姜酚肟及其合成與應用的製作方法
2024-03-03 12:54:15
專利名稱：姜酚肟及其合成與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於天然產物的製取、改性與應用領域，具體地說是利用生薑中提取的粗姜酚或純姜酚，通過肟化反應製取姜酚肟，並測定姜酚肟的抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、殺蟲等生物活性。
背景技術：
20世紀80年代，國外的藥理試驗已經證實，自生薑中分離出的、或者是化學合成的粗姜酚能刺激黏膜，促進胃液分泌，在腸道中能抑制異常發酵，促進氣體排放，對大腦皮質和血管運動中樞有興奮作用，能增進血液循環。最新的藥理實驗和臨床觀察證實姜酚有強心、降血脂、防治心血管疾病、抗氧化、抗衰老、抗腫瘤、止嘔、止暈、抑制前列腺素合成、防腐殺蟲、驅蟲、護膚美容等多方面的生物活性。
然而，自生薑中獲得的天然粗姜酚穩定性差、難以分離純化，不易獲得，不便保存；另外，目前也沒有工業化化學合成姜酚的報導。總之，由於沒有可供工業使用的姜酚，目前無法獲得大量的姜酚用以開發以姜酚為原料的食品、保健食品、藥品、化妝品、綠色農藥等等。因此，為充分利用、開發姜酚的生物活性，並解決目前無姜酚可供利用的實際困難，開發出化學結構、生物活性、功能性質等與姜酚相似的姜酚衍生物，如姜酚肟等以代替姜酚，可以取得巨大經濟效益和社會效益。
發明內容
本發明的目的在於提供一種姜酚衍生物——姜酚肟，可以取代目前天然提取的姜酚，開發出類似於姜酚生物活性的藥品、食品、農藥、試劑標樣等產品。
本發明所述的姜酚肟，是將姜酚粗提物或純姜酚通過肟化反應得到的姜酚衍生物，具有如下的通式結構
其中n＝4，為6-姜酚肟；n＝6，為8-姜酚肟；n＝8，為10-姜酚肟；n＝10，為12-姜酚肟。
本發明提供了姜酚肟的合成方法，以及其應用。
本發明以鮮姜或生薑半成品(如乾薑、姜油樹脂等)為原料，獲得粗姜酚，或者利用純姜酚，再通過肟化反應、分離純化獲得結晶狀態的姜酚肟，並測定其抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、殺蟲等生物活性，從而使姜酚肟應用於上述領域。
本發明所述的姜酚肟的合成方法，其特徵在於，包括以下步驟A)肟化反應以姜酚粗提物或提純的姜酚為原料，加入摩爾數1～3倍於姜酚的鹽酸羥胺，在0～100℃、pH為3.5～5.5的條件下，進行肟化反應，反應時間1～3小時，反應使用的溶劑選自10～100％的甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯中的一種；B)製取粗姜酚肟將肟化反應液濃縮至原體積的10～50％，用有機溶劑萃取2～3次；所獲有機溶液相先後經過酸洗、鹽洗、水洗，重複該過程1～3次；再回收溶劑，得粗姜酚肟；所述的有機溶劑選自乙醚、乙酸乙酯、正己烷；C)姜酚肟的粗分用吸附劑作為固定相進行色譜分離，洗脫液經濃縮回收得粗姜酚肟；步驟C中，所述的吸附劑為矽膠，矽膠色譜分離時，收取正己烷與乙醚體積比為1∶0.5～2的洗脫部分。
步驟C中，所述的吸附劑為聚醯胺，聚醯胺色譜分離時，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分。
