具有n末端延伸的葡糖澱粉酶的製作方法

2023-10-25 13:44:27 3

專利名稱：具有n末端延伸的葡糖澱粉酶的製作方法
技術領域：
本發明涉及親本葡糖澱粉酶的變體、編碼該變體葡糖澱粉酶的DNA序列和利用該變體酶水解澱粉的方法。
更具體而言，本發明涉及改良了熱穩定性的葡糖澱粉酶變體。
背景技術：
葡糖澱粉酶(1，4-α-D-葡聚糖葡糖水解酶，EC3.2.1.3)是催化從澱粉或相關寡糖和多糖的非還原末端釋放D-葡萄糖的酶。葡糖澱粉酶由幾種絲狀真菌和酵母產生，從麴黴屬真菌中產生的所述酶在商業上最重要。
在商業上，葡糖澱粉酶被用來將已經被α澱粉酶部分水解的玉米澱粉轉變成葡萄糖。葡萄糖異構酶將所述葡萄糖進一步轉變成由幾乎等量的葡萄糖和果糖組成的混合物。所述混合物，或者進一步富含果糖的混合物，是世界範圍內商業最常用的高果糖玉米糖漿。所述糖漿是世界上通過酶加工法製備的最大噸位的產品。涉及將澱粉轉變成果糖的三種酶是最重要的工業酶。
葡糖澱粉酶在生產高果糖糖漿的商業應用中，存在的主要問題之一是葡糖澱粉酶相對低的熱穩定性。葡糖澱粉酶的熱穩定性不如α澱粉酶或葡糖異構酶，並且與α澱粉酶或葡糖異構酶相比，它在較低的pH條件下活性最高且最穩定。因此，它必須在較低的溫度和pH條件下在獨立的容器中應用。
發明概述因此，本發明的目的是改良具有葡糖澱粉酶活性的酶的特性，尤其是改良所述酶的熱穩定性。
已經意外的發現，通過在酶的N末端連接肽延伸區，有可能顯著提高具有葡糖澱粉酶活性的酶的熱穩定性。
因此，本發明的第一個方面涉及親本葡糖澱粉酶的變體，其在N末端具有肽延伸區。
在本文中，術語「肽延伸區」是指將一個或更多的保守胺基酸殘基加到所述親本(成熟)葡糖澱粉酶的N末端。
術語「成熟葡糖澱粉酶」指其傳統意思，即指由產生該酶的目的生物進行翻譯後加工和分泌後加工(糖基化修飾並且去掉N和/或C末端序列，例如前肽或原肽序列)之後，得到的葡糖澱粉酶的活性形式。更具體而言，指如果存在前肽或原肽序列等胺基酸序列，將其從最初翻譯產生的葡糖澱粉酶(即未加工的葡糖澱粉酶)中去除。本定義包括的成熟葡糖澱粉酶是經三肽氨肽酶(TPAP)剪切(加工)的葡糖澱粉酶，所述TPAP在位置3處即Leu和Asp之間剪切黑麴黴葡糖澱粉酶(見SEQ ID NO1)。
術語「親本葡糖澱粉酶」指根據本發明待修飾的葡糖澱粉酶。所述親本葡糖澱粉酶可以是天然產生(野生型)的葡糖澱粉酶，或者可以是通過任何適當方式製備的其變體。例如，親本葡糖澱粉酶可以是經修飾的天然葡糖澱粉酶的變體，所述修飾是在天然葡糖澱粉酶的胺基酸序列上，通常是在所述葡糖澱粉酶的結構部分中替代、刪除或截斷一個或更多的胺基酸殘基，或者增加或插入一個或更多的胺基酸殘基。
本發明的其他方面涉及編碼上述葡糖澱粉酶變體的DNA序列、DNA構建體、包括本發明DNA序列的重組表達和攜有本發明DNA序列或本發明載體的宿主細胞。
本發明的葡糖澱粉酶變體可以方便用於澱粉轉化方法中，因此在另一個方面，本發明涉及將澱粉或部分水解的澱粉轉化成含葡萄糖的糖漿的方法，所述方法包括在本發明的葡糖澱粉酶變體存在的條件下，糖化澱粉水解產物的步驟。
在最後一個方面中，本發明提供了通過產生N末端延伸區改良親本葡糖澱粉酶熱穩定性的方法。
本發明的發明者提供了大量的改良了熱穩定性的親本葡糖澱粉酶變體。通過將肽延伸區連接到親本葡糖澱粉酶可獲得所述改良的熱穩定性。這在下面將詳細敘述。
發明詳述肽延伸區如上所述，已經意外的發現，當親本葡糖澱粉酶的N末端能找到適當的肽延伸區時，可以獲得葡糖澱粉酶變體，尤其是具有改良的熱穩定性的變體。本發明以此發現為基礎。
在本文中，「在N末端能找到」意思是成熟的葡糖澱粉酶在N末端具有肽延伸區。在一個實施方案中，所述肽延伸區是所述親本葡糖澱粉酶固有的，即在翻譯後加工去除原肽和/或前肽序列之前存在。因此，所述肽延伸區可以是未加工的親本葡糖澱粉酶的前肽和/或原肽序列，其在表達和翻譯後加工之後通常被除去或剪切掉。
在另一個實施方案中，所述延伸區是一種N末端肽，其等同於供體細胞在加工期間通常被切去的肽序列，例如前肽和/或原肽序列。在大部分情況中，所述肽延伸區不同於所述前肽或原肽序列。這將在下面進一步敘述。
可用本領域已知的任何蛋白工程方法使所述延伸區與N末端連接。
術語「具有改良的熱穩定性的葡糖澱粉酶變體」在本發明中是指在溫育一定時間之後比相應的親本葡糖澱粉酶變體具有更高的T1/2(半衰期)或殘留酶活性。熱穩定性(例如T1/2和殘留活性)的測定方法，在下面的材料和方法章節中敘述。
術語「適當的肽延伸區」指所用肽延伸區是能夠影響上述改良的熱穩定性的肽延伸區。通過連接了所述肽延伸區的修飾型葡糖澱粉酶變體與相應親本葡糖澱粉酶之間熱穩定性的比較分析，可以檢查所述肽延伸區的「適當性」。例如，通過任何適當的技術，如在本申請中敘述的熱穩定性檢測方法，可以檢測所述熱穩定性。
目前認為，肽延伸區提供如改良熱穩定性等所需效應的能力依賴於下列特點，例如被修飾的親本葡糖澱粉酶的特性、所述肽延伸區的結構(包括長度)、肽延伸區對整個葡糖澱粉酶變體的結構的影響、所述肽延伸區的胺基酸的特性或功能等。肽延伸區能夠提供所需效應的前提條件當然是包括所述肽延伸區的葡糖澱粉酶變體可以在適當的宿主生物中表達。設計適當肽延伸區時，通常考慮以下幾點肽延伸區的長度已經發現胺基酸殘基數目各異的肽延伸區能夠提供所需作用，因此不可能指定本發明肽延伸區之胺基酸殘基的確切數目。考慮根據肽延伸區對所得經修飾之葡糖澱粉酶變體的表達、結構和/或活性的影響，確定胺基酸殘基數的上限。
因此所述肽延伸區可以包括1-100個胺基酸殘基，優選1-50個胺基酸殘基，更優選1-20甚至更優選1-10個胺基酸殘基。
穩定性肽延伸區應當被優先選擇的條件是提供具有可接受的穩定性(例如結構穩定性和/或表達穩定性)，或者使得不顯著降低葡糖澱粉酶結構穩定性的葡糖澱粉酶變體。雖然認為許多肽延伸區沒有給所得葡糖澱粉酶變體提供任何結構不穩定性，但是對肽延伸區的選擇可能會受到特定情況，以及特定親本葡糖澱粉酶(其本身能給修飾型葡糖澱粉酶變體提供結構穩定性)的影響。例如，所述肽延伸區可以增加相互作用的數目，和/或通過在從N末端延伸區到下述的N末端殘基之間增加半胱氨酸橋，進行共價結合。
肽延伸區胺基酸殘基的特性為了改進N末端殘基和N末端延伸區之間的相互作用，所述殘基應當優選不易形成α螺旋的殘基，並因此在本發明中應用。這能夠通過下述事實進行合理解釋，即如果N-末端的α螺旋向N末端延伸，那麼它將伸出結構之外而不與N末端殘基接觸。本發明的肽延伸區包括通過改良N末端殘基和N末端延伸區之間的接觸而改良了穩定性的那些。在給定的N末端延伸區之內，殘基的主要部分必須選自不形成螺旋的基因。考慮通過利用在螺旋的N末端、和/或螺旋的中間和/或螺旋的C末端部分中具有更低的或相同的α螺旋形成傾向的殘基，可使N末端殘基和N末端延伸區之間的接觸得到最佳改進。當將延伸區放置於葡糖澱粉酶中天然α螺旋的N末端部分時，優選α螺旋的N末端傾向性更低的殘基。下述殘基可以在本發明中用作非α螺旋形成者殘基，即M(甲硫氨酸)、K(賴氨酸)、H(組胺酸)、V(纈氨酸)、I(異亮氨酸)、Y(酪氨酸)、C(半胱氨酸)、F(苯丙氨酸)、T(蘇氨酸)、G(甘氨酸)、N(天冬醯胺)、P(脯氨酸)、S(絲氨酸)和D(天冬氨酸)。
在本發明中「N末端殘基」指N末端殘基附近的殘基，它們離N末端殘基的中心18、12和/或8的範圍內，並且不是所述N末端延伸區的一部分。更優選延伸區在10之內但在酶表面上，其為用Connelly水可接近性表達程序((1988年10月版)，參考W.Kabsch和C.Sander，生物多聚體22(1983)pp.2577-2637)所定義的具有可接近性所需數目的殘基。
「不形成螺旋的殘基」在此由(蛋白質Creighton T.E.(1983))中表6.5定義，在該表中敘述了不同胺基酸殘基的不同傾向性。
或者，通過在本發明的葡糖澱粉酶中引入半胱氨酸橋，可以改良結構穩定性。例如，如果肽延伸區的至少一個胺基酸殘基是半胱氨酸殘基，其位置致使其能夠與葡糖澱粉酶變體之成熟部分中的半胱氨酸殘基形成共價結合，那麼可以在所述肽延伸區和葡糖澱粉酶變體的成熟部分之間建立半胱氨酸橋。在實施例3中舉例說明了引入半胱氨酸橋的積極作用。如果在成熟的葡糖澱粉酶中沒有合適的半胱氨酸，通過置換親本葡糖澱粉酶中被認為對於活性不重要的胺基酸，在所述親本葡糖澱粉酶的適當位置上可以方便地插入半胱氨酸。
通常，可以將本發明中包含半胱氨酸殘基的肽延伸區的胺基酸序列用下式表示X-C-X(n)其中X各代表一個胺基酸，優選上述不形成α螺旋的胺基酸，更優選具有短側鏈的胺基酸。
在Cys的C末端側和經加工的天然N末端之間，X殘基的數目可以是大於或等於5的任何數(n)，優選5到100，更優選5到10，更優選5。
實例有ACGPSTS(SEQ ID NO25)ACPGTST(SEQ ID NO26)ACGTGTS(SEQ ID NO27)ACTGSTG(SEQ ID NO28)ACGPSTSG(SEQ ID NO29)ACPGTSTG(SEQ ID NO30)ACGTGTSS(SEQ ID NO31)ACTGSTGT(SEQ ID NO32)葡糖澱粉酶(如黑麴黴G1或G2 AMG)的天然原肽被kex2樣蛋白酶(二元蛋白酶)切割。因此，kex2蛋白酶是能夠切割kex2或kex2樣位點的蛋白酶。Kex2位點(如見酶學方法，185卷，D.Goeddel主編，Aacademic Press Inc.(1990)，San Diego，CA，「基因表達技術」)，kex2樣位點是在一些蛋白的原肽編碼區和成熟區發現的二元識別位點(即切割位點)。
在此切割位點突變可以保持N末端原肽的完整。
實例NVIPPR(SEQ ID NO33)NPPIRP(SEQ ID NO34)NVIPRP(SEQ ID NO35)
另一個可能性是在選擇用來表達葡糖澱粉酶基因的宿主中，刪除或滅活kex2樣蛋白酶編碼基因。這也可以保持N末端肽延伸區的完整。
在用於表達的目的宿主中，也可以刪除或滅活其它編碼涉及N末端加工的蛋白酶的基因，如三肽氨肽酶編碼基因。
半胱氨酸變體的N末端殘基是指N末端殘基附近的殘基，即在離N末端殘基的中心18、12和/或8的範圍內，並且其不是所述N末端延伸區的一部分。通常，可以將本發明中包含半胱氨酸殘基的肽延伸區的胺基酸序列表示為X-C-X-X-X-X-X，其中X各代表一個上述不形成α螺旋的胺基酸。
在一個具體的實施方案中，所述葡糖澱粉酶變體包括肽延伸區，其能夠與親本葡糖澱粉酶的成熟部分形成共價結合。在另一個具體實施方案中，所述葡糖澱粉酶變體在肽延伸區中包括一個或更多的半胱氨酸殘基，並且在所述親本葡糖澱粉酶的成熟部分中包括一個半胱氨酸殘基，而且所述的半胱氨酸殘基可以共同形成半胱氨酸橋。在另一個具體實施方案中，所述親本葡糖澱粉酶的成熟部分中的半胱氨酸殘基被親本葡糖澱粉酶的胺基酸殘基插入，或取代。在最優選的具體實施方案中，用半胱氨酸殘基替代了黑麴黴G1葡糖澱粉酶胺基酸序列的375位上的天冬氨酸殘基、或299位上的穀氨酸殘基、或431位上的絲氨酸殘基、或471位上的丙氨酸殘基、或479位上的丙氨酸殘基、或480位上的蘇氨酸、或481位上的脯氨酸殘基、或8位上的絲氨酸殘基。
