其選自:
[0019]a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽的胺基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性；[0020]b)由以下編碼的多肽:i)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii) SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低嚴格性條件下與i)、?)、或iii)的互補鏈雜交的多核苷酸；
[0021]c)包含胺基酸序列中的一種或多種胺基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述胺基酸序列選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽；
[0022]d)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ ID NO:3或6的成熟多肽編碼序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一性；和
[0023]e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖澱粉酶活性的片段。
[0024]本發明還涉及包含能夠編碼本發明的多肽的核苷酸序列的分離的多核苷酸。
[0025]本發明還涉及能夠表達本發明的多肽的核酸。本發明還涉及表達載體例如重組表達載體，以及宿主細胞如包含該核酸或能夠表達本發明的多肽的重組宿主細胞。本發明還涉及具有本發明的多肽的異源表達的宿主細胞。本發明還涉及分離、製備和/或表達本發明的多肽的方法。
[0026]本發明還涉及包含本發明的一種或多種多肽的組合物。
[0027]本發明還涉及本發明的多肽或組合物在發酵中的用途，其中在發酵步驟之前或期間添加所述多肽或組合物。
[0028]本發明還涉及 本發明的不耐熱多肽用於提高釀造工藝的發酵步驟中可發酵糖的產量的用途。
[0029]本發明還涉及包括在發酵步驟之前或期間添加本發明的多肽或組合物的方法。
[0030]本發明還涉及發酵飲料，其中該發酵飲料由本發明的方法製得。
[0031]本發明還涉及生產食品、飼料或飲料產品(例如醇飲料或無醇飲料，例如像啤酒或威士忌的基於穀類或麥芽的飲料，例如葡萄酒、蘋果酒、醋、米酒、醬油或果汁)的方法，所述方法包括用本發明的多肽或組合物來處理含有澱粉和/或糖的植物材料的步驟。
[0032]本發明還涉及試劑盒，其包含本發明的多肽或組合物；以及所述多肽或組合物的使用說明書。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0033]圖1示出了包括高粱紅麴黴在內的多種野生型真菌菌株的發酵液的SDS-PAGE分析。
[0034]圖2示出了高粱紅麴黴的發酵液的SDS-PAGE分析，其示出了兩條蛋白條帶，其中一個條帶的尺寸類似於其他絲狀真菌的葡糖澱粉酶的尺寸範圍(62kDa)，而第二條帶為約49kDa。
[0035]圖3示出了高粱紅麴黴的發酵液樣品的另一個SDS-PAGE分析，其示出了約62kDa的蛋白條帶。
[0036]圖4示出了與黑麴黴的發酵液(右邊樣品)相比，高粱紅麴黴的發酵液(左邊樣品)的SDS-PAGE分析。黑麴黴的發酵液(右邊樣品)包含分泌的α-澱粉酶，而高粱紅麴黴的發酵液(左邊樣品)僅示出了葡糖澱粉酶。
[0037]圖5示出了與來自黑麴黴的葡糖澱粉酶(AnGA)相比，在來自高粱紅麴黴的葡糖澱粉酶(MkGA)的存在下乙醇產生的速率和產率。當劑量同樣地為0.325葡糖澱粉酶單位/g液化澱粉的幹固形物(DS)時，用MkGA產生乙醇的速率比用AnGA產生乙醇的速率快。當劑量為0.4葡糖澱粉酶單位/g DS時，用MkGA產生乙醇的速率甚至更快。無論劑量或酶如何，最終乙醇產率是相當的。
[0038]圖6示出了在來自黑麴黴的葡糖澱粉酶(AnGA)或來自高粱紅麴黴的葡糖澱粉酶(MkGA)的存在下，液化澱粉的酵母發酵之後剩餘的不溶性殘餘澱粉的量。葡糖澱粉酶的劑量:在左側試管中每克液化澱粉幹固形物325單位AnGA ;在中央和右側試管中分別為每克液化澱粉幹固形物325單位和400單位MkGA。
[0039]圖7示出了在175小時的時間段內，在存在或不存在DIAZYMΕκ: X4或相等數量的高粱紅麴黴葡糖澱粉酶(MkGA)單位的情況下，在麥芽汁的酵母發酵過程中的重量損失。對照沒有酶。
[0040]圖8示出了添加了 MkGA I>MkGA I1、DIAZYME? X4及未添加酶的發酵麥芽汁的HPLC碳水化合物分析。列出的組分在發酵過程的不同時間點，通過HPLC (Phenomenex RSO寡糖柱、RI檢測器)由乙醇、甘油和葡萄糖的外標進行定量(％w/v)。
[0041]圖9示出了在72°〇下，八)皿1^八1、8)1^八11和0 DIΑΖΥΜΕ" Χ4(使用β-D-麥
芽糖苷底物)的殘餘葡糖澱粉酶活性與巴氏滅菌時間和巴氏滅菌單位(PU)的函數關係。在皇家比爾森啤酒(Royal Pilsner)(實心方形)、百威比爾森啤酒(Budweiser Pilsner)(三角形)、紐卡斯爾棕啤(Newcastle Brown ale)(實心圓形)、Thisted bryghus波特酒(Thisted bryghus Porter)(方形)啤酒和pH(4.7)的0.1M乙酸鈉(虛線)中測量殘餘葡糖澱粉酶活性。結果示為2次測定的平均值。
[0042]圖10為MkGA Ι/II基因組和⑶S序列的示意性圖譜。
[0043]圖11為不同高粱紅麴黴葡糖澱粉酶序列的5個表達質粒的示意性圖譜和目的載體pTTT-pyrG13的示意性圖譜。
[0044]圖12示出了表達如下不同高粱紅麴黴GA編碼序列的紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)發酵樣品的 SDS-PAGE:1，MkGA II 基因組克隆；2，MkGA II cDNA 克隆；3，MkGA I基因組克隆；4，MkGA I cDNA克隆；5，從上遊ATG開始的MkGA I基因組克隆；6，受體菌株。在10% SDS-PAGE上的每泳道上樣20 μ I的經過濾的培養樣品。GA特異性條帶用箭頭來指
/Jn ο
[0045]圖13示出了表達兩種不同高粱紅麴黴GA編碼序列(MkGAI和MkGAII)的紅褐肉座菌發酵樣品和兩種純化的來自高粱紅麴黴的GA的SDS-PAGE。
[0046]圖14示出了使用麥芽浸膏麥芽汁對施加到FV的具有相似活性(10M-GAU)的所列GA(發酵物、純化的蛋白質和產物)所測定的RDF值。結果為2次測定的平均值。誤差條為土標準偏差。
【具體實施方式】
[0047]葡糖澱粉酶在要求澱粉水解的廣泛應用中是商業上重要的酶。本文所公開的是基於高粱紅麴黴來源葡糖澱粉酶MkGA I和MkGA II的表徵具有葡糖澱粉酶活性的多肽，其包含從高粱紅麴黴純化的編碼葡糖澱粉酶MkGA I和MkGA II的胺基酸序列和DNA序列。還描述了適用於大規模蛋白質純化程序的用於分離本文所公開的葡糖澱粉酶或其變體的改進的和成本效益好的方法。
[0048]此外，本文描述了來自高粱紅麴黴的兩種葡糖澱粉酶中的特別一者MkGA I及其變體在例如啤酒發酵過程中添加到發酵容器中是非常有用的，因為該酶的合適的不耐熱性使得通過巴氏滅菌來滅活成為可能。
[0049]巴氏滅菌實驗已經以實驗室規模、中試規模和全規模對啤酒進行，以評估在釀造過程中使本文所述的多肽失活的能力。在全規模的隧道式巴氏滅菌器中對含葡糖澱粉酶的瓶裝啤酒驗證實驗室規模的巴氏滅菌(數據未示出)。已證實MkGA I顯著地比若干其他受試葡糖澱粉酶更不耐熱，並且可作為用小於50個單位(PU)完全滅活的唯一受試葡糖澱粉酶，50個單位(PU)為普通啤酒的巴氏滅菌的平均上限。MkGA I和MKGA II在緩衝液中的熱穩定性之前已有研究(Iizuka et al.， (1977), J.Gen.Appl.Microbiol.,23(5):217-230 (Iizuka等人，1977年，《普通與應用微生物學雜誌》，第23卷，第5期，第217-230頁);Iizuka et al., (1978), J.Gen.Appl.Microbiol.，24: 185-192 (Iizuka 等人，1978 年，《普通與應用微生物學雜誌》，第24卷，第185-192頁))，然而據觀察，與緩衝溶液相比，MkGA I在啤酒中的穩定性更低。與之前使用的0.1M乙酸鈉緩衝液(pH 4.7)相比，MkGAI在各種脫氣啤酒(pH 4.3-4.6)中的熱穩定性顯著更小(Iizuka et al.，(1977)，J.Gen.Appl.Microbiol.,23(5):217-230 (Iizuka等人，1977年，《普通與應用微生物學雜誌》，第 23 卷，第 5 期，第 217-230 頁)；Iizuka et al.， (1978)，].Gen.Appl.Microbiol.，24:185-192 (Iizuka等人，1978年，《 普通與應用微生物學雜誌》，第24卷，第185-192頁))，這導致小於50PU就使MkGA I在啤酒中完全滅活，但在乙酸緩衝液中沒有完全失活。因此，本發明人出乎意料地發現，MkGA I在啤酒中足夠不耐熱而可通過巴氏滅菌完全滅活，而同時在整個啤酒發酵過程中保持高性能。
[0050]然而，MkGA I在高粱紅麴黴中的低表達使其在商業上沒有吸引力。因此,本發明人進一步鑑定了包含特定信號肽序列的MkGA I的基因組DNA序列，其一起使例如MkGA I和MkGA II能夠異源表達,例如在裡氏木黴(Trichodermareesei)中表達。
[0051]1.定義
[0052]除非另有定義，否則本文所用的所有技術和科學術語都具有本公開文本所屬【技術領域】普通技術人員通常理解的含義。Singleton et al., Dictionary of MicrobiologyAnd Molecular Biology, 2nded., John Wiley and Sons, New York (1994) (Singleton 等人，《微生物學與分子生物學詞典》，第2版，約翰威立父子出版公司，紐約，1994年)和Hale& Markham, The Harper Collins Dictionary Of Biology, Harper Perennial, N.Y.(1991)(Hale和Marham，《哈普柯林斯生物學詞典》，哈珀永久出版社，紐約，1991年)為技術人員提供了本文所用許多術語的通用意義。為了清楚和引用方便起見，在下文中還是定義了某些術語。
[0053]如本文所用，術語「葡糖澱粉酶」 (EC 3.2.1.3)是指催化從澱粉和相關寡糖及多糖的非還原末端釋放D-葡萄糖的酶。
[0054]如本文所用，術語「MkGA」是指從高粱紅麴黴的發酵產生的兩種葡糖澱粉酶變體MkGA I和MkGA II的混合物。
[0055]如本文所用，術語「MkGA I」是指來自高粱紅麴黴的沒有澱粉結合域(SBD)的較小葡糖澱粉酶變體。
[0056]如本文所用，術語「MkGA II」是指來自高粱紅麴黴的具有澱粉結合域(SBD)的葡糖澱粉酶變體。
[0057]如本文所用，涉及核酸或多肽序列的「同源序列」和「序列同一性」是指當進行最佳比對以便比較時與核酸序列或多肽序列具有約至少100%、至少99%、至少98%、至少97%、至少96%、至少95%、至少94%、至少93%、至少92%、至少91%、至少90%、至少88%、至少85%、至少80%、至少75%、至少70%、至少65%、至少60%、至少55%、至少50%、或至少45%序列同一性，其中候選核酸序列或多肽序列的功能基本上跟與候選同源序列相比較的核酸序列或多肽序列相同。在一些實施例中，同源序列具有至少約85%和100 %之間的序列同一性，而在其他實施例中，存在約90 %和100 %之間的序列同一性，並且在其他實施例中，存在至少約95%和100%的序列同一性。
[0058]使用本領域中已知的標準技術來測定同源性(參見例如Smith and Waterman,Adv.Appl.Math.2:482 (1981) (Smith 和 Waterman,《應用數學進展》，第 2 卷，第 482 頁，1981年)；Needleman and ffunsch, J.Mol.Biol.48:443 (1970) (Needleman 和 ffunsch,《分子生物學雜誌》，第 48 卷，第 443 頁，1970 年)；Pearson and Lipman, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA85:2444(1988) (Pearson和Lipman,《美國國家科學院院刊》，第85卷，第2444頁，1988年)；威斯康星遺傳學軟體包(WisconsinGenetics Software Package)(威斯康星州麥迪遜市遺傳學計算機集團(Genetics Computer Group, Madison, WI))中的程序，例如 GAP、BESTHT>FASTA 和 TFASTA ;和 Devereux el al.，Nucleic Acid Res.，12:387-395 (1984) (Devereux 等 人，《核酸研究》，第12卷，第387-395頁，1984年))。
[0059]「核酸序列同一性百分數) 」或「胺基酸序列同一性百分數) 」定義為候選序列中的核苷酸殘基或胺基酸殘基與起始序列的核苷酸殘基或胺基酸殘基相同的百分數。可在起始序列的整個長度上測量序列同一性。