步驟C中，所述的吸附劑為大孔樹脂，大孔樹脂色譜分離時，收取20％～50％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分。
在步驟C後，將姜酚肟濃縮液於0～40℃下靜置結晶，可獲得粗結晶姜酚肟。
D)姜酚肟的細分用葡聚糖凝膠作為固定相，以異丙醇∶氯仿＝1～8∶1，為流動相進行連續洗脫，分別收取異丙醇∶氯仿為1.5∶1到5∶1的洗脫部分，去除流動相後，分別得6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟。
肟化反應的原料——姜酚粗提物來自以下兩種製備途徑(一)所述的姜酚粗提物為天然提取的粗姜酚，是通過以下步驟製備的1)原料處理將鮮姜洗淨泥土，切成薑絲或薄薑片，在通風乾燥處曬乾，然後磨成100目姜粉，待用，或直接將自然乾燥所獲的乾薑片粉碎成100目姜粉，待用；2)獲得姜酚萃取液用40％～100％有機溶劑萃取乾薑粉，浸泡期間採用溶劑循環或滲漉等措施，以提高姜酚的萃取率，浸泡時間不少於12小時；每批乾薑粉萃取3～5次；將所用萃取液收集在一起供下一步用；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的一種；所述的步驟2中，可採用滲漉法獲得姜酚萃取液，即將姜粉裝柱，使40％～100％有機溶劑緩慢的通過姜粉柱，獲得姜酚萃取液；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷的一種。
3)回收溶劑在40～70℃下，蒸餾或分餾步驟2所得的姜酚萃取液，回收溶劑，得姜酚粗提物；4)萃取分離姜酚粗提物在姜酚粗提物中加入0.5～1份體積的正己烷，萃取姜酚，連續萃取2～5次；合併正己烷提取液後，回收75～90％正己烷，殘餘物再用等體積的乙醚萃取姜酚，連續萃取2～3次，回收乙醚後得粗姜酚。
(二)所述的姜酚粗提物為各種類型的姜油樹脂，是通過以下步驟製備的用20～80％的含水有機溶劑進行萃取姜油樹脂，分餾出姜精油，得姜酚粗提物；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙醚。
本發明的有益效果在於(1)開發出一種姜酚衍生物——姜酚肟，是一種化學結構、生物活性、功能性質等與姜酚相似的姜酚衍生物，可以充分利用、開發姜酚的生物活性，取代目前天然提取的姜酚，開發出類似於姜酚生物活性的藥品、食品、農藥、試劑標樣等產品，解決目前無姜酚可供利用的實際困難，有望取得巨大經濟效益和社會效益。
(2)提供了可行的、得率高的姜酚肟合成方法，便於推廣應用，使姜酚肟的產業應用前景廣闊。
(3)本發明將目前難以獲得的姜酚製成改性易得、生物活性類似的姜酚肟，為其他難以獲得的天然產物提供了一種可行的解決思路。
本發明還提供了姜酚肟用於製備抗呼吸道合庖病毒藥物、抗腫瘤藥物的用途，以及用於製備抗氧化劑、殺蟲劑的用途。
本發明所述的應用是基於以下的姜酚肟生物活性測定(一)以溶血作用評價抗氧化活性通過姜酚肟抑制細胞膜物質氧化而導致的溶血作用評價其抗氧化能力的大小。
(二)抗脂質過氧化作用的評價即通過姜酚肟減少脂肪的過氧化物形成的能力評價其抗氧化作用的大小。
(三)殺蟲能力的測定通過測定棉燈蟲(Spilosoma boiqua)攝入姜酚肟而導致死亡的效果評價其殺蟲作用。
(四)抗呼吸道合胞病毒(RSV)能力的測定通過姜酚肟抑制感染RSV細胞的活力效果評價其抗RSV的效果。