具體地，與親本葡糖澱粉酶連接的肽延伸區優選下述延伸區之一Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg(NVISRR)，或Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg(NVIPKR)，或Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ASPPSTS)，或Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ACPPSTS)，或Pro-Cys-Ser-Ala-G1y-Glu(PCSAGE)，或Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp(PLALSD)，或Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu(LGVTGE)，或Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu(AGPLPSE)，或Leu-Gly-Pro-Asp(LGPD)，或Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg(IFELTPR)，或Ile-Ser-Asn(ISN)，或
Met-Asn(MN)。
在本文中，三肽氨肽酶(TPAP)是指從肽或蛋白序列(例如原激素或原酶中延伸的胺基酸序列)的N末端切割三肽的氨肽酶。當三肽氨肽酶(TPAP)從肽、寡核苷酸或蛋白質的未被替代的N末端中切割三肽片段時，有時會導致穩定性降低。更具體而言，三肽氨肽酶對N末端的切割可降低葡糖澱粉酶的穩定性。因此，本發明還涉及一種親本葡糖澱粉酶的變體，其中所述肽延伸區能夠阻止三肽氨肽酶(TPAP)切割所述葡糖澱粉酶。
將肽延伸區與親本葡糖澱粉酶連接的方法雖然通過將合成的肽延伸區加入(融合或插入)討論的所述親本葡糖澱粉酶中，可以獲得本發明的變體，目前優選通過下述方法製備本發明的葡糖澱粉酶變體i)修飾編碼所述親本葡糖澱粉酶的核苷酸序列(優選DNA序列)，使其編碼應用於所述親本葡糖澱粉酶N末端的肽延伸區(例如，在編碼親本葡糖澱粉酶的核酸序列(優選DNA序列)的相關位置上，插入編碼所述肽延伸區的核酸序列(優選DNA序列))，ii)在適當的表達系統中表達所得經修飾的核酸(優選DNA)序列，iii)回收產生的葡糖澱粉酶變體。
在本文中，術語「連接在」是指所述延伸區與成熟葡糖澱粉酶的N末端(例如最後一個胺基酸殘基)融合。
許多葡糖澱粉酶表達為「前原葡糖澱粉酶」，即由成熟葡糖澱粉酶、分泌信號肽(即前肽)和原肽組成的葡糖澱粉酶。所述前原葡糖澱粉酶在細胞內進行加工，以分泌入發酵培養基中，從此培養基中可以分離並純化成熟的葡糖澱粉酶。通過將編碼所需肽延伸區的核酸序列連接到編碼所述親本葡糖澱粉酶的DNA序列的上遊(指N末端肽延伸區)，可以實現給所述親本葡糖澱粉酶加入肽延伸區。
所述的插入應該以這樣的方式進行，其致使所需葡糖澱粉酶變體(即具有所需肽延伸區)轉錄、翻譯、加工之後，被宿主細胞表達和分泌。在本文中術語「加工」是指去除前肽和原肽(當然，當原肽與所需肽延伸區相同時例外。這在下面將進一步涉及。)在大部分情況中，通過在編碼原肽或前肽(如果不存在原肽序列)的DNA序列和編碼成熟葡糖澱粉酶的DNA序列之間插入編碼肽延伸區的DNA序列，延伸所述親本葡糖澱粉酶是可能的。
編碼肽延伸區DNA序列的插入/加入可以用分子生物領域技術人員熟知的任何技術(例如，Sambrook等，1989)完成。例如，所述技術包括應用特異性引物的聚合酶鏈式反應(PCR)，如在美國專利4683202或RK.Saiki等，(1988)，科學，239，487-491所述。下面將敘述如何表達和分泌鄰近DNA序列。
雖然為製備本發明的葡糖澱粉酶變體選擇適當表達系統時(尤其是當將經修飾的DNA用於製備時)必須小心注意，已經發現通過下述方法可以獲得根據本發明的葡糖澱粉酶變體，即通過在表達系統中表達編碼目的親本葡糖澱粉酶的DNA序列，所述表達系統不能以正常方式加工所翻譯的多肽並因此導致產生下述葡糖澱粉酶，其包括部分或全部原肽，或者包括相關於成熟肽加工前的類似肽序列。此時，所述原肽或類似肽序列組成肽延伸區。原肽或類似肽序列可以與親本葡糖澱粉酶異源或同源，並且可能在親本葡糖澱粉酶的N末端出現。利用後一種技術生產據本發明葡糖澱粉酶變體的方法見下文。
因此，如果一段適當長度的胺基酸序列已經編碼在親本葡糖澱粉酶的前肽形式中，並且此段胺基酸序列在葡糖澱粉酶加工-過程中被指定的表達系統剪切，那麼可以通過將所述表達的宿主系統變為不能對所述胺基酸序列進行所述加工的系統，來應用所述肽延伸區。在這種情況中，分泌信號前肽將在分泌期間或其後被剪切，最終得到經修飾的葡糖澱粉酶，其由包括原肽或其一部分或相應DNA序列編碼的相似肽序列的親本葡糖澱粉酶組成，即葡糖澱粉酶在N末端被延伸。
已經發現酵母細胞對在親本真菌葡糖澱粉酶尤其是黑麴黴葡糖澱粉酶中應用肽延伸區(以原肽或其一部分的形式)有特殊用途。
在一個高度優選的實施方案中，根據下述原則以隨機誘變的方式設計並應用肽延伸區a)對編碼具有肽延伸區的親本葡糖澱粉酶的DNA序列在所述親本葡糖澱粉酶的肽延伸區或N末端進行定域隨機誘變，b)在宿主細胞中表達在步驟a)中獲得的突變DNA序列，c)篩選表達突變型葡糖澱粉酶的宿主細胞，所述突變葡糖澱粉酶與親本葡糖澱粉酶相比具有改良的效果。
通過這種方法產生了大量高度有利的肽附加區。
可以基本上按WO95/22615中敘述的方法進行定域隨機誘變。更具體而言，在使僅僅一個或更多上述區域產生誘變的條件下，進行誘變。尤其對於誘變大的肽延伸區，可涉及PCR誘變(例如，Deshler1992或Leung等，1989中所述)，其中應用一個或更多的適當的寡核苷酸探針，所述探針在被誘變區域的旁側。對於較短的肽延伸區的誘變，更優選通過應用摻入的寡核苷酸進行定域隨機誘變。所述摻入用來避免不想要的胺基酸殘基的密碼子或用來增加在所需位點引入特殊類型胺基酸的可能性，如帶正電荷或疏水性胺基酸殘基。
誘變之後，通過在允許表達發生的條件下，培養攜帶所述DNA序列的適當宿主細胞，表達突變DNA。用於此目的的宿主細胞可以是已用所述任選在載體上的突變DNA序列轉化的細胞，或者是在誘變處理期間攜帶編碼親本酶的DNA序列的細胞。合適的宿主細胞的實例在下面給出，並且優選能分泌突變酶的宿主細胞(以簡化篩選)。已經發現酵母細胞，例如釀酒酵母的細胞是合適的宿主細胞。
親本葡糖澱粉酶根據本發明考慮的親本葡糖澱粉酶包括真菌葡糖澱粉酶，尤其是從麴黴菌菌株中獲得的真菌葡糖澱粉酶，例如黑麴黴或泡盛麴黴葡糖澱粉酶和其變體或突變體、同源葡糖澱粉酶、在結構上和/或功能上與SEQ ID NO1相似的其它葡糖澱粉酶。尤其黑麴黴葡糖澱粉酶G1和G2，見Boel等，(1984)，「用兩種不同但密切相關的mRNAs合成黑麴黴的葡糖澱粉酶G1和G2」，EMBO J3(5)，p.1097-1102。所述G2葡糖澱粉酶在SEQ ID NO1中給出。
可商購的親本葡糖澱粉酶可商購的親本葡糖澱粉酶包括Novo Nordisk的AMG，還有美國Genencor Inc和荷蘭代夫特Gist-Brocades公司的葡糖澱粉酶。
親本同源性葡糖澱粉酶根據兩個蛋白序列之間的相似程度確定所述親本葡糖澱粉酶的同源性，表明第一個序列從第二個序列中衍生。利用在本領域中已知的電腦程式例如在GCG軟體包中提供的GAP(Wisconsin軟體包的程序手冊，8版，1994年8月，遺傳學計算機組，575 Scienee Drive，Madison，Wisconsin，美國，53711)(Needleman S.B和WunschC.D.，(1970)分子生物學雜誌，48，p.443-453)，可以適當地確定所述同源性。利用GAP及以下設置進行多肽序列的比較GAP產生罰分3.0和GAP延伸罰分0.1，顯示由本發明的類似DNA序列編碼之多肽的成熟部分與SEQ ID NO1所示胺基酸序列的成熟部分的同一性程度優選至少為80％，優選至少90％，更優選至少95％，更優選至少97％，最優選至少99％。
在一個優選的實施方案中，在約60-80℃(優選63-73℃)和pH4-5(優選4.2-4.7)的條件下，利用麥芽糖糊精作為底物，本發明的變體的熱穩定性提高。
在另一個優選實施方案中，所述親本同源性葡糖澱粉酶包括微生物的葡糖澱粉酶。在更優選的實施方案中，所述微生物包括真細菌、古細菌、真菌、藻類和原生動物，在另一個更優選的實施方案中，親本同源性葡糖澱粉酶來源於絲狀真菌。
在高度優選的實施方案中，所述親本同源性葡糖澱粉酶是黑麴黴G1葡糖澱粉酶(Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)，p.1079-1102)。所述親本葡糖澱粉酶可以是被截短的葡糖澱粉酶。
製備葡糖澱粉酶變體的方法用於向基因中引入突變的幾種方法在本領域中已經熟知。在簡要討論編碼葡糖澱粉酶的DNA序列的克隆之後，將討論在葡糖澱粉酶編碼序列中特定位點引入突變的方法。
克隆編碼葡糖澱粉酶的DNA序列可使用本領域眾所周知的多種方法，從產生目的葡糖澱粉酶的任何細胞或微生物中分離編碼親本葡糖澱粉酶的DNA序列。首先，從可產生目的酶的生物獲得染色體DNA或信使RNA，從中構建基因組DNA和/或cDNA文庫。然後，如果所述葡糖澱粉酶的胺基酸序列是已知的，可合成標記的寡核苷酸探針，使用該探針從所述生物的基因組文庫中鑑定出編碼葡糖澱粉酶的克隆。或者，可使標記的寡核苷酸探針包含同源於另一已知的葡糖澱粉酶基因的序列，用該探針通過較低嚴緊度的雜交和洗滌條件鑑定出編碼葡糖澱粉酶的克隆。
鑑定葡糖澱粉酶編碼克隆的另一種方法包括將基因組DNA片段插入表達載體如質粒中，用所得基因組DNA文庫轉化葡糖澱粉酶-陰性細菌，然後將轉化的細菌鋪於含有葡糖澱粉酶底物(即麥芽糖)的瓊脂上，從而鑑定出表達葡糖澱粉酶的克隆。
或者，可以通過現有標準方法，如S.L.Beaucage和M.H.Caruthers，(1981)，四面體通訊22，1859-1869頁所述的膦醯胺法或者Matthes等，(1984)，EMBOJ.3，801-805頁所述的方法，人工合成編碼所述葡糖澱粉酶的DNA序列。在膦醯胺法中，寡核苷酸在自動DNA合成儀中合成，純化，退火，連接並克隆至適當載體中。最後，DNA序列可以是根據標準技術，通過連接人工合成的，基因組的或cDNA來源的片段(適當時，這些片段對應於完整DNA序列的多個部分)而製備的基因組DNA與合成的DNA的混合序列，合成DNA與cDNA來源的DNA的混合序列，或基因組DNA與cDNA來源的DNA的混合序列。也可按US4,683,202或R.K.Saiki等，(1988)，科學239，1988，487-491頁所述，使用特異性引物，通過聚合酶鏈反應(PCR)製備DNA序列。