[0060]通過已知的序列比對方法來測定同源序列。通常使用的比對方法為Altschul等人所描述的 BLAST (Altschul et al.，J.Mol.Biol.215:403-410 (1990) (Altschul 等人，《分子生物學雜誌》，第 215 卷，第 403-410 頁，1990 年)；和 Karlin et al, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 90:5873-5787(1993) (Karin等人，《美國國家科學院院刊》，第90卷，第5873-5787頁，1993年))。特別有用的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(參見Altschul et al, Meth.Enzymol.266:460-480 (1996) (Altschul 等人，《酶學方法》，第 266 卷，第 460-480 頁，1996年))。WU-BLAST-2使用數個搜索參數，其中大多數被設置為默認值。可調節的參數設定為以下值:重疊跨越(overlap span) = I,重疊分數(overlap fraction) = 0.125,字長閾值(word threshold) (T) = 11。HSP S和HSP S2參數是動態的值，並且取決於具體序列的組成和據以對所關注序列進行檢索的具體資料庫的組成而由程序本身確立。然而，可調節所述值以增加靈敏度。
[0061]胺基酸序列同一性百分數值是由匹配的相同殘基的數目除以比對區域中「較長」序列的殘基總數來確定。所述「較長」序列是在比對區域中具有最多實際殘基的序列(忽略由WU-Blast-2引入以使比對得分最大化的空位)。
[0062]其他方法可用於比對序列。可用的算法的一個例子是PILEUP。PILEUP利用漸進性雙序列比對從一組相關序列產生多序列比對。其還可以繪出關係樹，該關係樹示出了用於產生比對的聚類關係。PILEUP使用Feng和Doolittle的漸進比對方法的簡化形式(Fengand Doolittle, J.Mol.Evo1.35:351-360 (1987) (Feng 和 Doolittle,《分子進化雜誌》，第35卷,第351-360頁，1987年))。該方法類似於Higgins和Sharp所描述的方法(Higginsand Sharp，CABIOS 5:151-153(1989) (Higgins和Sharp，《計算機在生物科學中的應用》，第5卷，第151-153頁，1989年))。可用的PILEUP參數包括:默認空位權重=3.00，默認空位長度權重=0.10，以及加權的末端空位。
[0063]在另一個方面，一個胺基酸序列與另一個胺基酸序列的同一性百分數通過使用具有如下默認設置的蛋白質-蛋白質Blast搜索(http://blast, ncb1.nlm.nih.rov)來測定:得分矩陣:blosum62,非冗餘蛋白質序列資料庫和blast算法
[0064]
設置期望閾值10
查詢範圍中的最大匹配O
空位開放罰分11
空位延伸罰分I
組成調節:
條件性組成得分
矩陣調節
屏蔽和過濾無
[0065]術語「最佳比對」是指給出最高同一性百分數得分的比對。
[0066]如本文所用，術語「葡糖澱粉酶變體」或「變體」是用來指這樣的葡糖澱粉酶，其類似於葡糖澱粉酶序列(例如高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I和II序列)，但在其胺基酸序列中具有至少一個使其在序列上不同於葡糖澱粉酶I和/或II的取代、缺失或插入。在一些情況下，對其進行操縱和/或工程改造以在其胺基酸序列中包括至少一個使其在序列上不同於葡糖澱粉酶I和/或II的取代、缺失或插入。
[0067]如本文所用，術語「催化結構域」是指多肽的結構區域，其含有用於催化底物水解的活性位點。
[0068]術語「連接區」是指通常具有3至40個胺基酸殘基的短胺基酸序列，其將包含澱粉結合結構域的胺基酸序列與包含催化結構域的胺基酸序列共價結合。
[0069]術語「澱粉結合域」(SBD)是指優先結合澱粉底物的胺基酸序列。本領域的技術人員熟知如何鑑定SBD-該SBD為碳水化合物結合模塊(CBM)的例子，並且CBM已通過使用基於序列的分類系統被分類為CBM家族(http://www.cazy.0tr/Carbohydrate-Binding-Modules.html)。此外，本領域的技術人員熟知使用生澱粉或β -環糊精親合色譜法來分離包含例如SBD的材料(Hamilton et al.(2000)Enzyme andMicrobial Technology 26 p561_567 (Hamilton 等人，2000 年，《酶與微生物技術》，第 26 卷，第561-567頁))。在一個方面,SBD的結構域定義取自Pfam資料庫(http://pfam.sanRer.ac.uk/ 或 www.sanger.ac.uk/resources/databases/pfam.html)，該蛋白質結構域家方矣資料庫根據序列相似性產生。因此，在一個方面，SBD由Pfam資料庫中的碳水化合物結合模塊20家族定義。
[0070]如本文所用，術語「片段」被定義為這樣的多肽，其從例如SEQ ID NO:3或6的多肽
的氨基和/或羧基末端缺失了一種或多種(若干)胺基酸；其中該片段具有葡糖澱粉酶活性。在一個方面，該片段從SEQ ID NO:3的氨基末端缺失了一種或多種(若干)胺基酸。在一個方面，與野生型相比，並且就MkGA I而言還與MkGA II相比，該多肽在N端或C端中包含較少殘基。
[0071]在一個方面，本文所述的多肽具有至多480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、495、500、505、507、515、525、535、545、555、565 或 573 個胺基酸殘基。
[0072]如本文所用，術語「截短的」是指這樣的多肽，其與野生型蛋白質(或另一種變體)相比未達到其完全翻譯長度，並且因此丟失了存在於野生型蛋白質中的一些胺基酸。截短通常由提前終止突變而導致，但是也可由另一種機制引起-例如翻譯後修飾。
[0073]如本文所用，術語「突變序列」和「突變基因」可互換使用，是指在出現於宿主細胞的親本序列中的至少一個密碼子中具有變更的多核苷酸序列。突變序列的表達產物是相對於葡糖澱粉酶I和/或II具有變更的胺基酸序列的變體蛋白質。表達產物可具有變更的功能能力(例如增強的酶活性或更高的熱穩定性)。
[0074]如本文所用，在多肽的語境中，術語「特性」或其語法上的等價物是指多肽的任何可被選擇或檢測的特徵或屬性。這些特性包括但不限於氧化穩定性、底物特異性、催化活性、熱穩定性、PH活性譜、對蛋白水解降解的抗性、KM、Kcat, Kcat/Km比、蛋白質摺疊、結合底物的能力和被分泌的能力。
[0075]如本文所用，在核酸的語境中，術語「特性」或其語法上的等價物是指核酸的任何可被選擇或檢測的特徵或屬性。這些特性包括但不限於影響基因轉錄的特性(例如，啟動子強度或啟動子識別)、影響RNA加工的特性(例如，RNA剪接和RNA穩定性)、影響翻譯的特性(例如，調節mRNA與核糖體蛋白的結合)。
[0076]術語「熱穩定的」和「耐熱的」是指本公開的葡糖澱粉酶變體，其在澱粉底物水解過程中的常見條件下(例如同時暴露於改變的溫度)，在暴露於一定的溫度達給定時間段後可保留特定量的酶活性。
[0077]在諸如熱穩定性的特性的語境中，術語「增強的穩定性」是指與葡糖澱粉酶I和/或II相比，隨時間推移經測量仍然保持較高的催化活性或澱粉水解活性。
[0078]術語「不耐熱葡糖澱粉酶」是指本公開的葡糖澱粉酶，其在釀造過程的產物的巴氏滅菌期間常見的條件下，在暴露於一定的溫度達給定時間段後失去可檢測的水解酶活性。巴氏滅菌的精確條件(例如巴氏滅菌單位)將取決於通過釀造過程生產的啤酒的類型。巴氏滅菌的啤酒中不耐熱葡糖澱粉酶的可檢測水解活性的損失可使用本文所述的葡糖澱粉酶測定法來檢測，並且可由通過該測定法測得的活性的損失來定義。不耐熱葡糖澱粉酶的例子為具有SEQ ID NO:6的葡糖澱粉酶。
[0079]術語「比活性」定義為每毫克葡糖澱粉酶蛋白的活性。在一些實施例中，葡糖澱粉酶的活性通過乙醇測定法來測定，並且以從澱粉底物產生的葡萄糖的量表示。在一些實施例中，可使用Caliper測定法來測定蛋白質濃度。
[0080]術語「活性的」和「生物學活性的」是指與特定蛋白質相關的生物學活性。因此，給定蛋白質的生物學活性是指本領域技術人員通常歸於該蛋白質的任何生物學活性。例如，與葡糖澱粉酶相關的酶活性是水解活性，因此有活性的葡糖澱粉酶具有水解活性。
[0081] 如本文所用，術語「葡糖澱粉酶活性」是指催化從澱粉和相關寡糖及多糖的非還原末端釋放D-葡萄糖的酶的活性。具體地講，可通過3，5-二硝基水楊酸(DNS)方法來測定葡糖澱粉酶活性(參見 Goto et al.，Biosc1.Biotechnol.Biochem.58:49_54 (1994) (Goto等人，《生物科學生物技術和生物化學》，第58卷，第49-54頁，1994年))。
[0082]術語「多核苷酸」和「核酸」在本文中可互換使用，是指任何長度的多聚形式的核苷酸，無論是核糖核苷酸還是脫氧核糖核苷酸。這些術語包括但不限於單鏈、雙鏈或三鏈DNA、基因組DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA雜合體或者包含嘌呤和嘧啶鹼基或其它天然的、經化學修飾的、經生物化學修飾的、非天然或衍生的核苷酸鹼基的聚合物。
[0083]如本文所用，術語「DNA構建體」、「轉化DNA」和「表達載體」可互換使用，指用於將序列引入宿主細胞或生物體中的DNA。可通過PCR或本領域技術人員已知的任何其它合適的技術在體外產生所述DNA。DNA構建體、轉化DNA或重組表達盒可被摻入到質粒、染色體、線粒體DNA、質體DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了其他序列外，表達載體、DNA構建體或轉化DNA的重組表達盒部分還包括待轉錄的核酸序列和啟動子。在一些實施例中,表達載體具有將異源DNA片段摻入宿主細胞中並使其表達的能力。
[0084]如本文所用，術語「載體」是指多核苷酸構建體，其被設計用於將核酸引入一個或多個細胞類型中。載體包括克隆載體、表達載體、穿梭載體、質粒、盒等。
[0085]如本文所用，在將核酸序列引入細胞中的語境中，術語「引入」是指任何適於將核酸序列轉移進細胞中的方法。此類用於引入的方法包括但不限於原生質體融合、轉染、轉化、接合和轉導。
[0086]如本文所用，術語「轉化的」和「穩定轉化的」是指具有非天然(異源)多核苷酸序列的細胞，所述多核苷酸序列被整合進其基因組中或作為被保持至少兩代的附加型質粒。
[0087]如本文所用，術語 「可選標記」和「選擇性標記」是指能夠在宿主細胞中表達的核酸(例如基因)，其使得能容易地選擇含有該載體的那些宿主。通常，可選標記是這樣的基因，其賦予宿主細胞抗微生物抗性或代謝優勢，以使得可以將含有外源DNA的細胞與在轉化過程中未接受任何外源序列的細胞區分開。
[0088]如本文所用，術語「啟動子」是指起到引導下遊基因的轉錄的作用的核酸序列。啟動子以及其它轉錄和翻譯調控核酸序列(也稱為「控制序列」)是表達給定基因所必需的。通常，轉錄和翻譯調控序列包括但不限於啟動子序列、核糖體結合位點、轉錄起始和終止序列、翻譯起始和終止序列以及增強子或激活物序列。
[0089]當將核酸置於與另一核酸序列存在功能性關係中時，其為「有效連接」(operablylinked)的。例如，如果編碼分泌前導序列(即信號肽)的DNA被表達為參與多肽分泌的前蛋白(pr印rotein)的話，則其可與該多肽的DNA有效連接。通常，「有效連接」意指被連接的DNA序列是連續的，並且在分泌前導序列的情形中，其為連續的且在閱讀相中。
[0090]如本文所用，術語「基因」是指多核苷酸(例如DNA區段)，其編碼多肽且包括編碼區之前和之後的區域，以及各個編碼區段(外顯子)之間的居間序列(內含子)。
[0091]如本文所用，「直系同源物」和「直系同源基因」是指不同物種中通過物種形成而從共同的先祖基因(即同源基因)進化而來的基因。通常，直系同源物在進化的過程中保留了相同的功能。對直系同源物的鑑別可用於可靠地預測新測序的基因組中的基因功能。
[0092]如本文所用，「旁系同源物」和「旁系同源基因」是指因基因組內的複製而相關聯的基因。直系同源物在進化的過程中保留相同的功能，而旁系同源物進化出新的功能，雖然一些功能通常與原始的功能相關。旁系同源基因的實例包括但不限於編碼胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、彈性蛋白酶和凝血酶的基因，它們都是絲氨酸蛋白酶並一起出現在相同的物種中。
[0093]如本文所用，術語「雜交」是指用於使一條核酸鏈通過本領域已知的鹼基配對與互補連結合的方法。
[0094]如果一條核酸序列與參考核酸序列在中等至高嚴格性雜交和洗滌條件下彼此特異性雜交，則該核酸序列被認為是與該參考核酸序列「可選擇性雜交」。雜交條件是基於核酸結合複合物或探針的解鏈溫度(Tm)。例如，「最大嚴格性」通常發生在約Tm-5°C (低於探針的Tm5°C )下；「高嚴格性」在約低於該Tm5-10°C下；「中度嚴格性」在約低於探針的Tm10-20°C下；而「低嚴格性」在約低於該Tm 20-25°C下。功能上，最大嚴格性條件可用於鑑別與雜交探針有嚴格同一 性或接近嚴格同一性的序列；而中度或低嚴格性雜交可用於鑑別或檢測多核苷酸序列同源物。