(五)抗腫瘤活性的測定通過測定抑制腫瘤細胞的生存能力評價其抗腫瘤活性，測定結果表明其與姜酚相當。
以上指標的測定結果見表1。
表1姜酚肟的生物活性-1
注1)樣品的IC50均以6-姜酚肟計(樣品中的6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟含量分別為58％、15％、22％、3％)；2)IC50表示抑制率為50％時的劑量；3)參比物為6-姜酚。
上述測定結果表明與6-姜酚相比，姜酚肟的生物活性與之相當或略小其抗氧化作用、抗腫瘤和殺蟲作用略小於姜酚，但抗RSV作用高於姜酚。
圖1為結晶姜酚肟的製備工藝流程圖。
圖2為結晶姜酚肟的紫外可見掃描光譜圖，測定條件甲醇；儀器UnicamUV504，英國Thermo Spectronic公司生產。
圖3為結晶姜酚肟的紅外光譜圖，德國Bruker公司Equinox 55型傅立葉變換紅外光譜儀，KBr壓片。
圖4為6-姜酚肟的質譜圖，Finnigan MAT TSQ-70質譜儀。
圖5為8-姜酚肟的質譜圖，Finnigan MAT TSQ-70質譜儀。
圖6為10-姜酚肟的質譜圖，Finnigan MAT TSQ-70質譜儀。
圖7為12-姜酚肟的質譜圖，Finnigan MAT TSQ-70質譜儀。
具體實施例方式
實施例一第一步、製取姜酚粗提物按照圖1所示，稱取1公斤鮮姜，用自來水浸泡半小時，取出泥土等雜質，淋幹水分，晾乾，切成2～4毫米的薄片，在陽光下曬乾。置粉碎機中粉碎，過100目篩。按照姜粉∶40％酒精＝1∶3～6(體積/體積)的比例，將姜粉加入到酒精中，浸泡24小時，浸泡期間，每隔2小時攪拌一次；重複浸泡三次，合併酒精浸泡液。在65℃下濃縮回收乙醇。殘餘物用等體積的正己烷萃取三次，回收約3/4體積的正己烷後，殘餘物再用1∶1乙醚萃取姜酚，連續萃取三次，回收乙醚後得粗姜酚提取物60克。
第二步、肟化反應將粗姜酚提取物10克(含姜酚約14％)，溶於適量10％乙醇溶液中，加入1.5克鹽酸羥胺，調節pH值5.5，在100℃下攪拌反應1小時。
第三步、肟化反應液的處理反應完畢後，蒸去90％乙醇，用乙酸乙酯萃取殘餘物3次，再用1M鹽酸、1M食鹽水、無離子水洗，重複該過程三次，回收乙酸乙酯；殘餘物用作下一步的矽膠柱分離。
第四步、矽膠柱粗分殘餘物上矽膠柱，收取正己烷與乙醚體積比為1∶0.5～2洗脫部分，即可得姜酚肟粗結晶。姜酚肟粗結晶產物得率為10％(以粗姜酚提取物計)。
第五步、葡聚糖凝膠柱細分取1克姜酚肟粗結晶，溶於甲醇，上樣於葡聚糖凝膠柱，用異丙醇∶氯仿混合溶劑洗脫，收集異丙醇∶氯仿＝1.5～5∶1的洗脫部分，室溫靜置，分別獲得6-姜酚肟(如圖4所示，6-姜酚肟的質荷比為309，表明6-姜酚的分子量為309)、8-姜酚肟(如圖5所示，8-姜酚肟的質荷比為337，表明8-姜酚的分子量為337)、10-姜酚肟(如圖6所示，10-姜酚肟的質荷比為365，表明10-姜酚的分子量為365)、12-姜酚肟(如圖7所示，12-姜酚肟的質荷比為393，表明12-姜酚的分子量為393)；它們的紫外吸收光譜如圖2所示，227，282吸收峰表明姜酚肟含有苯環。它們的紅外吸收光譜如圖3所示，3241cm-1羥基(O-H)伸縮振動峰，2934cm-1亞甲基(C-H)伸縮振動峰，1672cm-1羥基(O-H)旋轉振動峰，1458cm-1亞甲基(C-H)的剪切振動峰，1606和1515苯環特徵吸收峰。其得率分別為6-姜酚肟53％，8-姜酚肟10％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟計)。