在與誘變劑溫育或接觸之後，在允許表達發生的條件下，通過培養攜帶所述DNA序列的適當宿主細胞，可表達突變的DNA。用於此目的的宿主細胞可以是已用所述任選在載體上的突變DNA序列轉化的細胞，或者是在誘變處理期間攜帶編碼親本葡糖澱粉酶的DNA序列的細胞。合適的宿主細胞的實例如下革蘭氏陽性細菌，例如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌或淡紫青鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌；和革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌。所述突變DNA序列可以進一步包括編碼能使突變的DNA序列表達的DNA序列。
定點誘變一旦分離了編碼葡糖澱粉酶的DNA序列並且鑑定了所需突變位點，可以利用合成的寡核苷酸引入突變。這些寡核苷酸包括在所需突變位點旁側的核苷酸序列。在具體方法中，在攜帶葡糖澱粉酶基因的載體中，使編碼葡糖澱粉酶基因的DNA產生一個單鏈缺口。然後，將含有所需突變的合成的核苷酸與該單鏈DNA的同源部分退火。用DNA聚合酶I(Klenow片段)將剩餘的缺口補齊，並且用T4連接酶連接構建體。在Morinaga等，(1984)，生物技術2，p.646-639中敘述了所述方法的具體實例。美國4760025公開了通過對表達盒的輕微修改，引入編碼多突變的寡核苷酸。然而，通過Morinaga法一次可以引入更多的突變，因為大量的長度各異的寡核苷酸可被引入。
在Nelson和Long，(1989)，分析生物化學，180，p.147-151中敘述了用於向編碼萄糖澱粉酶的DNA序列中引入突變的另一個方法。其包括PCR片段的三步生成，所述PCR片段包括所需的突變，通過在PCR反應中將化學合成的DNA鏈用作為引物之一來引入所述突變。通過用限制性內切酶切割的方法，可以從產生的PCR片段中分離攜帶突變的DNA片段，並且再克隆到表達質粒上。
另外，Sierks等，(1989)「泡盛麴黴葡糖澱粉酶的活性位點TrP120處的定點誘變」，蛋白質工程，2，621-625；Sierks等，(1990)，「通過誘變泡盛麴黴葡糖澱粉酶的Asp176，Glu179和Glu180確定的真菌葡糖澱粉酶催化機理」，蛋白質工程，卷3，193-198也描述了麴黴屬葡糖澱粉酶中的定點誘變。
隨機誘變優選對可譯為所示目的胺基酸序列的基因中至少三個部分或整個基因進行適當的定域隨機誘變或區域特異性隨機誘變。對編碼親本葡糖澱粉酶之DNA序列的隨機誘變可通過本領域已知的任何方法方便地進行。相應地，本發明進一步涉及製備親本葡糖澱粉酶變體的方法，其中相對於所述親本，所述變體顯示增加的熱穩定性，此方法包括(a)對編碼親本葡糖澱粉酶的DNA序列進行隨機誘變，(b)在宿主細胞中表達在步驟(a)中獲得的突變DNA序列，並且(c)篩選表達葡糖澱粉酶變體的宿主細胞，所述葡糖澱粉酶變體相對於親本葡糖澱粉酶具有改變的特性(即熱熱穩定性)。
本發明上述方法的步驟(a)優選用摻入型引物進行，與下文工作實例(見下)一樣。例如，利用適當的物理或化學誘變劑、利用適當的寡核苷酸、或通過對所述DNA序列進行PCR誘變，可以進行隨機誘變。而且，可以利用這些誘變劑的任意組合進行隨機誘變。誘變劑可以是誘導轉換、顛換、倒位、轉頻、缺失和/或插入的誘變劑。適合於本發明目的的物理或化學誘變的實例包括紫外(UV)照射、羥胺、N-甲基-N-氮-N-亞硝基胍(MNNG)、鄰甲基羥胺、亞硝酸、甲磺酸乙酯(EMS)、亞硫酸氫鈉、甲酸和核苷酸類似物。在應用這些試劑時，通常在適於誘變發生的條件下在有所選誘變劑存在的條件下，通過溫育編碼將要誘變的所述親本酶的DNA序列來進行誘變，並且篩選具有所需特性的突變DNA。當應用寡核苷酸進行誘變時，在合成寡核苷酸期間，可在所述寡核苷酸將要改變的位點上摻入三個非親本核苷酸。進行摻入，目的是避免不需要的胺基酸的密碼子。利用公開的技術，例如PCR、LCR或認為適當的任何DNA聚合酶和連接酶，可以將所述摻入型寡核苷酸摻入到編碼葡糖澱粉酶的DNA中。優選用「恆定隨機摻入」進行摻入，其中每個位點上的野生型和突變的百分率被預先定義。而且，所述的摻入可以指導特定核的優先引入，並且由此優先引入一個或更多特定胺基酸殘基。例如，所述的摻入可以被如此進行，以便使得在每個位點上引入90％的野生型和10％的突變型。在選擇摻入方案時的另一考慮是基於遺傳學以及蛋白結構的限制。可以通過利用DOPE程序制定所述摻入方案，所述DOPE程序尤其可確保避免摻入終止密碼子。當應用PCR誘變時，在增加核苷酸錯誤摻入的條件下，對化學處理的或非化學處理的編碼親本葡糖澱粉酶的基因進行PCR(Deshler1992；Leung等，技術，第1卷，1989，11-15頁)。大腸桿菌突變者菌株(Fowler等，分子普通遺傳學，1331974，PP.179-191)、釀酒酵母、或任何其他微生物的突變體可以被用於編碼葡糖澱粉酶的DNA的隨機誘變，例如通過用含有所述親本葡糖澱粉酶的質粒轉化突變菌株，培養帶有所述質粒的突變菌並且從所述突變菌中分離突變質粒。隨後用所述突變質粒轉化表達型生物。被誘變的DNA序列可以方便的呈現於從表達親本葡糖澱粉酶的生物中製備的基因組或cDAN文庫中。或者，所述DNA序列可以出現在適當的載體上，例如質粒或噬菌體，將這樣的載體與誘變劑溫育或暴露於誘變劑。通過整合到宿主細胞的基因組或通過存在於宿主細胞含有的載體上，也可以將待誘變的DNA呈現於宿主細胞中。最後，待誘變的DNA可以是分離的形式。應該明白進行隨機誘變的DNA序列優選cDNA或基因組DNA序列。在一些情況中，在進行表達步驟b)或篩選步驟c)之前，先擴增所述突變DNA序列較為有利。這類擴增可用本領域已知的方法實施，優選根據親本酶的DNA或胺基酸序列製備寡核苷酸引物，用其進行PCR擴增。在與誘變劑溫育或暴露之後，在允許表達發生的條件下，通過培養攜帶所述DNA序列的適當宿主細胞，可表達突變DNA。用於此目的的所述宿主細胞可以是用所述任選在載體上的突變DNA序列轉化的細胞，或者是在誘變處理期間攜帶編碼親本葡糖澱粉酶的DNA序列的細胞。合適的宿主細胞的實例如下革蘭氏陽性細菌，例如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌或淡紫青鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌；和革蘭氏陰性細菌如大腸桿菌。所述突變DNA序列可以進一步包括編碼能使突變的DNA序列表達的DNA序列。
定域隨機誘變所述隨機誘變可方便的定位於目的親本葡糖澱粉酶的一個部分中。例如當鑑定了酶的某些區域對酶的指定特性非常重要時，以及當預計修飾後可以獲得具有改良特性的變體時，進行隨機誘變可能有益。當闡明了所述親本酶的三級結構並且其與所述酶的功能有關時，通常可以鑑定出這樣的區域。
利用上述PCR誘變技術或任何本領域已知的適當技術，可以方便地進行定域誘變或區域特異性誘變。或者，例如通過插入到適當地載體，可以分離到編碼DNA序列中待修飾部分的DNA序列，並且隨後可利用任何上述誘變方法對所述部分進行誘變。
葡糖澱粉酶變體的表達根據本發明，可以使用表達載體，以酶的形式表達編碼所述變體的DNA序列，所述變體是通過上述方法或通過本領域已知的任何其它方法產生的，所述表達載體一般包括編碼啟動子，操縱子，核糖體結合位點，翻譯起始信號的控制序列，並任選包括阻抑蛋白基因或多種激活子基因。
表達載體攜有編碼本發明葡糖澱粉酶變體的DNA序列的重組表達載體可以是能方便地進行重組DNA操作的任何載體，載體的選擇經常取決於待導入載體的宿主細胞。載體可以是當導入宿主細胞時能整合至宿主細胞基因組，並能隨整合有該載體的染色體一起複製的載體。適當表達載體的例子包括pMT838。
啟動子在載體中，DNA序列應該與適當啟動子序列可操作相連。啟動子可以是在所選宿主細胞中表現出轉錄活性的任何DNA序列，啟動子可得自編碼蛋白質的基因，所述蛋白質可以與宿主細胞同源或異源。
介導編碼本發明葡糖澱粉酶變體的DNA序列的轉錄，尤其是在細菌宿主中的轉錄的適當啟動子有大腸桿菌lac操縱子的啟動子，天藍色鏈黴菌瓊脂糖酶基因的dagA啟動子，地衣芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyL)的啟動子，嗜熱脂肪芽孢桿菌產麥芽糖的澱粉酶基因(amyM)的啟動子，解澱粉芽孢桿菌α-澱粉酶基因(amyQ)的啟動子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動子等。為了在真菌宿主中轉錄，有用的啟動子有得自編碼米麴黴TAKA澱粉酶的基因的啟動子，釀酒酵母TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子(Alber等，(1982)，J.Mo1.Appl.Genet 1，p.419-434)，和米赫根毛黴天冬氨酸蛋白酶，黑麴黴中性α-澱粉酶，黑麴黴酸穩定的α-澱粉酶，黑麴黴葡糖澱粉酶，米赫根毛黴脂肪酶，米麴黴鹼性蛋白酶，米麴黴丙糖磷酸異構酶或構巢麴黴乙醯胺酶的啟動子。
表達載體本發明的表達載體也可含有適當的轉錄終止子，在真核生物中，所述載體還含有聚腺苷酸化序列，該序列與編碼本發明α-澱粉酶變體的DNA序列可操作相連。終止序列和聚腺苷酸化序列優選與啟動子有相同的來源。
載體也可進一步含有能使該載體在所述宿主細胞中複製的DNA序列。所述序列的例子是質粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的複製起點。
載體也可以含有選擇標記，例如產生可補償宿主細胞缺陷的產物的基因，如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因，或者能賦予抗生素抗性的基因，所述抗生素抗性如氨苄青黴素，卡那黴素，氯黴素或四環素抗性。另外，載體也可含有麴黴屬的選擇標記，如amdS，argB，niaD和sC，產生潮黴素抗性的一種標記，或可通過WO91/17243所述的共轉化完成選擇。
用於分別連接編碼酶變體的本發明DNA構建體，啟動子，終止子和其它元件的方法，和用於將它們插入含有複製所需信息的適當載體的方法是本領域技術人員眾所周知的(例見Sambrook等，分子克隆實驗室手冊，第2版，冷泉港，1989)。
宿主細胞含有如上所述的本發明DNA構建體或表達載體的本發明細胞，可以有利地用作重組生產本發明葡糖澱粉酶變體的宿主細胞。通過將編碼所述變體的本發明DNA構建體(一個或多個拷貝)整合至宿主染色體，可以方便地轉化細胞。一般認為這種整合是有利的，因為DNA序列更可能在細胞中穩定維持。可以根據常規方法，例如通過同源或異源重組將DNA構建體整合至宿主染色體。或者，可以用與不同類型的宿主細胞有關的上述表達載體轉化細胞。
本發明的細胞可以是高等生物的細胞，例如哺乳動物或昆蟲的細胞，但也可以是微生物細胞，例如細菌或真菌(包括酵母)細胞。
適當細菌的例子是革蘭氏陽性細菌，例如枯草芽孢桿菌，地衣芽孢桿菌，遲緩芽孢桿菌，短芽孢桿菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌，嗜鹼芽孢桿菌，解澱粉芽孢桿菌，凝結芽孢桿菌，環狀芽孢桿菌，燦爛芽孢桿菌，巨大芽孢桿菌，蘇雲金芽孢桿菌或淡紫青鏈黴菌或鼠灰鏈黴菌，或者革蘭氏陰性細菌，例如大腸桿菌。可通過原生質體轉化，或通過使用感受態細胞以本身已知的方法轉化細菌。