[0095]中等和高嚴格性雜交條件是本領域所熟知的。高嚴格性條件的例子包括在約42 °C下，在50% 甲醯胺、5XSSC、5X 鄧哈特溶液(Denhardt' s solution)、0.5% SDS和 100 μ g/ml變性載體DNA中雜交，然後在室溫下，在2X SSC和0.5% SDS中洗滌兩次，並且在42°C下，在0.1XSSC和0.5% SDS中再洗滌兩次。中度嚴格性條件的例子包括在37°C下，在包含20%甲醯胺、5XSSC(150mM NaCl、15mM檸檬酸三鈉)、50mM磷酸鈉(ρΗ7.6)、5Χ鄧哈特溶液、10%硫酸葡聚糖和20mg/ml變性剪切鮭魚精子DNA的溶液中過夜溫育，然後在約37-501:下，在1\35(:中洗滌過濾器。本領域的技術人員了解如何根據需要來調整溫度、離子強度等以適應諸如探針長度等的因素。
[0096]如本文所用，「重組的」包括指通過引入異源或同源核酸序列而被修飾的細胞或載體，或是指所述細胞源自經如此修飾的細胞。因此，例如，重組的細胞可表達未在天然(非重組)形式的細胞中以相同形式存在的基因，或者因人為故意幹預而可表達原本異常表達、表達不足或根本不表達的天然基因。
[0097]在一個實施例中，在至少一個密碼子和/或核苷酸中用位點飽和誘變產生突變的DNA序列。在另一個實施例中，對於兩個或更多個密碼子進行位點飽和誘變。在又一個的實施例中，突變DNA序列與葡糖澱粉酶I和/或IIDNA序列具有大於約50%、大於55%、大於60%、大於65%、大於70%、大於75%、大於80%、大於85%、大於90%、大於95%、或大於98%同一性。在替代實施例中，可使用任何已知的誘變程序(例如輻射、亞硝基胍等)在體內產生突變DNA。然後可分離所需的DNA序列並將其用於本文所提供的方法中。
[0098]如本文所用，「異源蛋白」是指不在宿主細胞中天然出現的蛋白質或多肽。
[0099]如果酶在宿主細胞中的表達水平高於其在相應野生型細胞中的表達水平，則該酶在該宿主細胞中「過表達」。
[0100]術語「蛋白質」和「多肽」在本文中可互換使用。在本公開和權利要求書中，使用胺基酸殘基的常規一字母和三字母代碼。胺基酸的三字母代碼遵照生物化學命名聯合委員會(IUPAC-1UB Joint Commission on Biochemical Nomenclature (JCBN))的定義。還應理解，由於遺傳密碼的簡併性，多肽可由不止一種核苷酸序列編碼。
[0101]本公開的變體通過如下命名法描述:[原始胺基酸殘基/位置/取代的胺基酸殘基]。例如，用亮氨酸取代位置76的精氨酸表示為R76L。當在本文中確定適合取代的位置而又沒有提出具體的胺基酸時，應理解任何胺基酸殘基都可取代在該位置中存在的胺基酸殘基。[0102]「原序列(prosequence) 」是在信號序列與成熟蛋白質之間的為蛋白質分泌所必需的胺基酸序列。剪切原序列將產生成熟的活性蛋白質。
[0103]術語蛋白質或肽的「前體」形式是指具有與該蛋白質的氨基或羰基末端有效連接的原序列的成熟形式蛋白質。前體也可具有與原序列的氨基末端有效連接的「信號」序列。前體還可具有涉及翻譯後活性的額外的多核苷酸(例如，從其上被剪切的多核苷酸，該剪切留下成熟形式的蛋白質或肽)。
[0104]「宿主株系」或「宿主細胞」是指用於包含根據本公開的DNA的表達載體的適合宿主。
[0105]術語「源自」和「獲自」不僅是指由所考慮的生物體的株系產生的或可由其產生的葡糖澱粉酶，還指由分離自這種株系的DNA序列編碼並在含有這種DNA序列的宿主生物體中產生的葡糖澱粉酶。此外，該術語指由合成和/或cDNA來源的DNA序列編碼且具有所考慮的葡糖澱粉酶的鑑別特徵的葡糖澱粉酶。
[0106]在此定義範圍內的「衍生物」通常以一定程度保留了在葡糖澱粉酶I和/或II中所觀察到的特徵性水解活性，所述程度使得所述衍生物可用於與所述野生型、天然或親本形式相似的目的。葡糖澱粉酶的功能性衍生物涵蓋具有本公開的葡糖澱粉酶的一般特徵的天然存在的、合成的或重組產生的肽或肽片段。
[0107]術語「分離的」 是指從天然環境中移出的物質(如果其天然存在的話)。「純化的」蛋白質是指被至少部分純化至同質的蛋白質。在一些實施例中，如通過SDS-PAGE所測定的，純化的蛋白質可以是超過約10%純，任選地超過約20%純，以及任選地超過約30%純。如通過SDS-PAGE所測定的，本發明的另外的方面涵蓋高度純化形式的蛋白質(即超過約40 %純、超過約60 %純、超過約80 %純、超過約90 %純、超過約95 %純、超過約97 %純、以及甚至超過約99%純)。
[0108]如本文所用，術語「組合誘變」是指據以產生起始序列的變體文庫的方法。在這些文庫中，變體含有一個或數個選自預定突變組的突變。此外，所述方法提供了手段來引入不是預定突變組的成員的隨機突變。在一些實施例中，所述方法包括美國專利N0.6，582，914中所示的那些，該專利以引用的方式併入本文。在替代實施例中，組合誘變方法涵蓋可商購獲得的試劑盒(例如，加利福尼亞州聖地牙哥Stratagene公司(Stratagene, San Diego,
CA)的QuikCIiange凡 Multisite)。
[0109]如本文所用，術語「組合物」涉及根據本發明製備的例如飲料、食品或飼料成分形式的製品，並且可為溶液形式或作為固體，這取決於用途和/或應用模式和/或施予模式。固體形式可作為乾燥酶粉末或者作為顆粒化酶。組合物可包含根據本發明的多肽、酶載體，以及任選的穩定劑和/或防腐劑。酶載體可選自甘油或水。該製品可包含穩定劑。穩定劑可選自無機鹽類、多元醇類、糖類和它們的組合。此外，穩定劑可為無機鹽，例如氯化鉀。在另一個方面，多元醇是甘油、丙二醇或者山梨糖醇。糖是小分子碳水化合物，具體地講是若干有甜味的小分子碳水化合物如葡萄糖、果糖和蔗糖中的任何一種。在又一個方面，該製品可包含防腐劑。在一個方面，防腐劑是對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸丙酯、苯甲酸鹽、山梨酸鹽或者其他食品批准的防腐劑或者它們的混合物。
[0110]在本發明的上下文中，術語「發酵」是指通過使微生物在培養物中生長來提供組合物，例如發酵飲料和/或物質。在酶(如，葡糖澱粉酶)製備的上下文中，術語「發酵」是指涉及在微生物培養過程中製備酶的方法。在釀造的語境中，術語「發酵」是指麥芽汁中的糖被釀造啤酒用酵母中的酶轉化為乙醇和二氧化碳，伴隨其他發酵副產物的形成。
[0111]如本文所用，「製備發酵飲料(例如啤酒)的方法」一般包括以下步驟:製備糖化醪(例如基於谷粉)，過濾糖化醪以得到麥芽汁和廢糟，以及發酵麥芽汁以得到發酵飲料。
[0112]如本文所用，術語「含有澱粉和/或糖的植物材料」是指可源自任何植物和植物部分的含有澱粉和/或糖的植物材料，所述植物和植物部分包括塊莖、根、莖、葉和種子。例如，「包含澱粉和/或糖的植物材料」可為例如一種或多種穀類，如大麥、小麥、玉蜀黍、黑麥、高粱、粟或稻米以及它們的任何組合。包含澱粉和/或糖的植物材料可被處理，例如碾磨、發芽、部分發芽或未發芽。未發芽的穀類也稱「原糧」。非穀類含澱粉植物材料的例子包括例如塊莖。
[0113]如本文所用，術語「谷粉」是指適於糖化醪製備的任何經處理的含有澱粉和/或糖的植物材料。如本文所設想的，谷粉可包含可源自任何植物和植物部分的任何含有澱粉和/或糖的植物材料，所述植物和植物部分包括塊莖、根、莖、葉和種子。處理的例子包括研磨和/或碾磨，這通常提供比麵粉更粗的材料。在本發明的語境中，谷粉可包含來自穀粒的經處理的材料，例如來自大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、稻米、蜀黍、粟和高粱的穀粒，並且更優選地，至少10%、或更優選至少15%、甚至更優選至少25%、或最優選至少35%,例如至少50%、至少75%、至少90%或甚至100% (重量/重量)的麥芽汁的谷粉源自穀粒。在一些實施例中，谷粉可包含從木薯[Manihot esculenta]根獲得的含有澱粉和/或糖的植物材料。谷粉可包含發芽的穀粒，如大麥麥芽。優選地，至少10%，或更優選至少15%，甚至更優選至少25%，或最優選至少35%，例如至少50%、至少75%、至少90%或甚至100% (重量/重量)的麥芽汁的谷粉源自發芽的穀粒。
[0114]如本文所用， 術語「麥芽」被理解為任何發芽的穀類穀粒，如發芽的大麥或小麥。
[0115]在一個方面，當使用主要從與生產啤酒有關的選定大麥品種產生的麥芽時，麥芽對啤酒的整體特徵和質量影響最大。第一，麥芽是啤酒中主要的風味劑。第二，麥芽提供可發酵糖的主要部分。第三，麥芽提供蛋白質，其將促成啤酒的酒體和泡沫特徵。第四，麥芽在糖化醪製備過程中提供酶活性，任選地通過添加外源酶來補充。第五，麥芽廢糟提供過濾介質以在糖化醪製備之後分離麥芽汁-通常通過濾清(Iautering)或糖化醪過濾(mashfiltration)來分離。
[0116]如本文所用，術語「輔料」是指不是大麥麥芽的任何含有澱粉和/或糖的植物材料。作為輔料的例子，可以提及可用作澱粉來源的材料，例如普通玉米糝、精製玉米糝、制啤酒用研磨酵母、稻米、高粱、精製玉米澱粉、大麥、大麥澱粉、去殼大麥、小麥、小麥澱粉、烘培穀類、穀類片、黑麥、燕麥、馬鈴薯、木薯和糖漿例如玉米糖漿、甘蔗糖漿、轉化糖漿、大麥和/或小麥糖漿等等。澱粉將最終被轉化為糊精和可發酵糖。在一個方面，「輔料」包括從木薯[Manihot esculenta]根獲得的含有澱粉和/或糖的植物材料。
[0117]如本文所用，術語「糖化醪」是指任何含有澱粉和/或糖的植物材料如谷粉(例如包括壓碎的大麥麥芽、壓碎的大麥)和/或其他輔料或它們的組合的含水漿料，隨後與水混合以分離成麥芽汁和廢糟。
[0118]如本文所用，術語「麥芽汁」是指在糖化醪製備過程中對谷粉進行提取後未發酵的液體流出物(run-off)。[0119]如本文所用，術語「廢糟」是指當對谷粉進行了提取且將麥芽汁從糖化醪中分離時剩餘的浙幹的固體。「廢糟」可用作例如飼料。
[0120]如本文所用，術語麥芽汁中的「提取回收率」是指從谷粉(麥芽和/或輔料)提取的可溶性物質的總和，以基於乾物質的百分數表示。
[0121]如本文所用，術語「啤酒花」涉及其在對啤酒質量(包括風味)作出顯著貢獻中的用途。具體地講，啤酒花(或啤酒花組成物)給啤酒中加入想要的苦味化物質。此外，啤酒花可充當蛋白質沉澱劑，建立防腐劑並且有助於泡沫形成和穩定化。
[0122]如本文所用，術語「飲料」和「飲料產品」包括啤酒，例如全麥芽啤酒、以「《德國啤酒純淨法》」 ("Reinheitsgebot")釀造的啤酒、愛爾啤酒、印度淡啤酒、貯藏啤酒、苦啤酒、發泡酒(第二啤酒)、第三啤酒、幹啤酒、薄啤酒、淡啤酒、低醇啤酒、低卡路裡啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麥芽酒、無醇啤酒、無醇麥芽酒等。術語「飲料」或「飲料產品」還包括替代形式的谷來和麥芽飲料，例如水果味麥芽飲料，例如柑橘味(諸如檸檬、甜橙、酸橙或漿果味)麥芽飲料，酒味麥芽飲料(例如伏特加、朗姆酒或龍舌蘭味麥芽酒)，或咖啡味麥芽飲料(例如咖啡因味麥芽酒)等。在又一個方面，飲料或飲料產品為醇飲料或無醇飲料，例如像啤酒或威士忌的基於穀類或麥芽的飲料，諸如葡萄酒、蘋果酒、醋、米酒、醬油或果汁。
[0123]如本文所用，術語「麥芽飲料」包括諸如全麥啤酒、愛爾啤酒、印度淡啤酒、貯藏啤酒、苦啤酒、發泡酒(第二啤酒)、第三啤酒、幹啤酒、淡啤酒、輕啤酒、低醇啤酒、低卡路裡啤酒、波特啤酒、博克啤酒、烈性啤酒、麥芽酒、無醇麥芽酒等的麥芽飲料。術語「麥芽飲料」還包括替代形式的麥芽飲料，例如水果味麥芽飲料，例如柑橘味(諸如檸檬、甜橙、酸橙或漿果味)麥芽飲料，酒味麥芽飲料(例如伏特加、朗姆酒或龍舌蘭味麥芽酒)，或咖啡味麥芽飲料(例如咖啡因味麥芽酒)等。
[0124]在本發明的語境中，術語「啤酒」意在包括任何通過含澱粉植物材料的發酵/釀造生產的發酵麥芽汁，因此具體地講還包括專門從麥芽或輔料生產或者從麥芽和輔料的任何組合生產的啤酒。
[0125]啤酒可通過基本上相同的方法由各種含有澱粉和/或糖的植物材料(通常為穀物穀粒和/或麥芽)製成。穀粒澱粉被認為是葡萄糖均聚物，其中葡萄糖殘基通過α-1，4鍵或α -1,6鍵連接，以前者為主。
[0126]如本文所用，術語「比爾森啤酒」是指淺色底部發酵貯藏啤酒(由比爾森麥芽製成)，其通常比普通(例如淡啤酒(helles))淺色貯藏啤酒具有更明顯的啤酒花特徵。
[0127]如本文所用，術語「輕啤酒、卡路裡減少的啤酒或低卡路裡啤酒」是指最近廣泛普及的釀造飲料，特別是在美國市場中。如在美國所定義的，這些高發酵度的啤酒與製造商的「普通」啤酒相比，卡路裡少大約30%。
[0128]如本文所用，術語「無醇啤酒」或「低醇啤酒」是指以體積計含有最多0.1%,0.2%,0.3%、0.4%、0.5%醇的啤酒。無醇啤酒可通過特殊方法(停止發酵)用特殊的非產醇的「酵母」來釀造，或通過傳統方法來釀造，但是在釀造過程的終了階段期間，醇(例如)通過真空蒸發、通過利用水和醇的不同沸點而被除去。
[0129]如本文所用，術語「低卡路裡啤酒」或「具有低碳水化合物含量的啤酒」被定義為碳水化合物含量為0.75g/100g或更低且發酵度為約90% -92%的啤酒。
[0130] 如本文所用，術語「巴氏滅菌」意指通過加熱來殺滅水溶液中的微生物。在釀造工藝中實施巴氏滅菌通常是通過使用巴氏瞬時滅菌器或隧道式巴氏滅菌器。如本文所用，術語「巴氏滅菌單位或PU」是指對巴氏滅菌的定量度量。對於啤酒而言，一個巴氏滅菌單位(IPU)被定義為在60攝氏度下保熱一分鐘。可計算如下:
[0131]PU = tXl.393~(T-60)，其中:
[0132]t =在巴氏滅菌器中在巴氏滅菌溫度下的時間(分鐘)，
[0133]T=巴氏滅菌器中的溫度(攝氏度)，
[0134][ ~ (T-60)表示指數(T-60)]