實施例二稱取300g姜粉，過100目篩。按照姜粉∶丙酮＝1∶1～3(體積/體積)的比例，將姜粉加入到丙酮中，浸泡12～24小時，浸泡期間，每隔2小時攪拌一次；重複浸泡五次，合併丙酮浸泡液。在70℃下真空濃縮回收丙酮。殘餘物用1/2體積的正己烷萃取五次，回收約80％體積的正己烷後，殘餘物再用1∶1乙醚萃取姜酚，連續萃取兩次，回收乙醚後得粗姜酚提取物80克。
將粗姜酚提取物10克，溶於適量10％甲醇溶液中，加入20克鹽酸羥胺，調節pH值3.5，在50℃下攪拌反應2小時。反應完畢後，蒸去適量甲醇，將肟化反應液濃縮至原體積的50％，用乙醚萃取殘餘物2次，再用1M鹽酸、1M食鹽水、無離子水洗，重複該過程三次，再進行真空濃縮乾燥，回收乙醚後，用10克聚醯胺粉吸附殘餘物。
姜酚肟的粗分將吸附姜酚肟的聚醯胺粉上樣於聚醯胺色譜柱，用0～100％甲醇(或乙醇、丙酮)洗脫液經濃縮回收，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分，得粗姜酚肟。將姜酚肟濃縮液放置在40℃下，靜置結晶，可獲得粗結晶姜酚肟。姜酚肟粗結晶產物得率為15％(以粗姜酚提取物計)。
姜酚肟的細分取1克姜酚肟粗結晶，溶於甲醇，上樣於葡聚糖凝膠柱，用異丙醇∶氯仿＝4∶1體積比的混合溶劑為流動相進行色譜分離，收集異丙醇∶氯仿＝1.5～5∶1的洗脫部分，室溫靜置，分別獲得6-姜酚肟(如圖4)，8-姜酚肟(如圖5)，10-姜酚肟(如圖6)，12-姜酚肟(如圖7)；它們的紫外與紅外吸收光譜分別如圖2和圖3所示。其得率分別為6-姜酚肟54％，8-姜酚肟9％，10-姜酚肟14％，12-姜酚肟5％(以粗姜酚肟計)。
實施例三稱取乾薑200克，置粉碎機中粉碎，過100目篩。按照姜粉∶甲醇＝1∶1～3(體積/體積)的比例，將姜粉加入到甲醇中，浸泡24小時，待浸透後，裝入柱子，再用甲醇慢慢滲漉，收集滲漉液約400毫升。在40℃下真空濃縮回收甲醇，殘餘物用等體積的正己烷萃取三次，回收約90％體積的正己烷後，殘餘物再用1∶1乙醚萃取姜酚，連續萃取三次，40℃下回收乙醚後得粗姜酚提取物。
本實施例採用滲漉法獲得姜酚萃取液，可用乙醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷替代甲醇進行滲漉，其濃度範圍可在40％～100％。
將粗姜酚提取物10克，溶於適量乙醚溶液中，加入3克鹽酸羥胺，調節pH值4.5，在70℃下攪拌反應2小時。反應完畢後，蒸去70％乙醚，用正己烷萃取殘餘物3次，水洗滌脫鹽後，回收正己烷，即可得粗姜酚肟結晶。產物得率為94％(以姜酚計)。
姜酚肟的粗分將吸附姜酚肟的聚醯胺粉上樣於大孔樹脂色譜柱，用0～100％甲醇(或乙醇、丙酮)洗脫液經濃縮回收，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分，得粗姜酚肟。將姜酚肟濃縮液放置在0℃下，靜置結晶，可獲得粗結晶姜酚肟。姜酚肟粗結晶產物得率為18％(以粗姜酚提取物計)。