酵母優選糖酵母屬或裂殖糖酵母屬的種，例如釀酒酵母。
宿主細胞也可以是絲狀真菌，例如麴黴屬的菌株，如米麴黴或黑麴黴，或鐮孢屬的菌株，如尖孢鐮孢，禾穀鐮孢(最佳狀態稱為玉米赤黴，以前被稱為Sphaeria zeae，與Gibberella roseum和Gibberella roseumf.sp.cerealis是同義詞)，或硫色鐮孢(最佳狀態稱為蝨狀赤黴，與Fusarium trichothecioides，杆孢狀鐮孢，接骨木鐮孢，玫瑰色鐮孢和玫瑰色鐮孢禾穀變種是同義詞)，Fusarium cerealis(與Fusarium crokkwellnse是同義詞)，或Fusariumvenenatum。
在本發明的一個優選實施方案中，宿主細胞是蛋白酶缺損的蛋白酶陰性菌株。
例如，宿主細胞可以是蛋白酶缺損的米麴黴菌株JaL125，其鹼性蛋白酶基因(被稱為「alp」)缺失。該菌株描述於WO97/35956(Novo Nordisk)。
可通過形成原生質體，轉化原生質體，接著以其原有方式再生細胞壁，而轉化絲狀真菌細胞。麴黴屬作為宿主微生物的用途描述於EP238023(Novo Nordisk A/S)，其內容列入本文作為參考。
產生本發明酶變體的方法在另一方面，本發明涉及產生本發明葡糖澱粉酶變體的方法，所述方法包括在適於產生所述變體的條件下培養宿主細胞，和從細胞和/或培養物中回收所述變體。
用於培養所述細胞的培養基可以是適於培養目的宿主細胞並表達本發明葡糖澱粉酶變體的任何常規培養基。適當的培養基可以商購，或可根據公開的配方(例如描述於美國典型培養物保藏中心目錄中的配方)製備。
可通過眾所周知的方法從培養基中方便地回收宿主細胞分泌的葡糖澱粉酶變體，所述方法包括通過離心或過濾使細胞與培養基分開，利用鹽(如硫酸銨)沉澱培養基中的蛋白質組分，接著使用層析法，如離子交換層析，親和層析等。
澱粉轉化本發明提供了用本發明的葡糖澱粉酶變體從澱粉中生產葡萄糖的方法。總之，該方法包括如下步驟，即有α澱粉酶時部分水解前體澱粉，然後在葡糖澱粉酶存在的條件下，通過切割α-(1→4)和α-(1→6)糖苷鍵，從澱粉或相關的寡糖和多糖的非還原末端進一步水解釋放D葡萄糖。
利用α澱粉酶部分水解前體澱粉，因水解內部α-(1→4)連接而初步裂解澱粉分子。在商業應用中，所述初步水解用α澱粉酶在約105℃條件下進行。很高濃度的澱粉被加工，通常30％-40％為固體。所述初步水解在此高溫下通常進行5分鐘。然後將部分水解的澱粉轉入第二個罐子中，並且在85-90℃溫育大約1小時，得到葡萄糖當量(D.E.)為10-15。
在葡糖澱粉酶存在的條件下從澱粉或相關的寡糖和多糖的非還原末端進一步水解釋放D葡萄糖的步驟，一般在降低的溫度條件下，即在30℃到60℃之間，在單獨的罐子中進行。底物液體的溫度優選降至55-60℃之間。溶液的pH值範圍從6-6.5降到3-5.5之間。溶液的pH值優選4-4.5。將葡糖澱粉酶加入該溶液，並且反應24-72小時，優選36-48小時。
通過利用本發明的熱穩定性葡糖澱粉酶，可以在比傳統的批量糖化法更高的溫度下進行糖化。根據本發明，糖化可以在上述60-80℃的溫度範圍內進行，優選63-75℃。這對傳統的批量方法(見上述)和連續糖化法均適用。
事實上，包括一步或多步膜分離步驟(即過濾步驟)的連續糖化法必須在60℃以上的溫度條件下進行，以便能維持膜的很高流通量，或將微生物汙染降低到最低。因此本發明的熱穩定變體提供了在工業規模的糖化操作可接受的時間段之內，在合理的價格和/或更低的酶蛋白用量下進行大規模連續糖化操作的可能性。根據本發明，糖化時間甚至可縮短。
本發明的葡糖澱粉酶變體(例如AMG變體)通常在60-80℃時比傳統在30-60℃時的活性更高。因此通過升高葡糖澱粉酶的工作溫度，可使糖化在更短的時間內完成。
而且，通過改良熱穩定性，T1/2(在「材料和方法」章節中定義的半衰期)被改良。因為本發明的葡糖澱粉酶變體的熱穩定性被改良，在糖化期間僅需要加入較少量的葡糖澱粉酶來替代被滅活的葡糖澱粉酶。在根據本發明的糖化期間，更多的葡糖澱粉酶保持活性。而且，當在63℃以上糖化時，發生微生物汙染的危險性也降低了。
可用本發明葡糖澱粉酶變體進行的糖化方法有JP3-224493、JP1-191693、JP62-272987和EP 452238所述方法。
本發明的葡糖澱粉酶變體可以與僅水解含至少四個糖基的分子中α-(1→6)糖苷鍵的酶聯合用於本發明方法。本發明的葡糖澱粉酶變體優選與支鏈澱粉酶或異澱粉酶聯合應用。異澱粉酶和支鏈澱粉酶的脫支鏈應用、這些酶的分子特性、以及這些酶與葡糖澱粉酶聯合的潛在應用見G.M.A.vanBeynum等，澱粉轉化技術，Marcel Dekker，紐約，1985，101-142。
本發明另一方面涉及本發明葡糖澱粉酶變體在澱粉轉化過程中的應用。
此外，本發明的葡糖澱粉酶變體可以用於包括連續糖化步驟的連續澱粉轉化過程中。
本發明的葡糖澱粉酶變體還可以以固定化形式使用。這適合於並且經常用於生產專用(speciality)糖漿，例如麥芽糖糖漿，還可用於與果糖糖漿的生產有關的寡糖殘液流。
本發明的葡糖澱粉酶還可以用於作為燃料或飲料的酒精的生產過程中，或者可以用於生產檸檬酸、抗壞血酸、賴氨酸和穀氨酸等有機化合物的發酵過程中。
最後，本發明還涉及改良親本葡糖澱粉酶的熱穩定性的方法，其為在N末端產生延伸區。在一重要實施方案中，所述延伸區包括肽延伸區。
材料和方法材料酶AMGG1黑麴黴葡糖澱粉酶G1公開於Boel等，(1984)，EMBO J.3(5)，1079-1102，得自NovoNordisk。AMGG2截短的黑麴黴葡糖澱粉酶G1，見SEQ ID NO1中所示，得自Novo Nordisk。
宿主細胞米麴黴JaL125米麴黴IFO4177，得自發酵研究所，Osaka；17-25 JusoHammachi 2』-Chome Yodogawa-ku，Osaka，日本，通過一步基因置換方法(見G.May，「絲狀真菌的應用分子遺傳學」(1992)，p.1-25，J.R.Kinghorn和G.Tumer編；Blackie Academic and Professional)刪除了其命名為「alp」的鹼性蛋白酶基因(見Murakami K等，(1991)，農業生物化學.55，p.2807-2811)，利用米麴黴pryG基因作為標記物。JaL125菌株在WO97/35956(NovoNordisk)中被進一步公開。
微生物菌株釀酒酵母YNG318MATαleu2-Δ2 ura3-52 his4-539 pep4-Δ1[cir+]。
質粒pLaC103編碼截短的黑麴黴葡糖澱粉酶G2.pJSO026的質粒(釀酒表達質粒)(J.S.Okkels，(1996)「pYES載體中URA3-啟動子缺失可提高釀酒酵母中真菌脂肪酶的表達水平。重組DNA生物技術III生物和工程科學的結合，Annals of the New York Academy of Sciences的782卷」)。更具體而言，通過用釀酒酵母中組成型表達的TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子取代pYES2.0的誘導型GAL1啟動子(Albert和Karwasaki，(1982)，J Mol.Appl.Genet.，1，419-434)，並刪除URA3啟動子的一部分，可從pYES2.0衍生出表達質粒pJSO026。
方法釀酒酵母YNG318的轉化將DNA片段和打開的載體混合，並且通過標準方法將其轉入釀酒酵母YNG318中。
AGU活性的確定一個Novo澱粉葡萄糖苷酶單位(AGU)定義為在下述條件下每分鐘水解1微摩爾麥芽糖所需的酶量底物………………麥芽糖溫度……………………25℃pH……………………4.3(醋酸緩衝液)反應時間………………30分鐘可以索要分析方法(AF22)的詳細敘述。
米麴黴的轉化(常規方法)用米麴黴的孢子接種100ml YPD(Sherman等，(1981)，酵母遺傳學方法，冷泉港實驗室)，搖菌培養約24小時。通過miracloth過濾，收穫菌絲體，並且用200ml 0.6M MgSO4洗滌。將菌絲體重懸於15ml 1.2M MgSO4，10mMNaH2PO4，pH5.8。在冰上冷卻懸浮液，並加入1ml含120mg NovozymTM234的緩衝液。5分鐘之後，加入1ml 12mg/ml BSA(Sigma Type H25)，37℃輕微攪拌培養，連續1.5-2.5小時，直到在顯微鏡下觀察到樣品中有大量的原生質體。
通過miracloth過濾所述懸浮液，將過濾液轉到無菌的試管中，並且用5ml含0.6山梨醇、pH7.0的100mM Tris-HCl溶液覆蓋。1000g離心15分鐘，收集MgSO4層頂層的原生質體。向原生質體懸浮液中加入2倍體積的STC(1.2M山梨醇，pH7.5的10mM Tris-HCl、10mM CaCl2)，並將混合物1000g離心5分鐘。將原生質體沉澱重懸於3ml STC中，並再離心沉澱。重複此過程。最後，將原生質體重懸於0.2-1ml STC中。
用5-25μg溶於10μl STC的p3SR2(攜帶構巢麴黴amdS基因的質粒，見Hynes等，分子和細胞生物學，第3卷第8期，1430-1439，1983年8月)混合100μl原生質體懸浮液。將所述混合物在室溫下放置25分鐘，加入0.2ml含60％PEG 4000(BDH29576)、10mM CaCl2和pH7.5 10mM Tris-HCl的溶液，小心地進行混合(兩次)，最後加入0.85ml相同的溶液並小心地進行混合。將所述混合物在室溫下放置25分鐘，2500g離心15分鐘，並將沉澱重懸於2ml 1.2M山梨醇中。再一次沉澱之後，將原生質體塗於基本培養板，所述基本培養板含有1.0M蔗糖和作為氮源的pH7.0 10mM乙醯胺和用來抑制背景生長的20mM CsCl。在37℃培養4-7天後，挑出孢子，重懸於無菌水中，並塗布培養以形成單菌落。重複此過程，將第二次再分離之後的單菌落的孢子作為轉化體保存。
補料分批發酵在以麥芽糖糊精為碳源、以尿素為氮源並含有酵母提取物的培養基中進行補料分批發酵。通過將目的米麴黴宿主細胞的搖瓶培養物接種到含3.5％碳源和0.5％氮源的培養基中，進行所述補料分批發酵。在pH5.0和34℃條件下培養24小時之後，開始連續補充碳源和氮源。保持碳源作為限制因子，並保證存在過量的氧。所述補料分批培養持續4天，在這之後可以通過離心、超濾、clear filtration和過濾除菌回收所述的酶。通過在本領域中已知的陰離子交換層析法進行進一步純化。
純化過濾培養液並加入硫酸銨(AMS)至濃度1.7M，調節pH值至5。通過離心除去沉澱物質，將含有葡糖澱粉酶活性的溶液上樣於已用1.7M AMS、pH為5的20mM醋酸鈉預平衡的Toyo Pearl Butyl柱上。用平衡緩衝液洗去未結合的物質。利用1.7-0M AMS線性梯度溶液和pH4.5的10mM醋酸鈉以超過10倍柱體積洗脫結合的蛋白質。收集含葡糖澱粉酶的組分並對pH4.5的20mM醋酸鈉透析。