[0135]取決於啤酒類型、原材料和微生物汙染、釀造者和對啤酒風味的感知效果，可使用不同的最小W。通常，對於啤酒巴氏滅菌，需要14-15PU。取決於巴氏滅菌的設備，巴氏滅菌溫度通常在64-72攝氏度的範圍內，相應地計算巴氏滅菌時間。其他信息可在如下文獻中找至丨J ,Technology Brewing and Malting」 by Wolfgang Kunze of the Research andTeaching Institute of Brewing, Berlin(VLB), 3rd completely updated edition,2004,ISBN3-921690-49-8(柏林釀造研究學院的Wolfgang Kunze所著的《釀造和制麥技術》，第三完全更新版，2004 年，ISBN 3-921690-49-8)。
[0136]在提供數值範圍的情況中，應理解，該範圍的上限和下限之間的每個中間數值(至下限的個位的十分之一，除非上下文另有清楚規定)也被具體公開。規定範圍中的任何規定值或中間值與該規定範圍中的任何其他規定值或中間值之間的每個較小範圍被涵蓋在本公開中。這些較小 範圍的上限和下限可獨立地被包括或排除在該範圍中，而且其中界限中任一者、界限均不或界限二者被包括在較小範圍中的每個範圍也被涵蓋在本公開文本中，但依據該規定範圍中的任何被具體排除的界限而定。在規定的範圍包括界限中的一個或兩個的情況中，排除這些被包括的界限中的任一個或兩個的範圍，也被包括在本公開文本中。
[0137]在更詳細地描述示例性的實施例之前，應理解本公開並不限於所描述的具體實施例，因為這些實施例當然是可變的。儘管與本文所述的那些類似或等價的任何方法和材料可用於本發明的實施或測試，但現在將描述示例性的方法和材料。
[0138]如本文和所附權利要求書中所用，單數形式「一個」、「一種」和「所述」包括多個指代物，除非文中另外明確指出。因此，例如，提到「基因」則包括多個這種候選物質，而提到「細胞」則包括提到一個或多個細胞以及本領域技術人員知道的它們的等同物，以此類推。
[0139]本文述及的出版物只是為了它們在本申請的提交日之前的公開內容而提供。本文中沒有任何部分應被理解為承認本公開不因為在先發明而有權先於此類出版物。
[0140]2.縮寫
[0141]GA葡糖澱粉酶
[0142]GAU葡糖澱粉酶單位
[0143]Wt %重量 ％
[0144]V攝氏度
[0145]rpm每分鐘轉數
[0146]aa或AA胺基酸
[0147]bp鹼基對
[0148]kb千鹼基對[0149]kD千道爾頓
[0150]g 或 gm克
[0151]μ g微克
[0152]mg毫克
[0153]μ I 和 μ L微升
[0154]ml 和 mL毫升
[0155]mm毫米
[0156]μ m微米
[0157]M摩爾濃度
[0158]mM毫摩爾濃度
[0159]μ M微摩爾濃度
[0160]U單位
[0161]V伏特 [0162]MW分子量
[0163]sec 或 s秒
[0164]min 或 m分鐘
[0165]hr或h小時
[0166]DO溶解氧
[0167]ABS吸光度
[0168]EtOH乙醇
[0169]PSS生理鹽水溶液
[0170]m/v質量/體積
[0171]MTP微量滴定板
[0172]N正常
[0173]DPl單糖
[0174]DP2多糖
[0175]DP > 3寡糖，聚合度大於3的糖
[0176]ppm份每一百萬份
[0177]SBD澱粉結合結構域
[0178]CD催化結構域
[0179]PCR聚合酶鏈反應
[0180]WT野生型
[0181]RDF實際發酵度
[0182]SG比重
[0183]PU巴氏滅菌單位
[0184]MkGA I高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I
[0185]MkGAII高粱紅麴黴葡糖澱粉酶II
[0186]H.jecorina紅褐肉座菌
[0187]T.reesei裡氏木黴[0188]AnGA黑麴黴
[0189]3.高粱紅麴黴來源的葡糖澱粉酶
[0190]在一個實施例中，本發明涉及具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽選自:
[0191]a)包含胺基酸序列的多肽；所述胺基酸序列與選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽的胺基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性；
[0192]b)由以下編碼的多肽:i)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii) SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低嚴格性條件下與i)、?)、或iii)的互補鏈雜交的多核苷酸；
[0193]c)包含胺基酸序列中的一種或多種胺基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述胺基酸序列選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽；
[0194]d)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ ID NO:3或6的成熟多肽編碼序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一性；和
[0195]e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖澱粉酶活性的片段。
[0196]在一 個方面，本文所設想的多肽通過宿主細胞中的重組表達而獲得。在又一個方面，本文所設想的多肽不具有澱粉結合域。
[0197]另一個方面涉及來自高粱紅麴黴的葡糖澱粉酶的表徵。葡糖澱粉酶由多至三個不同結構域組成，包括結構上保守的大約450個殘基的催化域，其通常接有由30至80個殘基組成的連接區，該連接區繼而連接至大約100個殘基的澱粉結合域。已經發現高粱紅麴黴產生兩種形式的葡糖澱粉酶，本文中表示為葡糖澱粉酶I和II(Iizuka et al., (1977),J.Gen.Appl.Microbiol.，23 (5):217-230 (Iizuka 等人，1977 年，《普通與應用微生物學雜誌》，第 23 卷，第 5 期，第 217-230 頁)；Iizuka et al.，(1978)，].Gen.Appl.Microbiol.，24:185-192 (Iizuka等人，1978年，《普通與應用微生物學雜誌》，第24卷，第185-192頁))。如本文所表徵，葡糖澱粉酶I(MkGA I)具有以SEQ ID NO:6隨附的胺基酸序列、編碼葡糖澱粉酶I的相關基因組DNA序列(包括所鑑定的信號肽序列)(以SEQ ID NO:4隨附)、和編碼葡糖澱粉酶I的相關cDNA序列(以SEQ ID NO:5隨附)。此外，葡糖澱粉酶II (MkGA II)在本文表徵為具有以SEQ ID NO:3隨附的胺基酸序列、編碼葡糖澱粉酶II的相關基因組DNA序列(包括所鑑定的信號肽序列)(以SEQ ID NO:1隨附)、和編碼葡糖澱粉酶II的相關cDNA序列(以SEQ ID NO:2隨附)。這些葡糖澱粉酶cDNA片段的序列分析結果表明，存在葡糖澱粉酶的兩種不同變體。在本文稱為葡糖澱粉酶II的第一較長變體編碼具有澱粉結合域(SBD)的葡糖澱粉酶，而在本文稱為葡糖澱粉酶I的第二較短變體編碼無SBD的葡糖澱粉酶。兩個變體之間的差別是在連接區末端處將催化核心與SBD分離的162個鹼基對的空位。與具有581個殘基(SEQ ID NO:3)的成熟MkGA II蛋白質相比，成熟MkGA I蛋白質包含480個殘基(SEQ ID NO:6) 0這兩種蛋白是高度相似的，而在無空位比對中它們在以下8個位置處不同:459、473、474、475、476、477、479和480。在這些位置處，胺基酸組成如下=MkGA I:A459、C473、A474、A475、T476、P477、A479 和 V480, MkGA I1:P459、S473、R474、P475、Y476、G477、G479和R480。在又一個方面，本發明涉及本文所述的多肽，其中胺基酸序列包含至少一個或多個選自以下組的胺基酸殘基:選自與SEQ ID NO:3或6中的第459位對應的位置處的A和P的胺基酸殘基，選自與SEQ ID NO:3或6中的第473位對應的位置處的C和S的胺基酸殘基，選自與SEQ ID NO:3或6中的第474位對應的位置處的A和R的胺基酸殘基，選自與SEQ ID NO:3或6中的第475位對應的位置處的A和P的胺基酸殘基，選自與SEQ IDNO:3或6中的第476位對應的位置處的T和Y的胺基酸殘基，選自與SEQ ID NO:3或6中的第477位對應的位置處的P和G的胺基酸殘基，選自與SEQ ID NO:6中的第479位對應的位置處的A和G的胺基酸殘基和/或選自與SEQ ID NO:3或6中的第480位對應的位置處的V和R的胺基酸殘基。
[0198]在一個方面，本文所述的多肽為這樣的多肽，其中胺基酸序列與SEQ ID NO:6的胺基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%序列同一性。在又一個方面，本文所述的多肽包含SEQID NO:3或6的胺基酸序列或其具有葡糖澱粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO:3或6的胺基酸序列或其具有葡糖澱粉酶活性的片段組成。
[0199]在一個方面，本文所述的多肽的葡糖澱粉酶活性(GAU)為至少0.05GAU/mg、0.lGAU/mg、0.2GAU/mg、0.3GAU/mg、0.4GAU/mg、0.5GAU/mg、0.6GAU/mg、0.7GAU/mg、0.8GAU/mg、0.9GAU/mg、lGAU/mg、2GAU/mg、3GAU/mg、5GAU/mg 或 10GAU/mg。
[0200]在另一個方面，本文所述的多肽的葡糖澱粉酶活性(GAU)為0.05_10GAU/mg，例如0.l-5GAU/mg，例如 0.5_4GAU/mg，例如 0.7_3GAU/mg，或例如 l_3GAU/mg。
[0201]在還又一個方面，本文所述的多肽包含SEQ ID NO:3或6的成熟多肽，或者由SEQID NO:3或6的成熟多肽組成。
[0202]在一個實施例中，基本上純化的葡糖澱粉酶I或II可從高粱紅麴黴的野生型、天然的、或換句話講未修飾的菌株產生，所述菌株可提供非GMO(轉基因生物)產生的葡糖澱粉酶。
[0203]又一個方面涉及編碼高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I或I1、或其任何變體的分離的多核苷酸，使得核苷酸取代、缺失或插入編碼替代形式的葡糖澱粉酶，其保持葡糖澱粉酶I或II或其他宿主葡糖澱粉酶的生化特徵。所述多核苷酸可通過本領域中已知的確立的技術製備。可以合成方式製備所述多核苷酸，例如通過自動化DNA合成儀。DNA序列可以是通過將片段連接在一起而製備的混合的基因組(或cDNA)和合成來源的。還可利用特異性引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)來製備多核苷酸。一般來講，此類技術可參考MinshulI J.et al.，Methods 32(4) =416-427(2004) (Minshull J.等人，《方法學》，第 32 卷，第 4 期，第 416-427頁,2004年)。還可由許多商業公司(例如德國雷根斯堡的Geneart AG公司(Geneart AG,Regensburg, Germany))來合成 DNA。
[0204]另一個實施例提供了包含核苷酸序列的分離的多核苷酸，所述核苷酸序列(i)與SEQ ID NO:1、2、4或5具有至少50%同一性，包括至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少95%，和至少99%，或者(ii)在中度嚴格性至高嚴格性的條件下，能夠與源自SEQ ID NO:1、2、4或5中所示的核苷酸序列的探針雜交，或者(iii)同與SEQ ID N0:l、2、4或5中所示的序列具有至少90%序列同一性的核苷酸序列互補。根據本發明可用的探針可包含SEQ ID NO:1、2、4或5的至少50、100、150、200、250、300個或更多個連續核苷酸。
[0205] 這些分離的多核苷酸可編碼本文所設想的葡糖澱粉酶，其包含與SEQ ID NO:3或6具有至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%、至少93%、至少95%、至少97%、至少98%、或至少99%胺基酸序列同一性的胺基酸序列。提供了表達載體，其可包含本文所述的任何多核苷酸。本發明還公開了編碼本文所提供的變體葡糖澱粉酶的DNA的片段(即部分)。這些片段可用於獲得部分長度的DNA片段，其能夠用於分離或鑑定編碼本文通篇所述的成熟葡糖澱粉酶的多核苷酸。
[0206]在還另一個實施例中，葡糖澱粉酶變體可插入到生物體中，例如具有改變的熱穩定性(例如更高的熱穩定性)和/或提高的比活性的變體。
[0207]葡糖澱粉酶分子中結構的保守性與所有葡糖澱粉酶的活性的保守性和保守作用機制相關。鑑於這種較高的同源性，本文所設想的葡糖澱粉酶的位點特異性變體可導致改變的功能，並且預期具有其他葡糖澱粉酶變體中的類似的結構性結果，因此具有功能性結果O