姜酚肟的細分取1克姜酚肟粗結晶，溶於10～50％甲醇，上樣於聚醯胺柱，用0～95％乙醇連續洗脫，收集20～60％的乙醇洗脫部分，室溫靜置，分別獲得6-姜酚肟(如圖4)，8-姜酚肟(如圖5)，10-姜酚肟(如圖6)，12-姜酚肟(如圖7)；它們的紫外與紅外吸收光譜分別如圖2和圖3所示。其得率分別為6-姜酚肟50％，8-姜酚肟8％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟計)。
實施例四稱取20克姜油樹脂，用80％甲醇萃取姜酚，連續萃取三次，合併萃取液，回收甲醇後得粗姜酚提取物。
將粗姜酚提取物50克，溶於適量90％乙醇溶液中，加入5克鹽酸羥胺，調節pH值5，在0℃下攪拌反應3小時。反應完畢後，蒸去乙醇，用乙酸乙酯萃取殘餘物3次，回收乙酸乙酯後，將殘餘物上葡聚糖凝膠色譜柱，以異丙醇、氯仿(1～8∶1，V/V)為流動相，收取異丙醇、氯仿(3～5∶1)洗脫部分，去除流動相後，於室溫下靜置洗脫液，分別得到結晶的6-姜酚肟，8-姜酚肟，10-姜酚肟，12-姜酚肟。6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟的得率分別為11％、5％、9％和1％(以姜油樹脂計)。
實施例五稱取10克姜油樹脂，用20％的乙醚連續萃取五次，合併乙醚萃取液，回收乙醚後得粗姜酚提取物。
將粗姜酚提取物50克，溶於適量50％乙酸乙酯溶液中，加入5克鹽酸羥胺，調節pH值5，在室溫下攪拌反應2小時。反應完畢後，蒸去乙酸乙酯，用乙酸乙酯萃取殘餘物3次，回收乙酸乙酯後，將殘餘物上大孔吸附樹脂色譜柱，用0～95％乙醇連續洗脫，收集20～50％的乙醇洗脫部分，置0℃冰箱中靜置，分別獲得6-姜酚肟(如圖4)，8-姜酚肟(如圖5)，10-姜酚肟(如圖6)，12-姜酚肟(如圖7)；它們的紫外與紅外吸收光譜分別如圖2和圖3所示。其得率分別為6-姜酚肟56％，8-姜酚肟10％，10-姜酚肟15％，12-姜酚肟3％(以粗姜酚肟計)。
實施例六稱取15克姜油樹脂，用50％丙酮或乙醇萃取姜酚，連續萃取三次，合併萃取液，回收丙酮或乙醇後得粗姜酚提取物。
將粗姜酚提取物50克，溶於適量50％乙醚溶液中，加入5克鹽酸羥胺，調節pH值5，在室溫下攪拌反應2小時。反應完畢後，蒸去乙醇，用正己烷萃取殘餘物3次，回收正己烷後，將殘餘物上葡聚糖凝膠色譜柱，以異丙醇、氯仿(1～8∶1，V/V)為流動相，收取異丙醇、氯仿(3～5∶1)洗脫部分，去除流動相後，於室溫下靜置洗脫液，分別得到結晶的6-姜酚肟，8-姜酚肟，10-姜酚肟，12-姜酚肟。6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟的得率分別為11％、5％、9％和1％(以姜油樹脂計)。
實施例七取購買的純度為95％的6-姜酚30mg，溶於2ml乙醚，加入0.2ml正己烷羥胺(羥胺含量為50％)溶液，混勻，於室溫下反應2小時，分別加2ml1M鹽酸洗滌三次，2ml1M食鹽水洗滌三次，2ml無離子水洗滌三次，無水硫酸鈉脫水後，靜置，待乙醚揮發後即可獲得結晶狀態的6-姜酚肟25mg。
上述實施例所得的姜酚肟的生物活性測定主要指標的測定方法如下(一)以溶血作用評價抗氧化活性取200克BALB/c雄性鼠，處死，迅速取後靜脈管血液放入肝素鈉處理過的玻璃管中，離心得紅細胞，用磷酸緩衝液(PBS)清洗三次，每次用吸管吸去血漿和棕黃色血沉，然後於1000g離心10分鐘，棄去上層液體，用PBS重新懸浮，並配製成20％紅細胞懸浮液。