本發明變體的熱穩定性檢測用如下方法檢測本發明變體的熱穩定性將950微升50mM醋酸鈉緩衝液(pH4.3)(NaOAC)在70℃溫育5分鐘。加入50微升酶液(4AGU/ml)。分別在0、5、20和/或40分鐘時取出2×40微升樣品，並置於冰上冷凍。將在溫育前(0分鐘)測定的活性(AGU/ml)作為參考(100％)。計算百分率的下降對溫育時間的函數。
葡糖澱粉酶的T1/2(半衰期)通過在指定溫度(例如70℃)和pH4.5的條件下，在30％10 DE糊精麥芽糖中溫育所述葡糖澱粉酶(0.18-0.36AG/g DS)，測定T1/2。在設定的時間間隔點上收回樣品，並且在50℃進一步溫育24小時，以確保所有的底物均被水解，因為麥芽糖糊精可能影響活性檢測。在50℃溫育24小時不會顯著降低酶的活性。溫育之後，將所述樣品冷卻，並用pNPG法測定殘餘的酶活性(見下述)。
測定不同時間點上的殘餘酶活性的百分率。T1/2為相對活性降低到50％所需的時間。
殘餘酶活性(pNPG法)pNPG試劑將0.2g pNPG(對硝基苯葡萄糖吡喃糖苷)溶於0.1M醋酸緩衝液(pH4.3)中，終體積為100ml。
硼酸鹽緩衝液將3.8g Na2B4O7.10H2O溶於Milli-Q水中，終體積為100ml。
AMG標準品已知含0.04AGU/ml酶的水溶液。
在分析前可以將樣品稀釋(用水1∶1-1∶2稀釋)。製備下述溶液HS0.5ml樣品+1ml AMG標準品+3ml pNPG試劑
H0.5ml樣品+1ml水+3mlpNPG試劑B0.5ml樣品+1ml AMG標準品+3ml pNPG試劑將HS和H置於50℃水浴。2小時之後，每個小瓶中加入3ml硼酸鹽緩衝液。將B置於室溫下並在2小時後加入3ml pNPG試劑。在400nm測定所有上述三種溶液的光密度，用下述公式計算活性活性＝2*AGUst*(H-B)/(HS-H)其中HS、H和B是所分析的溶液的OD值，AGU。是所用AMG標準品的活性。
pAMGY的構建按如下方法構建pAMGY載體用PCR擴增的AMG基因替代pJSO026上的脂肪酶基因，所述PCR中正向引物為FG25』-CAT CCC CAG GATCCT TAC TCA GCA ATG-3』；反向引物為RG25』-CTC AAA CGA CTCACC AGC CTC TAG AGT-3』，所用的模板為含AMG基因的質粒pLAC103。將pJSO026用XbaI和SmaI37℃消化2小時，並且用Klenow片段鈍化PCR擴增片段的末端，然後用XbaI消化。連接所述載體片段和PCR擴增片段，並用電轉化法將其轉化入大腸桿菌中。將所得載體命名為pAMGY。
表達質粒pJSO37見WO97/04079和WO97/07205中所述。通過用釀酒酵母的組成型表達的TPI(丙糖磷酸異構酶)啟動子(Albert和Karwasaki，(1982)，J.Mol.Appl.Genet.，1，419-434)置換pYES2.0的誘導型GAL1啟動子，並且刪除URA3啟動子的一部分，便可從pYES2.0得到pJSO37。
pLaC103的構建用黑麴黴AMGII cDNA克隆(Boel等，(1984)，出處同上)作為構建pLaC103的來源，所述pLaC103用於在釀酒酵母中表達AMG的GII形式。
構建分幾步驟進行，概括如下。
用XbaI切割pT7-212(EP37856/美國專利5162498)，用KlenowDNA聚合酶和dNTP鈍化末端。在用EcoRI切割之後，所得載體片段經瓊脂糖凝膠電泳純化，並與pBoe153的2.05kb EcoRJ-EcoRV片段連接，因此在所得質粒pG2x中，在AMG編碼片段的EcoRV末端重新生成了XbaI位點。
為了除去AMG cds的上遊DNA，並使AMG編碼DNA攜帶一個適當的限制性內切酶識別位點，製備下述構建體分離p53的930bp EcoRJ-PstI片段，用AluI切割，將所得771bp的Alu-PstI片段與末端鈍化的EcoRI位點(見上)連接至pBR322，並用PstI切割。在所得質粒pBR-AMG』中，在離AMG cds的起始密碼子僅34bp處重新生成EcoRI位點。
從pBR-AMG中分離775bp的EcoRI-PstI片段，並與pG2x的1151bpPstI-XbaI片段，及pT7-212的XbaI-EcoRI載體片段進行連接。
將所得質粒pT7GII在鹼性磷酸酶存在的條件下用BamHI切割，隨後在滅活磷酸酶之後用SphI部分切割。從該反應中得到2489bp的SphI-BamI片段，其包括與AMGII cds連接的S.c.TPI啟動子。
將上述片段、pT7GII的1052pb BamHI片段、以及pMT743(EP37856/US5162498)中用鹼性磷酸酶處理的SphI-BamHI載體片段進行連接。所得質粒是pLaC103。
篩選熱穩定性葡糖澱粉酶變體在下述熱穩定性濾膜試驗中篩選文庫。
熱穩定性濾膜試驗將酵母文庫鋪於含100μg/ml氨苄青黴素的SC ura-瓊脂平板上的醋酸纖維素濾膜(OE67，SchleicherSchuell，Dassel，德國)上，30℃溫育至少72小時。將菌落複製在硝酸纖維素濾膜(Protran-Ba 85，SchleicherSchuell，Dassel，德國)上，室溫溫育1小時。用自來水從Protran濾膜上洗下菌落。為了在篩選之後能夠在濾膜上定位陽性變體，在溫育之前將每個濾膜用針做特殊的標記。將結合了變體的Protran濾膜轉移入含pH4.5的0.1M NaAC的容器中，並且在55-75℃溫育15分鐘。SC ura-瓊脂平板上的所述醋酸纖維素濾膜在室溫下存放備用。在溫育之後，在含5％麥芽糖、1％瓊脂糖、pH4.5的50mM NaAC的平板中檢測殘餘酶活性。用與標記醋酸纖維素濾膜相同的方法標記帶有Protran濾膜的試驗板，並於50℃溫育2小時。在去掉Protran濾膜後，用葡萄糖GOD perid(Boehringer Mannheim GmbH，德國)染色試驗板。具有殘餘活性的變體在試驗板上為白色背景上的暗綠色斑點。在儲存板上定位改良的變體。用與第一次篩選相同的條件再對改良的變體篩選2次。
利用DOPE程序進行隨機誘變的常規方法用下述步驟進行隨機誘變1.在親本酶中選擇用於修飾的目的區域，2.在所選區域中確定突變位點和非突變位點，
3.根據諸如所需穩定性和/或待構建的變體的功能，確定進行哪一種突變，4.選擇結構上合理的突變，5.根據步驟4調整步驟3中所選殘基，6.利用適當的摻入算法分析核苷酸分布，7.必要時，使所需殘基符合遺傳密碼真實性，例如考慮來自遺傳密碼的限制以避免引入終止密碼子；技術人員應該知道在實踐中一些密碼子組合不能應用，其需要調整，8.合成引物，9.用所述引物進行隨機誘變，10.通過篩選所要改良的特性，篩選得到葡糖澱粉酶變體。
摻入算法用於步驟6的適當的摻入算法在本領域眾所周知。這類算法之一如Tomandl D.等，1997，Journal of Computer-Aided Mo1ecular Design 1129-38中所述。另一個算法是DOPE (Jensen LJ，Andersen KV，Svendsen A和Kretzschmar T，(1998)，核酸研究26697-702)。
實施例實施例1構建具有N末端延伸區的葡糖澱粉酶變體隨機誘變通過重疊延伸法(Horton等，基因，77(1989)，61-68頁)製備PCR-文庫片段，所用引物包括寡核苷酸AM11-18(可在KexII位點後、成熟蛋白、前插入1-7個額外的胺基酸)，引物AM18，以及下述2種引物，它們對應於編碼區5』和3』外側約75bp處的序列(5』端為42445』-TCA AGA ATA GTTCAA ACA AGA AGA-3』，3』端為KB145』-CTT TTC GGT TAG AGCGGA TG-3』)。
PCR反應進行如下PCR反應14244作為5』引物，AM18作為3』引物。
PCR反應2AM11為5』引物，KB14為3』引物(7個額外胺基酸)。
PCR反應3AM12為5』引物，KB14為3』引物(6個額外胺基酸)。
PCR反應4AM13為5』引物，KB14為3』引物(5個額外胺基酸)。
PCR反應5AM14為5』引物，KB14為3』引物(4個額外胺基酸)。
PCR反應6AM15為5』引物，KB14為3』引物(3個額外胺基酸)。
PCR反應7AM16為5』引物，KB14為3』引物(2個額外胺基酸)。
PCR反應8AM17為5』引物，KB14為3』引物(1個額外胺基酸)。
第一個反應的模板pAMGY；反應2-8的模板pAMGY或克隆於相同載體的經改良的變體。
PCR反應9-15來自PCR反應1的DNA和來自PCR反應2-8的任一DNA為模板，用4244為5』引物，KB14為3』引物，進行PCR反應。將這些最終得到的PCR片段與經限制性內切酶SamI(或BamHI)和XbaI切割的pJSO026(除去編碼區，同時在每個末端產生一個75bp的重疊區，使得重組成為可能)一起用於酵母體內重組。AMll5′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS NNSGCG ACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO2)AM125′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS NNS GCGACC TTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO3)AM135′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS NNS GCG ACCTTG GAT TCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO4)AM145′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS NNS GCG ACC TTGGAT TCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO5)AM155′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS NNS GCG ACC TTG GATTCA TGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO6)AM165′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS NNS GCG ACC TTG GAT TCATGG TTG AGC-3′(SEQ ID NO7)AM175′-GCA AAT GTG ATT TCC AAG CGC NNS GCG ACC TTG GAT TCA TGGTTG AGC-3′(SEQ ID NO8)AM185′-GCG CTT GGA AAT CAC ATT TGC-3′(SEQ ID NO9)42445′-TCA AGA ATA GTT CAA ACA AGA AGA-3′(SEQ ID NO10)KB145′- CTT TTC GGT TAG AGC GGA TG-3′(SEQ ID NO11)