[0208]如本文所設想的，葡糖澱粉酶變體可具有在與高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I或II (分別為SEQ ID NO:6和3)中特別鑑定的殘基「等價」的位置處的胺基酸取代。
[0209]「結構同一性」決定胺基酸殘基是否是等價的。結構同一性是當將兩個結構(三維和胺基酸結構)進行比對時一對一的拓撲等價。如果葡糖澱粉酶的殘基(胺基酸)位置與高粱紅麴黴葡糖澱粉酶中的特定殘基或該殘基的部分同源(即在一級或三級結構中在位置上相對應)或類似(具有相同或相似的功能能力以結合、反應或在化學上相互作用)，則其「等價」於高粱紅麴黴葡糖澱粉酶的殘基。
[0210]為了確立與一級結構的同一性，可將特定葡糖澱粉酶的胺基酸序列與高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I或II序列直接進行比較，特別是與在序列已知的葡糖澱粉酶中已知不變的殘基組進行比較。在將保守 殘基進行比對、允許必要的插入和缺失以維持比對(即避免通過隨意的缺失和插入而消除保守殘基)後，與高粱紅麴黴葡糖澱粉酶一級序列中的特定胺基酸等價的殘基被限定。等價殘基可由與高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I或II的100%保守性來定義。然而，大於75%或低至50%的保守殘基的比對也可足以定義等價殘基，特別是當包括基於結構同一性的比對時。
[0211]結構同一性涉及鑑別兩個結構之間的等價殘基。對於已通過X射線晶體學確定了其三級結構的酶，可通過確定三級結構水平上的同源性(結構同一性)來定義「等價殘基」。等價殘基定義為這樣的殘基:比對後，對其而目，聞梁紅麴黴匍糖澱粉酶的特定氣基酸殘基的兩個或更多個主鏈原子(N對N、CA對CA、C對C以及O對O)的原子坐標偏差在0.13nm以及任選在0.1nm之內。比對是在已將最佳模型進行取向和定位以使所考慮的葡糖澱粉酶的非氫蛋白質原子的原子坐標與高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I或II達到最大重疊後實現。最佳模型是對於可獲得的最高解析度下的實驗衍射數據給出最低R因子的晶體模型。
[0212]

_Xh\Fo(h)\^\Fc(h)\
及因子
[0213]功能上類似於聞梁紅麴黴匍糖澱粉酶I或II的特定殘基的等價殘基被定義為酶的這樣的胺基酸，它們可採取某種構象，使得它們以確定的且歸因於高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I或II的特定殘基的方式改變、修飾或促成蛋白質結構、底物結合或催化作用。此外，它們是酶(可通過X射線晶體學獲得其三級結構)的這樣的殘基，其佔據類似的位置達到這樣的程度，即儘管給定殘基的主鏈原子可能不滿足基於佔據同源位置的等價標準，但該殘基的至少兩個側鏈原子的原子坐標與高粱紅麴黴葡糖澱粉酶I或II的相應側鏈原子偏差在0.13nm內。在一些實施例中，本文所設想的變體葡糖澱粉酶可與SEQ ID NO:3或6的高粱紅麴黴葡糖澱粉酶胺基酸序列具有至少50%序列同一性、至少60%序列同一性、至少70%序列同一1丨生、至少80%序列同一1丨生、至少85%序列同一1丨生、至少88%序列同一1丨生、至少90%序列同一『丨生、至少93%序列同一『丨生、至少95%序列同一『丨生、至少96%序列同一『丨生、至少97%序列同一性、至少98%序列同一性，以及至少99%序列同一性。
[0214]在一些實施例中，葡糖澱粉酶變體將具有不止一個胺基酸取代。例如，與高粱紅麴黴葡糖澱粉酶1或11相比，變體可具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20或25個胺基酸取代、缺失或插入。在一些實施例中，葡糖澱粉酶變體包含在與非保守胺基酸的區域對應的位置中的至少一個胺基酸位置中的取代、缺失或插入。如本文所設想的，葡糖澱粉酶變體可具有在成熟蛋白質序列中的任何位置中的取代、缺失或插入。
[0215]如本文所設想的，可使用表達載體以酶的形式表達編碼葡糖澱粉酶或葡糖澱粉酶變體的DNA序列，該表達載體通常包含編碼啟動子、操縱子、核糖體結合位點、翻譯起始信號以及任選的阻遏基因或各種激活基因的控制序列。攜帶編碼本文所設想的葡糖澱粉酶的DNA序列的重組表達載體可為任何可方便地進行重組DNA程序的載體。該載體可以是這樣的載體，其當被引入到高粱紅麴黴中時，整合到基因組中並且與其被整合到的染色體一起被複製。例如，可用編碼葡糖澱粉酶的DNA構建體轉化真菌細胞，並且將該DNA構建體以一個或多個拷貝整合到宿主染色體中。這種整合一般被認為是一個優勢，因為DNA序列更有可能被穩定地保持。可根據常規方法來進行DNA構建體向宿主染色體中的整合，例如通過同源或異源重組來進行。
[0216]在併入了使用載 體的實施例中，DNA序列應有效連接到合適的啟動子序列。啟動子可為任何在高粱紅麴黴中顯示轉錄活性的DNA序列，並且可源自編碼與高粱紅麴黴同源或異源的蛋白質的基因。指導編碼葡糖澱粉酶變體的DNA序列的轉錄的合適啟動子的例子為(僅以非限制性例子的方式)源自編碼米麴黴(A.0ryZae)TAKA澱粉酶、裡氏木黴(T.reesei)纖維二糖水解酶1、米黑根毛黴(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶、黑麴黴(A.niger)中性α _澱粉酶、黑麴黴酸穩定性α澱粉酶、黑麴黴葡糖澱粉酶、米黑根毛黴脂肪酶、米麴黴鹼性蛋白酶、或構巢麴黴(A.nidulans)甘油醛_3_磷酸脫氫酶A的基因的那些啟動子。所設想的任何表達載體還可包含合適的轉錄終止子和多腺苷酸化序列，該多腺苷酸化序列有效連接到編碼葡糖澱粉酶或變體的DNA序列。終止序列和多腺苷酸化序列可適當地源自與啟動子相同的來源。載體還可包含任何促成或實現載體在真菌宿主中複製的DNA序列。載體還可包含另外的基因，其產物可彌補真菌宿主中的缺陷。例如，可併入選擇性標記以提供藥物抗性。如本文所設想的，分別用於連接編碼葡糖澱粉酶的DNA構建體、啟動子、終止子和其他元件，並且將它們插入到含有複製必需的信息的合適載體中的所有程序，是本領域的技術人員可理解的。
[0217]在一個方面，本發明涉及具有本文所述的多肽的異源表達的宿主細胞，例如木黴屬(Trichoderma)(例如裡氏木黴)的真菌細胞。在另一個方面，真菌細胞為紅褐肉座菌物種。[0218]在一個方面，宿主細胞包含質粒或表達載體，或者優選地用質粒或表達載體轉化，因此能夠表達本文所設想的多肽。在一個方面，表達載體包含核酸，並且本文所設想的表達載體或質粒可包含源自木黴屬的啟動子(例如裡氏木黴cbhl來源啟動子)，和/或源自木黴屬的終止子(例如裡氏木黴cbhl來源終止子)，和/或一個或多個選擇性標記(例如構巢麴黴(Aspergillus nidulans) amdS和pyrG),和/或一個或多個端粒區,其允許在宿主細胞中維持非染色體質粒。
[0219]在一個方面，本發明涉及分離本文所述的多肽的方法，該方法包括以下步驟:在具有所述多肽的異源表達的宿主細胞中誘導所述多肽的合成；回收由所述宿主細胞分泌的細胞外蛋白質；以及任選地純化所述多肽。在另一個實施例中，葡糖澱粉酶可由經遺傳修飾的高粱紅麴黴產生。例如，高粱紅麴黴可被遺傳修飾以便產生富集或過表達的葡糖澱粉酶。提取方法可包括以下所提供的實驗性例子中所描述的那些方法，或者通過本領域的技術人員所理解的從培養物提取葡糖澱粉酶的任何其他方式進行的那些方法。在一個實施例中，葡糖澱粉酶可由經遺傳修飾的高粱紅麴黴菌株過量產生，該菌株具有葡糖澱粉酶基因的多個拷貝。在另一個實施例中，真菌菌株可被遺傳修飾以使其他分泌的酶失活。在又一個實施例中，葡糖澱粉酶基因的一個或多個拷貝可有效連接到不同的啟動子，例如來自另一個基因的高效啟動子區域。在還另一個實施例中，真菌菌株可為蛋白酶缺陷菌株或蛋白酶缺失菌株。
[0220]又一個方面涉及適用於大規模蛋白質純化程序的用於分離葡糖澱粉酶I和II的改進和成本效益好的方法。在一個實施例中，該方法包括以下步驟:使高粱紅麴黴的培養物生長，以及誘導葡糖澱粉酶的合成。編碼葡糖澱粉酶的DNA序列可為天然的或未修飾的序列，或者其可為修飾的序列。根據本領域的技術人員所理解的標準方法和程序，高粱紅麴黴可通過涉及原生質體形成和原生質體轉化然後是細胞壁的再生的方法來轉化。也可使用任何轉化高粱紅麴黴的標準方法。用於培養高粱紅麴黴的培養基可為任何常規的適於使真菌宿主生長並且誘導葡糖 澱粉酶或其變體的表達的培養基。合適的培養基可從商業供應商獲得或可根據公布的配方製備。從高粱紅麴黴分泌的葡糖澱粉酶或其變體可便利地通過標準程序從培養基回收，所述標準程序包括通過離心或過濾從培養基分離細胞，以及藉助於鹽(例如硫酸銨)沉澱出培養基的蛋白質組分，然後使用色譜程序，例如離子交換色譜法、親和色譜法等。因為葡糖澱粉酶是由高粱紅麴黴分泌的僅有的優勢酶，所以除去不需要的酶(例如α-澱粉酶)的任何額外分離步驟均得以減至最少或是不必要的。通過使得不必從其他不需要的蛋白質組分分離葡糖澱粉酶，建立了顯著高效並且節約成本的程序。此外，高粱紅麴黴宿主提供至少與其他葡糖澱粉酶宿主細胞類似的葡糖澱粉酶產率，而在另一個實施例中，與史載葡糖澱粉酶宿主細胞相比，將高粱紅麴黴用作宿主提供了葡糖澱粉酶或其變體的更大產率。
[0221]在一個方面，本發明涉及分離本文所述的多肽的方法，該方法包括以下步驟:在具有所述多肽的異源表達的宿主細胞中誘導所述多肽的合成；回收由所述宿主細胞分泌的細胞外蛋白質；以及任選地純化所述多肽。
[0222]通過本領域的技術人員所理解的標準方法來測定本文所設想的任何葡糖澱粉酶的活性和/或比活性。
[0223]4.鉬合物和用塗[0224]例如，本文所設想的葡糖澱粉酶可用於組合物中，該組合物包括但不限於澱粉水解和糖化組合物、清潔和洗滌劑組合物(例如衣物洗滌劑、盤碟洗滌劑和硬質表面清潔組合物)、乙醇發酵組合物，和動物飼料組合物。此外，這些葡糖澱粉酶可用於烘焙應用(例如麵包和蛋糕生產)、釀造、醫療保健、紡織物、環境廢物轉化過程、生物製漿加工，和生物質轉化應用。
[0225]在一些實施例中，包含本文所設想的葡糖澱粉酶的組合物將任選地與下述酶中的任一種組合使用或者與下述酶以任何組合使用:α -澱粉酶、β -澱粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、內肽酶、外肽酶)、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、半纖維素酶、內切葡聚糖酶和相關的β -葡聚糖水解輔助酶、木聚糖酶和木聚糖酶輔助酶、乙醯乳酸脫羧酶、環糊精糖基轉移酶、脂肪酶、植酸酶、漆酶、氧化酶、酯酶、角質酶、顆粒澱粉水解酶，以及其他葡糖澱粉酶。
[0226]在一些實施例中，組合物將包含所述一種或多種其他酶。在一些實施例中，組合物將包含所述一種或多種其他酶，所述酶選自α-澱粉酶、β-澱粉酶、肽酶(例如蛋白酶、朊酶、內肽酶、外肽酶)、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶和相關的β -葡聚糖水解輔助酶、木聚糖酶和木聚糖酶輔助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶)、乙醯乳酸脫羧酶和葡糖澱粉酶，包括它們的任何一種或多種組合。
[0227]在另一個實施例中，本文所設想的一種或多種多肽和/或一種或多種其他酶通過巴氏滅菌來滅活，例如通過在啤酒(例如比爾森啤酒)中使用小於50、45、40、35、30、25、24、
23、22、21或20個巴氏滅菌單位(PU)來滅活。
[0228]在一些實施例中，組合物將包含α-澱粉酶，如真菌α-澱粉酶(例如麴黴屬物種(Aspergillus sp.))或細菌α-澱粉酶(例如芽孢桿菌屬物種(Bacillus sp.),如嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophiIus)(嗜熱脂肪地芽孢桿菌(GeobacillusstearothermophiIus))、解澱粉芽抱桿菌(B.amy1Iiquefaciens)和地衣芽抱桿菌(B.1icheniformis)),及其變體和雜合體。在一些實施例中，α _澱粉酶是酸穩定性α _澱粉酶。在一些實施例中，α-澱粉酶是白麴黴(Aspergillus kawachi) α -澱粉酶(AkAA),參見美國專利N0.7，037，704。考慮用於本發明的組合物中的市售澱粉酶是已知的，包括 GZYMElf G-997、SPEZYME' FRED、SPEZYMXTRA(丹尼斯克美國公司傑能科分公司(Danisco US, Inc, Genencor Division))、TERMAMYL 120-L 和 SUPRA(諾維信生物技術公司(Novozymes, Biotech.))。
[0229]在一些實施例中，組合物將包含酸性真菌蛋白酶。在又一個實施例中，組合物將包含源自微生物黑麴黴的變體的內切蛋白酶(EC 3.4.21.26)，其在2007年9月13日公布的TO 2007/101888中所公開的脯氨酸殘基的羧基位點處水解肽。在又一個實施例中，酸性真菌蛋白酶源自木黴屬物種(Trichoderma sp)並且可為2006年7月13日公布的US2006/0154353中所公開的蛋白酶中的任一者，所述專利以引用的方式併入本文。在又一個實施例中，組合物將包含來自布丘氏菌屬物種(Buttiauxiella spp.)的植酸酶(例如BP-17，還可參見PCT專利公布WO 2006/043178中所公開的變體)。在又一個實施例中，組合物將包含例如來自地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)或來自在1986年10月14日公布的US 4，617，273中所公開的枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的修飾菌株中表達的短芽孢桿菌(Bacillus brevis) ALDC基因的乙醯乳酸脫羧酶(ALDC)EC 4.1.1.5。