溶血評價分別取0.1ml20％紅細胞懸浮液，分別加入0.1mlPBS或含有不同濃度姜酚肟樣品的PBS和0.2ml AAPH[2，2′-Azobis(2-amidino-propane)dihydrochloride]混勻於37℃水浴保溫3小時後，再加入8ml PBS(A)，另一支管加入8ml蒸餾水(B)以使紅細胞破裂溶血，兩種反應物均在1000g下離心10分鐘，分別測定其在540nm的吸光度。吸光度越高，說明溶血作用越嚴重，所用姜酚肟的抗氧化作用越弱。以維生素C作為陽性對照。按照下式計算抑制率％抑制率＝[(1-A)/B]×100％以50％抑制率時的姜酚肟濃度作為半有效劑量(IC50)。
(二)脂質過氧化作用的評價腦勻漿的製作取150g雄性BALB/c鼠腦，迅速用20mM 0℃Tris-鹽酸緩衝液(pH7.4)充分洗滌，置Polytron PT 3000勻漿機上均質，再於3000g下離心10分鐘，取上清液進行脂質過氧化評價。
脂質過氧化的測定以丙二醛(MDA)作為脂質過氧化評價的指標，用FeSO4-Vit.C系統誘導脂質過氧化。取0.1ml鼠腦勻漿上清液，0.1ml 10uMFeSO4，0.1ml 0.1mM Vit.C，0.2ml不同濃度姜酚肟樣品溶液，混勻，37℃水浴保溫1小時後，加入0.5ml 28％三氯乙酸(TCA)停止反應，加0.38ml 2％硫代巴比妥酸(TBA)與鼠腦勻漿脂質過氧化脂質反應產生的MDA於80℃反應20分鐘，冷卻後，離心10分鐘，於532nm下測定上清液中的MDA-TBA反應物的吸光度。用BHA作為陽性對照。按下式計算抑制率％抑制率＝[(1-A)/B]×100％式中A為樣品的吸光度；B為對照的吸光度。以50％抑制率時的姜酚肟濃度作為半有效劑量(IC50)。
(三)殺蟲能力的測定配製0.2％(WN)結晶姜酚肟乙醇母液將0.2g姜酚肟結晶溶於10ml20％乙醇中。用時分別用0.01％分子蒸餾單甘酯溶液稀釋成10、7、5、3、2、1g/L溶液。將配製好的溶液用等面積的乾燥蓖麻葉浸透，以此作為棉燈蟲的飼料。對照棉燈蟲的飼料用0.01％分子蒸餾單甘酯溶液浸泡等面積的幹蓖麻葉。
將三齡幼蟲(6～8天)和浸透姜酚肟溶液的蓖麻葉一塊放入瓶中，餵養24小時後，再飼餵正常的蓖麻葉。飼餵過程中，每24小時更換飼料，清除糞便等渣滓。統計幼蟲的死亡率、異常幼蟲率、蛹死亡率等，並按照下式計算出校正抑制率％校正生長抑制率＝[(T-C)/100-C]×100式中T——處理棉燈蛾總生長抑制量；C——對照棉燈蛾總生長抑制量。
以50％抑制率時的姜酚肟濃度作為半有效劑量(IC50)。
(四)抗呼吸道合胞病毒(RSV)能力的測定病毒和細胞RSV，猴腎皮樣癌細胞(Hep-2)和狗腎細胞(MDCK)細胞均購自ATCC(American Type Culture Collection)。
細胞生長培養基和維持液生長培養基DMEM(Dulbecco’s modifiedEagle’s Medium)。配製生長培養基時，每升添加10％牛血清蛋白，10000U青黴素，2mM慶大黴素，2mM谷醯胺。配製細胞的生長維持液時，只添加1％牛血清蛋白，其它同生長培養基配製。其它試劑均為Sigma公司產品。
抗RSV活性的測定將姜酚肟樣品均用適量的二甲基亞碸(控制其在培養基母液中的含量低於1％)溶解，再用配製好的維持培養基稀釋成含樣品4-8mg/ml的母液備用。