實施例2通過改變KexII識別位點而引入N末端延伸區通過除去或改變成熟蛋白前面的KexII識別位點「KR」，可以引入N末端延伸區。然後可引入6個胺基酸的延伸區作為由6個胺基酸組成的原序列。在酵母中，KR是KexII的最佳識別位點。將其改變為RR將降低被切割的分子的百分率(Bevan A，Brenner C和Fuller RS，1998，PNAS 95(18)10384-10389)。或者在KR前引入P也將降低被切割的分子的百分率。
將原序列由NVISKR變為NVISRR或NVIPKR，並給出約50％的具有NVISRR或NVIPKR延伸區的AMG分子和50％正常加工的成熟AMG分子。
實施例3構建含半胱氨酸轎的葡糖澱粉酶(AMG2)變體本發明的葡糖澱粉酶變體包括如下的突變A479C或T480C或P481C或A471C或S431C或S8C或E299C或D375C以及肽延伸區ACPPSTS和ASPPSTS。親本葡糖澱粉酶(AMG2)包括如下的突變A479C或T480C或P481C或A471C或S431C或S8C或E299C或D375C。
半胱氨酸橋構建如下定點誘變為了構建AMG G2酶的變體(SEQ ID NO11)，按說明書使用Chameleon雙鏈定點誘變試劑盒。
編碼所述AMG G2酶的基因位於pENI1542上，該質粒通過用BamHI/XhoI切割質粒pIVI9(切除鬼傘過氧化物酶基因)，並克隆至含有AMG G2的pcr片段(用BglII/SalI切割)而得到，所述PCR的模板為pLaC103(含G2cDNA)，2個引物為引物139123(CGCACGAGATCTGCAATGTCGTTCCGATCTCTA)(SEQ ID NO12)和引物139124(CAGCCGGTCGACTCACAGTGACATACCAGAGCG)(SEQ ID NO13)。通過DNA測序證實其為所述變體。根據說明書，可用下述引物將pNEI1542的氨苄青黴素基因的ScaI位點變為MluI位點72585』pgaatga ctt ggt tga cgc gtc acc agt cac3』(SEQ ID NO14)。(這樣改變了在氨苄青黴素抗性基因中發現的ScaI位點並且用於MluI位點的切割)。然後將含所述AMG基因的pENI1542載體作為DNA聚合酶和寡核苷酸7258(SEQ ID NO14)和21401(SEQID NO15)的模板。引物21401(SEQID NO15)作為選擇引物。214015』p gg gga tca tga tag gac tag cca tat taa tgaagg gca tat acc acg cct tgg acc tgc ggt ata gcc3』(SEQ ID NO15)。
通過加入含所需突變的適當的寡核苷酸，將半胱氨酸殘基引入目的AMG基因中，所述寡核苷酸如下誘變寡核苷酸ACPPSTS 137767(SEQ ID NO16)(5′P-GTGATTTCCAGCGGTGCCCGCCGTCCACGTCCGCGACCTTGGATTCATGG3′)ASPPSTS 137766(SEQ ID NO17)(5′P-GTGATTTCCAGCGGTCCCCGCCGTCCACGTCCGCGACCTTGGATTCATGG3′)D375C 137765(SEQ ID NO18)(5′P-GTAGCATTGTATGTGCCGTGAAGAC3′)S431C 146826(SEQ ID NO19)(5′P-ACCGTCGTAACTGCGTCGTGCCTGC3′)E299C 146828(SEQ ID NO20)(5′P-GTCTCAGTGACAGCTGCGCTGTTGCGGTG3′)A479C 146829(SEQ ID NO21)(5′P-CCACTACGACGTGCACCCCCACTGG3′)T480C 146830(SEQ ID NO22)(5′P-CTACGACGGCTTGCCCCACTGGATCC3′)P481C 146831(SEQ ID NO23)(5′P-CGACGGCTACCTGCACTGGATCCGGC3′)S8C 146827(SEQ ID NO24)(5′P-TGGATTCATGGTTGTGTAACGAAGCGACC3′)產生的突變體ACPPSTS，D375CACPPSTS，S431CACPPSTS，E299CACPPSTS，A479C
ACPPSTS，T480CACPPSTS，P481CASPPSTSS8C＋A479CS8C＋T480CS8C＋P481C通過測定整個基因的序列，證實所述突變。按在上面「材料和方法」章節中所述方法，將所述質粒轉化至米麴黴。按在上面「材料和方法」章節中所述方法，發酵並純化所述變體。
篩選按上文「材料和方法」章節中所述熱穩定性濾膜試驗篩選該文庫。
實施例4熱穩定性增加的葡糖澱粉酶變體用上文方法章節中的方法，在pH4.5，70℃的條件下測定熱穩定活性。
70℃，pH4.5的熱穩定性酶 殘餘活性(％)5min 20min 40minAMGG2(wt) 7121 2NVIPKR 8531 8PLALSD 7326 8結果表明，可通過在本發明葡糖澱粉酶的N末端連接一個延伸區而增強熱穩定性。
實施例5熱穩定性增強了的葡糖澱粉酶變體按上文方法章節中所述，於pH4.5，68℃在粗製樣品中測定酵母所表達的改良變體的熱穩定活性。
68℃，pH4.5的熱穩定性酶 殘餘活性(％)5min20min 40minAMGG2(wt) 57 29 16ISN 65 39 28
MN65 39 28MPGRLP56 34 23IFELTPR 55 38 22LGPD 62 28 23LGVTGE55 32 22AGPLTPR 50 33 22PCSAGE57 26 21PLASD 67 47 36NVIPKR57 35 23實施例6熱穩定性增強了的葡糖澱粉酶變體按上文方法章節中所述，於pH4.5，70℃在粗製樣品中測定黑麴黴所表達的改良變體的熱穩定活性。
變體ACPPSTS＋E299C的N末端分析表明，在該變體的N末端不存在游離或氧化的半胱氨酸，表明在該N末端半胱氨酸和299位上的半胱氨酸之間已經形成了-SS-鍵。
序列表(1)一般信息(i)申請者(A)名稱NOVO NORDISK A/S(B)街道NOVOAllé(C)城市DK-2880 Bagsvaerd(D)國家丹麥(E)郵編DK-2880(F)電話+45 4444 8888(G)傳真+45 4449 3256(ii)發明題目葡糖澱粉酶變體(ii)序列數量35(iv)計算機可讀形式(A) 介質類型軟盤(B) 計算機IBM PC兼容機(C) 作業系統PC-DOS/MS-DOS(D) 軟體PatentIn Release#1.0，version#1.25(EPO)(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特點(A)長度534個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型蛋白質(iii)生物黑麴黴(xi)序列描述SEQ IN NO1Met Ser Phe Arg Ser Leu Leu Ala Leu Ser Gly Leu Val Cys Thr Gly-24 -20 -15 -10Leu Ala Asn Val Ile Ser Lys Arg Ala Thr Leu Asp Ser Trp Leu Ser-51 5Asn Glu Ala Thr Val Ala Arg Thr Ala Ile Leu Asn Asn Ile Gly Ala10 15 20Asp Gly Ala Trp Val Ser Gly Ala Asp Ser Gly Ile Val Val Ala Ser25 30 35 40Pro Ser Thr Asp Asn Pro Asp Tyr phe Tyr Thr Trp Thr Arg Asp Ser45 50 55Gly Leu Val Leu Lys Thr Leu val Asp Leu Phe Arg Asn Gly Asp Thr60 65 70Ser Leu Leu Ser Thr Ile Glu Asn Tyr Ile Ser Ala Gln Ala Ile Val75 80 85Gln Gly Ile Ser Asn Pro Ser Gly Asp Leu Ser Ser Gly Ala Gly Leu90 95 100Gly Glu Pro Lys Phe Asn Val Asp Glu Thr Ala Tyr Thr Gly Ser Trp105 110 115 120Gly Arg Pro Gln Arg Asp Gly Pro Ala Leu Arg Ala Thr Ala Met Ile125 130 135Gly Phe Gly Gln Trp Leu Leu Asp Asn Gly Tyr Thr Ser Thr Ala Thr140 145 150Asp Ile Val Trp Pro Leu Val Arg Asn Asp Leu Ser Tyr Val Ala Gln155 160 165Tyr Trp Asn Gln Thr Gly Tyr Asp Leu Trp Glu Glu Val Asn Gly Ser170 175 180Ser Phe Phe Thr Ile Ala Val Gln His Arg Ala Leu Val Glu Gly Ser185 190 195 200Ala Phe Ala Thr Ala Val Gly Ser Ser Cys Ser Trp Cys Asp Ser Gln205 210 215Ala Pro Glu Ile Leu Cys Tyr Leu Gln Ser Phe Trp Thr Gly Ser Phe220 225 230Ile Leu Ala Asn Phe Asp Ser Ser Arg Ser Gly Lys Asp Ala Asn Thr235 240 245Leu Leu Gly Ser Ile His Thr Phe Asp Pro Glu Ala Ala Cys Asp Asp250 255 260Ser Thr Phe Gln Pro Cys Ser Pro Arg Ala Leu Ala Asn His Lys Glu265 270 275 280Val Val Asp Ser Phe Arg Ser Ile Tyr Thr Leu Asn Asp Gly Leu Ser285 290 295Asp Ser Glu Ala Val Ala Val Gly Arg Tyr Pro Glu Asp Thr Tyr Tyr300 305 310Asn Gly Asn Pro Trp Phe Leu Cys Thr Leu Ala Ala Ala Glu Gln Leu315 320 325Tyr Asp Ala Leu Tyr Gln Trp Asp Lys Gln Gly Ser Leu Glu Val Thr330 335 340Asp Val Ser Leu