[0230]在其他實施例中，可將本文所設想的葡糖澱粉酶與其他此類葡糖澱粉酶組合。在一些實施例中，此類葡糖澱粉酶將與如下葡糖澱粉酶組合:源自高粱紅麴黴的其他各種菌株或變體或者麴黴屬(Aspergillus)或其變體，例如米麴黴、黑麴黴、白麴黴、和泡盛麴黴(A.awamori)的一種或多種葡糖澱粉酶；源自腐質黴屬(Humicola)的菌株或其變體的葡糖澱粉酶；源自籃狀菌屬(Talaromyces)的菌株或其變體(例如埃默森籃狀菌(T.emersonii))的葡糖澱粉酶；源自阿太菌屬(Athelia)的菌株(例如羅氏阿太菌(A.rolfsii))的葡糖澱粉酶；或源自青黴屬(Penicillium)的菌株(例如產黃青黴(P.chrysogenum))的葡糖澱粉酶。
[0231]具體地講，本文所設想的葡糖澱粉酶可用於澱粉轉化工藝，特別是可用於果糖糖漿、特種糖的葡萄糖的生產中，以及用於由含澱粉底物發酵而產生醇和其他終產物(例如有機酸、抗壞血酸和胺基酸)(G.M.A.van Beynum et al.，Eds.(1985) STARCH CONVERSIONTECHNOLOGY, Marcel Dekker Inc.NY(G.M.A.Van Beynum 等人編輯，1985 年，《澱粉轉化技術》，紐約馬塞爾.德克爾公司)。用本公開的變體葡糖澱粉酶組合物生產的糊精可導致至少80%、至少85%、至少90%和至少95%的葡萄糖產率。用本文所設想的葡糖澱粉酶由澱粉底物發酵產生醇可包括產生燃料醇或可飲用的醇。在一些實施例中，當在與野生型葡糖澱粉酶相同的條件下使用變體葡糖澱粉酶時，醇的產生將較多。在一些實施例中，與野生型葡糖澱粉酶相比，醇的產生將多出約0.5%和2.5%之間，包括但不限於多出0.6%、0.7%、0.8 %,0.9 %,1.0 %U.1 %>1.2 %U.3 %U.4 %U.5 %U.6 %U.7 %U.8 %,1.9
2.0%,2.1%,2.2%,2.3%和 2.4%的醇。
[0232]在一些實施例中，本文所設想的葡糖澱粉酶將可用於水解來自各種基於植物的底物的澱粉，所述底物通常為用於醇產生的含有澱粉和/或糖的植物材料。在一些實施例中，所述基於植物的底物將包括玉米、小麥、大麥、黑麥、蜀黍、稻米、甘蔗、馬鈴薯、木薯以及它們的組合。在一些實施例中，所述基於植物的底物將為分級的植物材料，例如被分級為諸如纖維、胚、蛋白質和澱粉( 胚乳)之類的組分的穀物穀粒(如玉米)(美國專利N0.6，254，914和美國專利 N0.6，899，910)。醇發酵的方法描述於 THE ALCOHOL TEXTBOOK, A REFERENCEFOR THE BEVERAGE, FUEL AND INDUSTRIAL ALCOHOL INDUSTRIES, 3rd Ed.，Eds K.A.Jacqueset al., 1999, Nottingham University Press, UK (《醇教科書:飲料、燃料和工業酒精行業參考》，第3版，K.A.Jacques等人編輯，1999年，英國諾丁漢大學出版社)中。在某些實施例中，所述醇將為乙醇。特別地，醇發酵生產工藝表徵為溼磨或幹磨工藝。在一些實施例中，葡糖澱粉酶將用於溼磨發酵工藝中，而在其他實施例中，葡糖澱粉酶將可用於幹磨工藝中。
[0233]幹穀粒研磨涉及多個基本步驟，其通常包括:碾磨、蒸煮、液化、糖化、發酵、和將液體與固體分離以產生醇和其他副產物。對植物材料，特別是全穀物穀粒(例如玉米、小麥或黑麥)進行碾磨。在一些情況下，可將穀粒首先分級為組成部分。可研磨經碾磨的植物材料以獲得粗顆粒或細顆粒。可將經碾磨的植物材料與液體(例如水和/或酒糟水)在漿料槽中混合。使漿料在噴射式蒸煮鍋中與液化酶(例如α-澱粉酶)一起經受高溫(例如90°C至105°C或更高)以將穀粒中的澱粉溶解並水解為糊精。可使混合物冷卻並用糖化酶(例如本發明所涵蓋的葡糖澱粉酶)進一步處理，以產生葡萄糖。然後，可在發酵微生物(如產乙醇微生物，特別是酵母(酵母菌屬物種(Saccharomyces spp)))的存在下,使含有葡萄糖的糖化醪發酵大約24至120小時。將糖化醪中的固體與液相分離，獲得醇(如乙醇)和有用的副產物(如酒糟)。[0234]在一些實施例中，將糖化步驟與發酵步驟相組合，該工藝稱為同時糖化和發酵或同時糖化、酵母增殖和發酵。
[0235]在其他實施例中，這些葡糖澱粉酶可用於澱粉水解工藝中，其中該工藝的溫度為30°C和75°C之間，在一些實施例中，為40°C和65°C之間。在一些實施例中，葡糖澱粉酶可在PH 3.0和pH 6.5之間的pH下用於澱粉水解工藝中。一些實施例中的發酵工藝包括研磨穀物穀粒或經分級的穀粒，以及將經碾磨的穀物穀粒與液體結合以形成漿料，然後可在單個容器中將該漿料與根據本發明的葡糖澱粉酶和任選其他的酶以及酵母混合以產生乙醇和其他副產物(參見例如美國專利N0.4，514，496、WO 04/081193和TO04/080923)，所述其他的酶為例如但不限於α-澱粉酶、其他葡糖澱粉酶、植酸酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶或具有顆粒澱粉水解活性的其他酶。
[0236]在一些實施例中，本發明涉及糖化液體澱粉溶液的方法，該方法包括使用本文所設想的一種或多種葡糖澱粉酶的酶促糖化步驟。
[0237]在一些實施例中，本發明涉及水解和糖化待用於釀造的經糊化和液化(通常是液化)的谷粉澱粉的方法，由此將包含一種或多種本文所設想的葡糖澱粉酶的組合物用於增加從澱粉獲得的釀造啤酒用酵母可發酵糖的量。將釀造工藝用於生產可飲用的產品啤酒，其中通過用釀造啤酒用酵母發酵而使可發酵糖轉化為乙醇和C02。傳統上可發酵糖源自穀物穀粒中的澱粉，該澱粉任選補充有諸如葡萄糖和麥芽糖糖漿以及蔗糖之類的可發酵糖源。簡而言之，本領域所熟知的啤酒生產通常包括下列步驟:制麥芽、糖化醪製備和發酵。
[0238]歷史上，啤酒生產的第一步是制麥芽-穀物穀粒(例如大麥)的浸潰、萌發和乾燥。在制麥芽過程中，萌發的穀物(例如大麥)仁中產生酶並且其化學組成中有某些改變(稱為修飾)，包括澱粉、蛋白質和β -葡聚糖有一定程度的降解。
[0239]研磨發芽的穀物以提供谷粉，可將谷粉與經研磨的輔料(例如非萌發的穀物穀粒)混合以提供混合的谷粉。谷粉還可主要由或單獨由輔料組成。將該谷粉與水混合併使其經歷糖化醪製備；可將之前蒸煮的(糊化和液化)輔料(「輔料蒸煮」的所得物)添加到糖化醪。在各種溫度下在一段時間中進行糖化醪製備工藝，以水解穀物蛋白質、降解β_葡聚糖並溶解和水解澱粉。在傳統的糖化醪製備中，麥芽和輔料中的谷粉澱粉的水解被認為是由發芽大麥內源性的兩種主要的酶催化的。α-澱粉酶隨機裂解澱粉分子內部的α-1，4鍵而將其片段化為更小的糊精。澱粉酶從這些糊精的非還原末端順次裂解α-1，4鍵，從而主要產生麥芽糖。α-和β-澱粉酶二者都不能水解α_1，6鍵(其形成澱粉分子中澱粉鏈的分支點)，這導致極限糊精在糖化醪中積聚。麥芽確實含有酶，即極限糊精酶，其催化α-1，6鍵的水解，但由於其不耐熱性，其在糖化醪製備溫度下僅顯示出弱的活性。在糖化醪製備後，將液體提取物(麥芽汁)與廢糟固形物(即構成谷粉的一部分的不可溶穀粒和殼材料)分離。麥芽汁分離的目的包括:?獲得良好的提取物回收率，?獲得良好的濾過率，以及.產生澄清的麥芽汁。麥芽汁的提取回收率和過濾性在釀造工藝的經濟性方面是重要的。
[0240] 麥芽汁的組成取決於原材料、糖化醪製備工藝和特徵以及其它變量。典型的麥芽汁包含65-80%的可發酵糖(葡萄糖、麥芽糖和麥芽三糖)，以及20-35%的非可發酵極限糊精(具有比麥芽三糖更高的聚合度的糖)。當以高水平的輔助的未出芽穀物谷粉釀造時，可引起糖化醪製備工藝中澱粉水解酶的不足。因此需要外源性酶來源，所述外源性酶能夠在糖化醪製備的過程中產生可發酵的糖。此外，也需要此類外源性酶以降低麥芽汁中非可發酵糖的水平，伴有可發酵糖的相應增加，以釀造具有低碳水化合物含量的高發酵度啤酒。本文中公開的是用於澱粉水解的酶組合物，其包含至少一種本文中所設想的葡糖澱粉酶，可將其加入糖化醪中或用於釀造工藝的糖化醪製備步驟中，以便裂解澱粉谷粉中的α -1,4鍵和/或α -1，6鍵並從而增加麥芽汁中的可發酵糖含量和減少成品啤酒中的非可發酵糖殘餘物。此外，可乾燥(通過例如噴霧乾燥)或濃縮(例如煮沸和蒸發)如此製備的麥芽汁以提供糖漿或粉末。
[0241]本文所設想的谷粉可包含任何含有澱粉和/或糖的植物材料，所述植物材料可源自任何植物和植物部分，包括例如之前所述的塊莖、根、莖、葉和種子。優選地，谷粉包含穀粒，例如來自大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、稻米、蜀黍、粟和高粱的穀粒，並且更優選至少10%，或更優選至少15%，甚至更優選至少25%，或最優選至少35%，例如至少50%、至少75 %、至少90%或甚至100% (重量/重量)的麥芽汁的谷粉源自穀粒。最優選地，所述谷粉包含發芽的穀粒，如大麥麥芽。優選地，至少10%，或更優選至少15%，甚至更優選至少25%，或最優選至少35% (如至少50%、至少75%、至少90%或甚至100% (重量/重量))的麥芽汁的谷粉源自發芽的穀粒。優選地，所述谷粉包含輔料，如來自大麥、小麥、黑麥、燕麥、玉米、稻、蜀黍、粟和高粱的未發芽穀粒，更優選地，至少10%，或更優選至少15%，甚至更優選至少25%，或最優選至少35%，如至少50%、至少75%、至少90%或甚至100% (重量/重量)的所述麥芽汁的谷粉源自未發芽穀粒或其它輔料。可在本發明的糖化醪製備工藝之前、期間或之後將包含可容易發酵的碳水化合物(如糖或糖漿)的輔料加入麥芽糖化醪，但優選在糖化醪製備工藝之後加入。在加入到糖化醪中之前，可用α-澱粉酶，和/或內切肽酶(蛋白酶)和/或內切葡聚糖 酶處理輔料的一部分，和/或對其進行熱處理。如本文所設想的用於水解澱粉的酶組合物可包含另外的酶，優選選自如下的酶:α -澱粉酶、β -澱粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、內肽酶、外肽酶)、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶和相關的β -葡聚糖水解輔助酶、木聚糖酶和木聚糖酶輔助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶)、乙醯乳酸脫羧酶和葡糖澱粉酶，包括它們的任何一種或多種組合。在糖化醪製備的過程中，將從谷粉中提取的澱粉逐漸水解為可發酵糖和更小的糊精。優選地，在麥芽汁分離之前，糖化醪對於碘測試是澱粉陰性的。
[0242]糖化醪製備之後，麥芽汁(液體提取物麥芽汁)通過濾清或糖化醪過濾的過程從廢糟固形物分離。麥芽汁分離的目的包括:良好的提取物回收率；良好的濾過率，以及澄清的麥芽汁(更多信息可見於 「Technology Brewing and Malting」 by Wolfgang Kunze ofthe Research and Teaching Institute of Brewing, Berlin (VLB), 3rd completely updatededition, 2004，ISBN3-921690-49-8 (柏林釀造研究學院的Wolfgang Kunze所著的《釀造和制麥技術》，第三完全更新版，2004年，ISBN 3-921690-49-8))。
[0243]在釀造工藝的第三步(發酵)之前，通常將麥芽汁轉移到釀造罐中並劇烈煮沸50-60分鐘。在麥芽汁沸騰期間中發生多個重要的過程(更多信息可見於「TechnologyBrewing and Malting」by Wolfgang Kunze of the Research and Teaching Institute ofBrewing, Berlin (VLB)，3rd completely updated edition, 2004, ISBN 3-921690-49-8 (柏林釀造研究學院的Wolfgang Kunze所著的《釀造和制麥技術》,第三完全更新版,2004年，ISBN3-921690-49-8))，包括內源性麥芽酶和加入到糖化醪或輔料中的任何外源性酶的失活。然後冷卻煮沸的麥芽汁，用釀造啤酒用酵母接種，並且在8-16°C範圍內的溫度下發酵以將可發酵糖轉化為乙醇。可通過用於選擇性除去醇的真空蒸發工藝從最終的啤酒產生低醇啤酒。此外，可將啤酒花添加到麥芽汁中。
[0244]在一個方面，本發明涉及本文所設想的多肽或組合物在發酵中的用途，其中在發酵步驟之前或期間添加所述多肽或組合物。在又一個方面，所述發酵步驟之後是巴氏滅菌步驟。在一個方面，所述發酵飲料選自啤酒，例如低醇啤酒或低卡路裡啤酒。在另一個方面，所述多肽或所述組合物與一種或多種另外的酶組合在一起添加，所述酶選自α -澱粉酶、蛋白酶、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶、木聚糖酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶和葡糖澱粉酶，包括它們的任何一種或多種組合。在還又一個方面，所述多肽和/或所述一種或多種另外的酶在巴氏滅菌步驟中失活。
[0245]在一個方面，以例如l-1000mg/kg 谷粉、如 20_500mg/kg 谷粉、如 30_400mg/kg 谷粉、如40-300mg/kg谷粉、如50-200mg/kg谷粉的量來添加本文所設想的一種或多種多肽。