Asp Phe Phe Lys Ala Leu Tyr Ser Asp Ala Ala Thr345 350 355 360Gly Thr Tyr Ser Ser Ser Ser Ser Thr Tyr Ser Ser Ile Val Asp Ala365 370 375Val Lys Thr Phe Ala Asp Gly Phe Val Ser Ile Val Glu Thr His Ala380 385 390Ala Ser Asn Gly Ser Met Ser Glu Gln Tyr Asp Lys Ser Asp Gly Glu395 400 405Gln Leu Ser Ala Arg Asp Leu Thr Trp Ser Tyr Ala Ala Leu Leu Thr410 415 420Ala Asn Asn Arg Arg Asn Ser Val Val Pro Ala Ser Trp Gly Glu Thr425 430 435 440Ser Ala Ser Ser Val Pro Gly Thr Cys Ala Ala Thr Ser Ala Ile Gly445 450 455Thr Tyr Ser Ser Val Thr Val Thr Ser Trp Pro Ser Ile Val Ala Thr460 465 470Gly Gly Thr Thr Thr Thr Ala Thr Pro Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr475 480 485Ser Thr Ser Lys Thr Thr Ala Thr Ala Ser Lys Thr Ser Thr Thr Thr490 495 500Arg Ser Gly Met Ser Leu505 510(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特點(A)長度66個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「AA11」(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)位置22-42(D)其它信息/注釋N＝A、C、G或TS＝G或C(xi)序列描述SEQ ID NO2GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS NNSNNSNNSN NSGcGACCTT GGATTCATGG TTGAGC 66(2)SEQ ID NO3的信息(i)序列特點(A)長度63個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisG-特徵(B)其它信息/desc＝「AA12」(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)位置22-39(D)其它信息/注釋N＝A、C、G或TS＝G或C(xi)序列描述SEQ ID NO3GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS NNSNNSNNSG CGACCTTGGA TTCATGG TTG AGC 63(2)SEQ ID NO4的信息(i)序列特點(A)長度60個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「AA13」(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)位置22-36(D)其它信息/注釋N＝A、C、G或TS＝G或C(xi)序列描述SEQ ID NO4GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS NNSNNSGCGA CCTTGGATTC ATGGTTGAGC60(2)SEQ ID NO5的信息(i)序列特點(A)長度66個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「AA14」(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)位置22-33(D)其它信息/注釋N＝A、C、G或TS＝G或C(xi)序列描述SEQ ID NO5GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS NNSGCGACCT TGGATTCATGG TTGAGC 66(2)SEQ ID NO6的信息(i)序列特點(A)長度54個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「AA15」(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)位置22-30(D)其它信息/注N＝A、C、G或TS＝G或C(xi)序列描述SEQ ID NO6GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSNNS GCGACCTTGG ATTCATGGTT GAGC 54(2)SEQ ID NO7的信息(i)序列特點(A)長度51個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「AA16」(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)位置22-27(D)其它信息/注N＝A、C、G或TS＝G或C(xi)序列描述SEQ ID NO7GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSNNSGCG ACCTTGGATT CATGGTTGAG C 51(2)SEQ ID NO8的信息(i)序列特點(A)長度48個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「AA17」(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)位置22-24(D)其它信息/注N＝A、C、G或TS＝G或C(xi)序列描述SEQ ID NO8GCAAATGTGA TTTCCAAGCG CNNSGCGACC TTGGATTCAT GGTTGAGC 48(2)SEQ ID NO9的信息(i)序列特點(A)長度21個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「AA18」(xi)序列描述SEQ ID NO9GCGCTTGGAA ATCACATTTG C 21(2)SEQ ID NO10的信息(i)序列特點(A)長度24個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「4244」(xi)序列描述SEQ ID NO10TCAAGAATAG TTCAAACAAG AAGA 24(2)SEQ ID NO11的信息(i)序列特點(A)長度20個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「KB14」(xi)序列描述SEQ ID NO11CTTTTCGGTT AGAGCGGATG20(2)SEQ ID NO12的信息(i)序列特點(A)長度33個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「引物139123」(xi)序列描述SEQ ID NO12CGCACGAGAT CTGCAATGTC GTTCCGATCT CTA 33(2)SEQ ID NO13的信息(i)序列特點(A)長度23個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「引物139124」(xi)序列描述SEQ ID NO13CAGCCGGTCG ACTCACAGTG ACATACCAGA GCG 23(2)SEQ ID NO14的信息(i)序列特點(A)長度27個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「7258」(xi)序列描述SEQ ID NO14gaatgacttggtt gacgcgtcac cagtcac 27(2)SEQ ID NO15的信息(i)序列特點(A)長度68個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「21401」(xi)序列描述SEQ ID NO15ggggatcatg ataggactag ccatattaatgaagggcatataccacgcct tggacctgcg ttatagcc 68(2)SEQ ID NO16的信息(i)序列特點(A)長度50個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「ACPPSTS 137767」(xi)序列描述SEQ ID NO16GTGATTTCCA GCGGTGCCCG CCGTCCACGT CCGCGACCTT GGATTCATGG 50(2)SEQ ID NO17的信息(i)序列特點(A)長度50個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「ASPPSTS137766」(xi)序列描述SEQ ID NO17GTGATTTCCA GCGGTCCCCG CCGTCCACGT CCGCGACCTT GGATTCATGG50(2)SEQ ID NO18的信息(i)序列特點(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「D375C137765」(xi)序列描述SEQ ID NO18GTAGCATTGT ATGTGCCGTG AAGAC 25(2)SEQ ID NO19的信息(i)序列特點(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「S431C 146826」(xi)序列描述SEQ ID NO19ACCGTCGTAA CTGCGTCGTG CCTGC 25(2)SEQ ID NO20的信息(i)序列特點(A)長度39個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「E299C146828」(xi)序列描述SEQ ID NO20GTCTCAGTGA CAGCTGCGCT GTTGCGGTG39(2)SEQ ID NO21的信息(i)序列特點(A)長度25個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「A479C 146829」(xi)序列描述SEQ ID NO21CCACTACGAC GTGCACCCCC ACTGG 25(2)SEQ ID NO22的信息(i)序列特點(A)長度26個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「T480C 146830」(xi)序列描述SEQ ID NO22CTACGACGGC TTGCCCCACT GGATCC 26(2)SEQ ID NO23的信息(i)序列特點(A)長度26個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「P481C146831」(xi)序列描述SEQ ID NO23CGACGGCTAC CTGCACTGGA TCCGGC 26(2)SEQ ID NO24的信息(i)序列特點(A)長度29個鹼基對(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓樸構型線性(ii)分子類型合成序列(ix)特點(A)NAME/KEYmisc-特徵(B)其它信息/desc＝「S8C146827」(xi)序列描述SEQ ID NO24TGGATTCATG GTTGTGTAAC GAAGCGACC 29(2)SEQ ID NO25的信息(i)序列特點(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO25ACGPSTS 7(2)SEQ ID NO26的信息(i)序列特點(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO26ACPGTST 7(2)SEQ ID NO27的信息(i)序列特點(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO27ACGTGTS7(2)SEQ ID NO28的信息(i)序列特點(A)長度7個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO28ACTGSTG7(2)SEQ ID NO29的信息(i)序列特點(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO29ACGPSTSG 8(2)SEQ ID NO30的信息(i)序列特點(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO30ACPGTSTG 8(2)SEQ ID NO31的信息(i)序列特點(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO31ACGTGTSS 8(2)SEQ ID NO32的信息(i)序列特點(A)長度8個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO32ACTGSTGT 8(2)SEQ ID NO33的信息(i)序列特點(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO33NVIPPR 6(2)SEQ ID NO34的信息(i)序列特點(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO34NPPIRP 6(2)SEQ ID NO35的信息(i)序列特點(A)長度6個胺基酸(B)類型胺基酸(D)拓樸構型線性(ii)分子類型肽延伸區(xi)序列描述SEQ ID NO35NVIPRP 權利要求
1.在N末端具有肽延伸區的親本葡糖澱粉酶的變體。
2.權利要求1的變體，其中所述肽延伸區連接在N末端。
3.權利要求1或2的變體，其中所述肽延伸區含一個半胱氨酸殘基。
4.權利要求1-3中何一項的變體，其中所述肽延伸區具有下述通式x-C-(x)n其中x各代表一個胺基酸。
5.權利要求4的變體，其中所述x為一種非α螺旋標記。
6.權利要求5的變體，其中肽延伸區包括選自M、K、H、V、I、Y、C、F、T、G、N、P、S或D殘基的非α螺旋標記。
7.權利要求1-5中任何一項的變體，其中肽延伸區的長度包括1-100個胺基酸殘基，優選1-50個胺基酸殘基，更優選1-20個胺基酸殘基，甚至更優選1-10個胺基酸殘基。
8.權利要求1-7中任何一項的變體，其中所述肽延伸區能夠與親本葡糖澱粉酶的成熟部分形成共價連接。
9.權利要求1-8中任一項的變體，所述變體在所述肽延伸區中包括一個或更多的半胱氨酸殘基，並且在所述親本葡糖澱粉酶的成熟部分中包括一個半胱氨酸殘基，該殘基以使所述半胱氨酸殘基可以共同形成半胱氨酸橋的方式存在。
10.權利要求1-9中任何一項的變體，其中所述肽延伸區能夠阻止三肽氨肽酶對葡糖澱粉酶的切割。
11.權利要求1-10中任何一項的變體，其中親本同源性葡糖澱粉酶包括來自微生物的葡糖澱粉酶。
12.權利要求11的變體，其中所述微生物包括真細菌、古細菌、真菌、藻類和原生動物。
13.權利要求12的變體，其中親本同源性葡糖澱粉酶來自絲狀真菌。
14.權利要求1-13中任何一項的變體，其中親本同源性葡糖澱粉酶是黑麴黴G1或G2葡糖澱粉酶。
15.權利要求1-14中任何一項的變體，其中肽延伸區包括下述肽延伸區之一Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg(NVISRR)，或Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg(NVIPKR)，或Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ASPPSTS)，或Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ACPPSTS)，或Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu(PCSAGE)，或Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp(PLALSD)，或Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu(LGVTGE)，或Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu(AGPLPSE)，或Leu-Gly-Pro-Asp(LGPD)，或Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg(IFELTPR)，或Ile-Ser-Asn(ISN)，或Met-Asn(MN)。
16.權利要求3-15中任何一項的變體，其中親本葡糖澱粉酶成熟部分中的半胱氨酸殘基被插入，或其替代了親本葡糖澱粉酶的一個胺基酸殘基。
17.權利要求1-16中任一項的變體，其中用半胱氨酸殘基取代了黑麴黴G1葡糖澱粉酶胺基酸序列中375位的天冬氨酸殘基、或299位的穀氨酸殘基、或431位的絲氨酸殘基、或471位的丙氨酸殘基、或479位的丙氨酸殘基、或480位的蘇氨酸、或481位的脯氨酸殘基、或8位的絲氨酸殘基。
18.權利要求1-17中任何一項的變體，其中所述變體與親本葡糖澱粉酶相比具有改良的熱穩定性。
19.編碼權利要求1-18中任何一項的葡糖澱粉酶變體的DNA序列。
20.包括編碼權利要求1-18中任何一項的葡糖澱粉酶變體之DNA序列的DNA構建體。
21.攜帶權利要求20的DNA構建體的重組表達載體。
22.用權利要求11的DNA構建體或權利要求21的載體轉化的細胞。
23.權利要求22的細胞，所述細胞是微生物，例如細菌或真菌。
24.權利要求23的細胞，所述細胞是蛋白酶缺陷的米麴黴或黑麴黴。
25.用於將澱粉或部分水解的澱粉轉化成含葡萄糖的糖漿的方法，所述方法包括在權利要求1-18中任一項的葡糖澱粉酶變體存在的條件下，糖化澱粉水解產物的步驟。
26.權利要求25的方法，其中所述葡糖澱粉酶變體被用於生產作為燃料或飲料的乙醇的方法中。
27.權利要求25的方法，其中所述葡糖澱粉酶變體被用於生產飲料的方法中。
28.權利要求25的方法，其中所述葡糖澱粉酶變體被用於生產檸檬酸、抗壞血酸、賴氨酸和穀氨酸等有機化合物的發酵方法中。
29.通過在N末端產生延伸區，改良親本葡糖澱粉酶熱穩定性的方法。
30.權利要求29的方法，其中所述延伸區包括肽延伸區。
31.權利要求30的方法，其中所述肽延伸區包括非螺旋標記，優選M、K、H、V、I、Y、C、F、T、G、N、P、S或D殘基。
32.權利要求29-31的方法，其中所述肽延伸區的長度包括1-100個胺基酸殘基，優選1-50個胺基酸殘基、更優選1-20個胺基酸殘基，甚至更優選1-10個胺基酸殘基。
33.權利要求29-32的方法，其中所述肽延伸區能夠與親本葡糖澱粉酶的成熟部分形成共價連接。
34.權利要求29-33的方法，該方法包括在所述肽延伸區中含一個半胱氨酸殘基，並且在所述親本葡糖澱粉酶的成熟部分中含一個半胱氨酸，其以使所述半胱氨酸殘基可以共同形成半胱氨酸橋的方式存在。
35.權利要求29-34的方法，其中所述肽延伸區包括下述肽延伸區Asn-Val-Ile-Ser-Arg-Arg(NVISRR)，或Asn-Val-Ile-Pro-Lys-Arg(NVIPKR)，或Ala-Ser-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ASPPSTS)，或Ala-Cys-Pro-Pro-Ser-Thr-Ser(ACPPSTS)，或Pro-Cys-Ser-Ala-Gly-Glu(PCSAGE)，或Pro-Leu-Ala-Leu-Ser-Asp(PLALSD)，或Leu-Gly-Val-Thr-Gly-Glu(LGVTGE)，或Ala-Gly-Pro-Leu-Pro-Ser-Glu(AGPLPSE)，或Leu-Gly-Pro-Asp(LGPD)，或Ile-Phe-Glu-Leu-Thr-Pro-Arg(IFELTPR)，或Ile-Ser-Asn(ISN)，或Met-Asn(MN)。
36.權利要求29-34中任何一項的方法，其中親本葡糖澱粉酶成熟部分中的半胱氨酸殘基被插入，或其替代了親本葡糖澱粉酶的一個胺基酸殘基。
37.權利要求29-35中任何一項的變體，其中用半胱氨酸殘基替代了黑麴黴G1葡糖澱粉酶的胺基酸序列中375位上的天冬氨酸殘基、或299位上的穀氨酸殘基、或431位上的絲氨酸殘基、或471位上的丙氨酸殘基、或479位上的丙氨酸殘基、或480位上的蘇氨酸、或481位上的脯氨酸殘基、或8位上的絲氨酸殘基。
38.權利要求29-36中任何一項的方法，其中所述肽延伸區能夠阻止三肽氨肽酶對葡糖澱粉酶的切割。
全文摘要
本發明涉及親本真菌葡糖澱粉酶的變體,其具有改良的熱穩定性。
文檔編號C07K19/00GK1329665SQ99814205
公開日2002年1月2日 申請日期1999年12月7日 優先權日1998年12月7日
發明者比賈恩·R·尼爾森, 阿倫·斯文德森, 柯爾斯滕·博傑森, 傑斯珀·文德, 亨裡克·佩德森 申請人:諾維信公司