[0246]在一個方面，以例如至少1、50、100、150、200、300、400、500、600、700、800、900 或1000mg/kg谷粉的量來添加本文所設想的一種或多種多肽。
[0247]在一個替代實施例中，本發明涉及一種方法，例如在其中發酵包括在用於製造發酵飲料的工藝中的方法中，該方法包括在發酵步驟之前或期間添加本文所述的多肽或組合物，例如在包括發酵步驟或任選的啤酒過濾步驟之後的巴氏滅菌步驟的方法中。
[0248]在一個方面，本發明涉及生產發酵飲料的方法，該方法包括以下步驟:
[0249]a)製備糖化醪(例如得自谷粉)，其中所述谷粉例如包含發芽和/或未發芽的穀粒或來自另一種作物的澱 粉基材料中的一種或多種，並且其中該步驟任選地還包括將所述糖化醪與一種或多種另外的酶接觸，
[0250]b)過濾糖化醪以獲得麥芽汁，以及
[0251]c)對麥芽汁進行發酵以獲得發酵飲料，
[0252]以及任選地進行巴氏滅菌步驟(d)，
[0253]其中將本文所述的多肽或組合物添加到:
[0254]1.步驟(a)的糖化醪和/或
[0255]i1.步驟(b)的麥芽汁和/或
[0256]ii1.步驟(C)的麥芽汁。
[0257]在一個方面，可任選地添加到步驟a中的一種或多種酶可選自澱粉脫支酶、R-酶、極限糊精酶、α-澱粉酶、澱粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、內肽酶、外肽酶)、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶和相關的β -葡聚糖水解輔助酶、木聚糖酶和木聚糖酶輔助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶)、乙醯乳酸脫羧酶和葡糖澱粉酶，包括它們的任何一種或多種組合。在另一個方面，還可通過將步驟(b)或(C)的麥芽汁與一種或多種另外的酶接觸來添加一種或多種酶，其中所述酶選自澱粉脫支酶、異澱粉酶和極限糊精酶，包括它們的任何一種或多種組合。
[0258]在一個替代實施例中，本發明涉及使用包含一種或多種本文所設想的葡糖澱粉酶(例如不耐熱的葡糖澱粉酶)的組合物來提高麥芽汁中可發酵糖的量的方法，由此在麥芽汁煮沸後將所述組合物加入麥芽汁中，使得一種或多種葡糖澱粉酶在發酵步驟中是有活性的。可在用釀造啤酒用酵母接種麥芽汁之前、與之同時或在之後將組合物加入到煮沸的麥芽汁中。在發酵和成熟步驟結束時，接著對啤酒(其可任選經受真空蒸發以產生低醇啤酒)進行任選地過濾和/或巴氏滅菌。該方法的內在優勢在於發酵過程的持續時間為約6-15天(取決於接種率、發酵、溫度等)，與短的糖化醪製備步驟(2-4小時的持續時間)相比，這使得有更多的時間來對非可發酵糖進行酶促裂解。該方法的另外的優點在於實現所期望的非可發酵糖減少(和可發酵糖增加)所需的組合物的量，與實現非可發酵糖的類似減少而將需要向糖化醪中加入的量相比，其對應於顯著更低數目的酶活性單位(例如葡糖澱粉酶活性單位)。此外，其消除了當在糖化醪中加入高劑量率的葡糖澱粉酶時，在麥芽汁分離(特別是通過濾清(Iautering)進行分離)過程中通常所見的困難。已經出乎意料地發現，與葡糖澱粉酶的替代來源相比，本文所設想的葡糖澱粉酶是足夠溫度敏感的，使得成品啤酒的最終熱處理步驟(標準巴氏滅菌條件)足以使其催化活性失活。因此包含本文所設想的一種或多種葡糖澱粉酶的組合物的一個重要優點在於，其可用於在釀造的發酵步驟期間減少麥芽汁中的非可發酵糖的量以便釀造具有低碳水化合物含量的高發酵度啤酒，並且其中該組合物的催化活性易通過啤酒巴氏滅菌過程中的熱處理而失活，從而避免固定化酶反應器的費用或基因工程釀造啤酒用酵母的使用。
[0259]本發明還提供生產食品、飼料或飲料產品(例如醇飲料或無醇飲料，例如像啤酒或威士忌的基於穀類或麥芽的飲料，例如葡萄酒、蘋果酒、醋、米酒、醬油或果汁)的方法，所述方法包括用本文所述的多肽或組合物來處理含有澱粉和/或糖的植物材料的步驟。在另一個方面，本發明還涉及試劑盒，其包含本文所設想的多肽或組合物；以及所述多肽或組合物的使用說明書。本發明還涉及通過本文所述的方法生產的發酵飲料。
[0260]本發明還提供包含至少一種本文所設想的葡糖澱粉酶的動物飼料組合物或配方。例如WO 03/049550(以引用的方式全文併入本文)中提供了在製備包含澱粉的飼料中使用葡糖澱粉酶的方法。簡而言之，將葡糖澱粉酶與包含澱粉的飼料混合。所述葡糖澱粉酶能夠降解抗性澱粉以便動物使用。 [0261]根據本說明書，本公開的其他目標和優勢將顯而易見。
[0262]5.根據本發明的另外的實施例:
[0263]實施例1.一種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽選自:
[0264]a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽的胺基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性；
[0265]b)由以下編碼的多肽:i)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或
ii)i)的cDNA序列、或iii) SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低嚴格性條件下與i)、?)、或iii)的互補鏈雜交的多核苷酸；
[0266]c)包含胺基酸序列中的一種或多種胺基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述胺基酸序列選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽；
[0267]d)由多核苷酸編碼的多肽,所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ ID NO:3或6的成熟多肽編碼序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一性；和
[0268]e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖澱粉酶活性的片段。
[0269]實施例2.—種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽包含的胺基酸序列與選自SEQ ID勵:3和6的成熟多肽的胺基酸序列具有至少75%、76%、77%、78%、79%、80%,81%,82%,83%,84%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性。
[0270]實施例3.—種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽由以下編碼:i)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii) SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低嚴格性條件下與i)、ii)、或iii)的互補鏈雜交的多核苷酸。
[0271]實施例4.一種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽包含選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸的保守取代、缺失和/或插入。
[0272]實施例5.—種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽由多核苷酸編碼，所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQ ID NO:3或6的成熟多肽編碼序列具有至少75%、76%,77%,78%,79%,80%,81 %,82%,83%,84%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%或100%同一性。
[0273]實施例6.—種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽為根據實施例1-5中任一項所述的多肽的片段。
[0274]實施例7.根據實施例1-6中任一項所述的多肽，其中所述胺基酸序列包含至少選自以下組的一個或多個胺基酸殘基:
[0275]a.選自與SEQ ID NO:3或6中的第459位對應的位置處的A和P的胺基酸殘基， [0276]b.選自與SEQ ID NO:3或6中的第473位對應的位置處的C和S的胺基酸殘基，
[0277]c.選自與SEQ ID NO:3或6中的第474位對應的位置處的A和R的胺基酸殘基，
[0278]d.選自與SEQ ID NO:3或6中的第475位對應的位置處的A和P的胺基酸殘基，
[0279]e.選自與SEQ ID NO:3或6中的第476位對應的位置處的T和Y的胺基酸殘基，
[0280]f.選自與SEQ ID NO:3或6中的第477位對應的位置處的P和G的胺基酸殘基，
[0281]g.選自與SEQ IDNO:3或6中的第479位對應的位置處的A和G的胺基酸殘基和/或
[0282]h.選自與SEQ ID NO:3或6中的第480位對應的位置處的V和R的胺基酸殘基。
[0283]實施例8.根據實施例1-7中任一項所述的多肽，其中所述胺基酸序列與SEQ IDNO:3 或 6 的胺基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81 %、82%、83%、84%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性。
[0284]實施例9.根據實施例1-8中任一項所述的多肽，其包含SEQ ID NO:3或6的胺基酸序列或其具有葡糖澱粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO:3或6的胺基酸序列或其具有葡糖澱粉酶活性的片段組成。
[0285]實施例10.根據實施例1-9中任一項所述的多肽，其包含SEQ ID NO:3或6的成熟多肽，或者由SEQ ID NO:3或6的成熟多肽組成。
[0286]實施例11.根據實施例1-10中任一項所述的多肽，其中一個胺基酸序列與另一個胺基酸序列的同一性百分數通過使用具有如下默認設置的蛋白質-蛋白質Blast搜索(http: //blast, ncb1.nlm.nih.gov)來測定:得分矩陣:blosum62,非冗餘蛋白質序列資料庫和blast算法
[0287]
【權利要求】
1.一種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽選自: a)包含胺基酸序列的多肽，所述胺基酸序列與選自SEQID NO:3和6的成熟多肽的胺基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%、95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性； b)由以下編碼的多肽:i)在SEQID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii)SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低嚴格性條件下與i)、?)、或iii)的互補鏈雜交的多核苷酸； c)包含胺基酸序列中的一種或多種胺基酸的保守取代、缺失和/或插入的多肽，所述胺基酸序列選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽； d)由多核苷酸編碼的多肽，所述多核苷酸包含的核苷酸序列與SEQID NO:3或6的成熟多肽編碼序列具有至少 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100% 同一性；和 e)a)、b)、c)或d)的多肽的具有葡糖澱粉酶活性的片段。
2.一種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽包含的胺基酸序列與選自SEQID NO:3和6的成熟多肽的胺基酸序列具有至少75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性。
3.一種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽由以下編碼:i)在SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中包含的核酸序列、或ii) i)的cDNA序列、或iii) SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:5的序列、或iv)在至少低嚴格性條件下與i)、?)、或iii)的互補鏈雜交的多核苷酸。
4.一種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽包含選自SEQ ID NO:3和6的成熟多肽的胺基酸序列中的一種或多種胺基酸的保守取代、缺失和/或插入。
5.一種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽由包含與SEQ ID NO:3或6的成熟多肽編碼序列具有至少 75%,76%,77%,78%,79%,80%,81%,82%,83%,84%,85%,90%、95%、96%、97%、98%、99%或100%同一性的核苷酸序列的多核苷酸編碼。
6.一種具有葡糖澱粉酶活性的分離的多肽，所述多肽為根據權利要求1-5中任一項所述的多肽的片段。
7.根據權利要求1-6中任一項所述的多肽，其中所述胺基酸序列包含選自以下組的至少一種或多種胺基酸殘基: a)選自與SEQID NO:3或6中的第459位對應的位置處的A和P的胺基酸殘基， b)選自與SEQID NO:3或6中的第473位對應的位置處的C和S的胺基酸殘基， c)選自與SEQID NO:3或6中的第474位對應的位置處的A和R的胺基酸殘基， d)選自與SEQID NO:3或6中的第475位對應的位置處的A和P的胺基酸殘基， e)選自與SEQID NO:3或6中的第476位對應的位置處的T和Y的胺基酸殘基， f)選自與SEQID NO:3或6中的第477位對應的位置處的P和G的胺基酸殘基， g)選自與SEQID NO:3或6中的第479位對應的位置處的A和G的胺基酸殘基和/或 h)選自與SEQID NO:3或6中的第480位對應的位置處的V和R的胺基酸殘基。
8.根據權利要求1-7中任一項所述的多肽，其中所述胺基酸序列與SEQID NO:3或6的胺基酸序列具有至少 75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、90%,95%,96%,97%,98%,99%^； 100%序列同一性。
9.根據權利要求1-8中任一項所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO:3或6的胺基酸序列或其具有葡糖澱粉酶活性的片段，或者由SEQ ID NO:3或6的胺基酸序列或其具有葡糖澱粉酶活性的片段組成。
10.根據權利要求1-9中任一項所述的多肽，所述多肽包含SEQID NO:3或6的成熟多肽，或者由SEQ ID NO:3或6的成熟多肽組成。
11.根據權利要求1-10中任一項所述的多肽，其中一種胺基酸序列與另一種胺基酸序列的同一性百分數通過使用具有如下默認設置的蛋白質-蛋白質Blast搜索(http://blast, ncb1.nlm.nih.gov)來測定:得分矩陣:blosum62,非冗餘蛋白質序列資料庫和blast算法
12.根據權利要求1-11中任一項所述的多肽，所述多肽通過巴氏滅菌例如在啤酒中使用小於50、45、40、35、30、25、24、23、22、21或20個巴氏滅菌單位(PU)來滅活。
13.根據權利要求1-12中任一項所述的多肽，所述多肽的葡糖澱粉酶活性(GAU)為0.05-10GAU/mg,例如 0.l_5GAU/mg，例如 0.5_4GAU/mg，例如 0.7_3GAU/mg，或例如 1-3GAU/mg ο
14.根據權利要求1-13中任一項所述的多肽，其中所述多肽不具有SBD。
15.根據權利要求1-14中任一項所述的多肽，所述多肽具有至多480、481、482、483、484、485、486、487、488、489、490、495、500、505、507、515、525、535、545、555、565 或 573 個胺基酸殘基。
16.根據權利要求1-15中任一項所述的多肽，其中所述多肽與SEQID NO:3相比是截短的。
17.根據權利要求1-16中任一項所述的多肽，所述多肽通過在宿主細胞中的重組表達來獲得。
18.一種核酸，所述核酸能夠編碼根據權利要求1-17中任一項所述的多肽。
19.一種表達載體,所述表達載體包含根據權利要求18所述的核酸,或者能夠表達根據權利要求1-17中任一項所述的多肽。
20.如權利要求19所定義的表達載體或質粒，所述表達載體或質粒包含源自木黴屬(Trichoderma)的啟動子,例如源自裡氏木黴(T.reesei) cbhl的啟動子。。
21.如權利要求19所定義的表達載體或質粒，所述表達載體或質粒包含源自木黴屬的終止子，例如源自裡氏木黴cbhl的終止子。
22.根據權利要求19所述的表達載體或質粒，所述表達載體或質粒包含一種或多種選擇性標記，例如構巢麴黴(Aspergillus nidulans)amdS和pyrG。
23.根據權利要求19所述的表達載體或質粒,所述表達載體或質粒包含允許在宿主細胞中維持非染色體質粒的一個或多個端粒區域。
24.一種宿主細胞，所述宿主細胞具有如權利要求1-17中任一項所定義的多肽的異源表達。
25.如權利要求17和24中任一項所定義的宿主細胞，其中所述宿主細胞為真菌細胞。
26.根據權利要求25所述的宿主細胞，其中所述真菌細胞屬於木黴屬。
27.根據權利要求26所述的宿主細胞，其中所述真菌細胞屬於裡氏木黴物種。
28.根據權利要求26所述的宿主細胞，其中所述真菌細胞屬於紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)物種。
29.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含如權利要求19-23中任一項所定義的質粒或表達載體，優選地使用所述質粒或表達載體進行了轉化。
30.一種分離如權利要求1-17中任一項所定義的多肽的方法，所述方法包括以下步驟:在如權利要求25-29中任一項所定義的具有所述多肽的異源表達的宿主細胞中誘導所述多肽的合成；以及回收由所述宿主細胞分泌的細胞外蛋白質；以及任選地純化所述多肽。
31.一種製備如權利要求1-17中任一項所定義的多肽的方法，所述方法包括以下步驟:在如權利要求25-29中任一項所定義的具有所述多肽的異源表達的宿主細胞中誘導所述多肽的合成；以及任選地純化所述多肽。
32.—種表達如權利要求1-17中任一項所定義的多肽的方法，所述方法包括獲得如權利要求25-29中任一項所定義的宿主細胞，以及從所述宿主細胞表達所述多肽，以及任選地純化所述多肽。
33.根據權利要求30-32中任一項所述的方法，其中如權利要求1-17中任一項所定義的多肽為優勢分泌蛋白。
34.一種組合物，所述組合物包含如權利要求1-17中任一項所定義的一種或多種多肽。
35.根據權利要求34所述的組合物，其中所述組合物選自澱粉水解組合物、糖化組合物、洗滌劑組合物、醇發酵酶組合物，以及動物飼料動物飼料組合物。
36.根據權利要求34-35中任一項所述的組合物，所述組合物包含一種或多種另外的酶。
37.根據權利要求36所述的組合物，其中所述一種或多種另外的酶選自α-澱粉酶、β -澱粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、內肽酶、外肽酶)、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶和相關的葡聚糖水解輔助酶、木聚糖酶和木聚糖酶輔助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶)、乙醯乳酸脫羧酶和葡糖澱粉酶，包括它們的任何一種或多種組合。
38.根據權利要求34-37中任一項所述的組合物，所述一種或多種多肽和/或一種或多種另外的酶通過巴氏滅菌來滅活。
39.根據權利要求38所述的組合物，其中所述多肽和/或所述一種或多種另外的酶通過巴氏滅菌例如在啤酒中通過使用小於50、45、40、35、30、25、24、23、22、21或20個巴氏滅菌單位(PU)來滅活。
40.如權利要求1-17中任一項所定義的多肽或如權利要求34-39中任一項所定義的組合物在發酵中的用途，其中在發酵步驟之前或期間添加所述多肽或組合物。
41.根據權利要求40所述的用途，其中所述發酵步驟和任選的啤酒過濾步驟之後是巴氏滅菌步驟。
42.根據權利要求40-41中任一項所述的用途，其中所述發酵包括在用於製造發酵飲料的工藝中。
43.根據權利要求40-42中任一項所述的用途，其中所述發酵飲料選自啤酒，例如低醇啤酒或低卡路裡啤酒。
44.根據權利要求40-43中任一項所述的用途，其中所述多肽或所述組合物與一種或多種另外的酶組合進行添加。
45.根據權利要求44所述的用途，其中所述一種或多種另外的酶選自α-澱粉酶、β -澱粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、內肽酶、外肽酶)、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶和相關的β -葡聚糖水解輔助酶、木聚糖酶和木聚糖酶輔助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶)、乙醯乳酸脫羧酶和葡糖澱粉酶，包括它們的任何一種或多種組合。
46.根據權利要求40-45中任一項所述的用途，其中所述多肽和/或所述一種或多種另外的酶在所述巴氏滅菌步驟中失活。
47.根據權利要求40-46中任一項所述的用途，其中以l-1000mg/kg谷粉，例如20-500mg/kg 谷粉、例如 30-400mg/kg 谷粉、例如 40_300mg/kg 谷粉、例如 50_200mg/kg 谷粉的量來添加所述多肽。
48.不耐熱多肽用以提高釀造工藝中的發酵步驟中可發酵糖的產量的用途，其中所述多肽如權利要求1-17中任一項所定義。
49.一種方法，所述方法包括在發酵步驟例如使用酵母的發酵步驟之前或發酵步驟期間添加如權利要求1-17中任一項所定義的多肽或如權利要求34-39中任一項所定義的組合物。
50.根據權利要求49所述的方法，所述方法包括所述發酵步驟或任選的啤酒過濾步驟之後的巴氏滅菌步驟。
51.根據權利要求49-50中任一項所述的方法，其中所述發酵包括在用於製造發酵飲料的工藝中。
52.根據權利要求49-51中任一項所述的方法，其中所述發酵飲料選自啤酒，例如低醇啤酒、低卡路裡啤酒。
53.根據權利要求49-51中任一項所述的方法，其中所述多肽或所述組合物與一種或多種另外的酶組合進行添加。
54.根據權利要求53所述的方法，其中所述一種或多種另外的酶選自α-澱粉酶、β -澱粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、內肽酶、外肽酶)、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶和相關的β -葡聚糖水解輔助酶、木聚糖酶和木聚糖酶輔助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶)、乙醯乳酸脫羧酶和葡糖澱粉酶，包括它們的任何一種或多種組合。
55.根據權利要求49-54中任一項所述的方法，其中所述多肽和/或所述一種或多種另外的酶在所述巴氏滅菌步驟中失活。
56.根據權利要求49-55中任一項所述的方法，其中以l-1000mg/kg谷粉，例如20-500mg/kg 谷粉、例如 30-400mg/kg 谷粉、例如 40_300mg/kg 谷粉、例如 50_200mg/kg 谷粉的量來添加所述多肽。
57.根據權利要求49-56中任一項所述的用於生產發酵飲料的方法，所述方法包括以下步驟: a)製備糖化醪， b)過濾所述糖化醪以獲得麥芽汁，以及 c)對所述麥芽汁進行發酵以獲得發酵飲料， 其中將權利要求1-17中任一項所定義的多肽或權利要求34-39中任一項所定義的組合物添加到: 1.步驟(a)的所述糖化醪和/或 ?.步驟(b)的所述麥芽汁和/或 ii1.步驟(c)的所述麥芽汁。
58.根據權利要求57所述的方法，其中對所述發酵飲料執行巴氏滅菌步驟(d)。
59.根據權利要求57-58中任一項所述的方法，其中步驟(a)中的所述糖化醪得自谷粉。
60.根據權利要求57所述的方法，其中所述谷粉包含發芽和/或未發芽的穀粒或來自另一種作物的澱粉基材料中的一種或多種。
61.根據權利要求57-60中任一項所述的方法，所述方法進一步包括使步驟(a)的所述糖化醪接觸一種或多種另外的酶。
62.根據權利要求61所述的方法，其中所述酶選自澱粉脫支酶、R-酶、極限糊精酶、α_澱粉酶、β_澱粉酶、肽酶(蛋白酶、朊酶、內肽酶、外肽酶)、支鏈澱粉酶、異澱粉酶、纖維素酶、內切葡聚糖酶和相關的β -葡聚糖水解輔助酶、木聚糖酶和木聚糖酶輔助酶(例如阿拉伯呋喃糖苷酶、阿魏酸酯酶、木聚糖乙醯酯酶)、乙醯乳酸脫羧酶和葡糖澱粉酶，包括它們的任何一種或多種組合。
63.根據權利要求57-62中任一項所述的方法，所述方法進一步包括使步驟(b)或(c)的所述麥芽汁接觸一種或多種另外的酶，其中所述酶選自澱粉脫支酶、異澱粉酶和極限糊精酶，包括它們的任何一種或多種組合。
64.一種發酵飲料，其中所述發酵飲料通過如權利要求49-63中任一項所定義的方法來生產。
65.根據權利要求64所述的發酵飲料，所述發酵飲料為啤酒，例如低醇啤酒或低卡路裡啤酒。
66.一種用於生產食品、飼料或飲料產品的方法，例如醇飲料或無醇飲料，例如像啤酒或威士忌的基於穀類或麥芽的飲料，例如葡萄酒、蘋果酒、醋、米酒、醬油或果汁，所述方法包括使用根據權利要求1-17所述的多肽或如權利要求34-39中任一項所定義的組合物來處理含有澱粉和/或糖的植物材料的步驟。
67.一種試劑盒，所述試劑盒包含根據權利要求1-17所述的多肽或如權利要求34-39中任一項所定義的組合物；以及所述多肽或組合物的使用說明書。
【文檔編號】C12N9/26GK104011067SQ201280063536
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2012年12月20日 優先權日:2011年12月22日
【發明者】J.F.克拉梅, N.M.菲什, P.E.德格恩, I.尼科拉伊, P.克魯伊託夫, P.範索林根, S.範斯蒂格特坦恩斯, S.布雷內曼, J.K.舍蒂, S.H.李 申請人:杜邦營養生物科學有限公司