將含有生長良好Hep-2細胞的生長培養基分裝於96孔塑料培養板上，在37℃，含5％二氧化碳的培養箱中培養3天，等細胞生長形成單細胞層後，除去生長培養基，添加0.1毫升含100 TCID50(半數感染病毒量)的RSV懸浮液和0.1毫升含適當濃度樣品的維持液。每個樣品測定三個濃度，以樣品對培養細胞的最大無毒劑量作為最大測試濃度，其他兩個濃度為倍比稀釋濃度。每個樣品濃度重複三次。對照中不添加樣品。以病毒唑為陽性對照。將96孔板置37℃，5％CO2培養箱培養2天後，鏡檢細胞病變情況，以細胞病變率(CPE)反映樣品的活性。利用不同樣品濃度下的CPE值求出樣品的半有效劑量(IC50)，以比較不同樣品的抗RSV效果。
細胞毒測定為避免高濃度樣品毒害培養細胞而導致的正誤差，測定樣品活性前先測定樣品的最大無毒劑量。具體測定操作同前述樣品的活性測定。只是利用純的生長培養基代替病毒懸浮液。測定結果以50％培養細胞出現異常(如細胞變圓、收縮、原生質體形成氣泡等)時的樣品濃度表示為該樣品的最大無毒劑量。
(五)抗腫瘤活性的測定細胞血癌細胞(K562)猴腎細胞(Vero)，白血病腫瘤細胞(HL-60)。
抗病毒活力的測定取培養好的HL-60和K-562腫瘤細胞，分別接種在96孔板上，每孔接種1×10-4個細胞，再分別加入姜酚肟溶液，使其終濃度為2.5、5、10、20ug/L，再於37℃、5％CO2、95％相對溼度下培養72小時。培養結束後，加入與適量的0.4％Tryphan blue溶液，鏡檢死細胞與活細胞的數量，據下式計算腫瘤細胞抑制率。
％抑制率＝(1-樣品處理活細胞數/對照活細胞數)×100姜酚肟對細胞毒力的測定同抗RSV活性的測定。
以上指標的測定結果見表1。
表1姜酚肟的生物活性-1
注1)樣品的IC50均以6-姜酚肟計(樣品中的6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟含量分別為58％、15％、22％、3％)；2)IC50表示抑制率為50％時的劑量；3)參比物為6-姜酚。
上述測定結果表明與6-姜酚相比，姜酚肟的生物活性與之相當或略小其抗氧化作用、抗腫瘤和殺蟲作用略小於姜酚，但抗RSV作用高於姜酚。
權利要求
1.姜酚肟，其特徵在於，是將姜酚粗提物或純姜酚通過肟化反應得到的姜酚衍生物，具有如下的通式結構 其中n＝4，為6-姜酚肟；n＝6，為8-姜酚肟；n＝8，為10-姜酚肟；n＝10，為12-姜酚肟。
2.如權利要求1所述的姜酚肟的合成方法，其特徵在於，包括以下步驟A)肟化反應以姜酚粗提物或提純的姜酚為原料，加入摩爾數1～3倍於姜酚的鹽酸羥胺，在0～100℃、pH為3.5～5.5的條件下，進行肟化反應，反應時間1～3小時，反應使用的溶劑選自10～100％的甲醇、乙醇、乙醚、乙酸乙酯中的一種；B)製取粗姜酚肟將肟化反應液濃縮至原體積的10～50％，用有機溶劑萃取2～3次；所獲有機溶液相先後經過酸洗、鹽洗、水洗，重複該過程1～3次；再回收溶劑，得粗姜酚肟；所述的有機溶劑選自乙醚、乙酸乙酯、正己烷；C)姜酚肟的粗分用吸附劑作為固定相進行色譜分離，洗脫液經濃縮回收得粗姜酚肟；D)姜酚肟的細分用葡聚糖凝膠作為固定相，以異丙醇∶氯仿＝1～8∶1，為流動相進行連續洗脫，分別收取異丙醇∶氯仿為1.5∶1到5∶1的洗脫部分，去除流動相後，分別得6-姜酚肟、8-姜酚肟、10-姜酚肟、12-姜酚肟。
3.根據權利要求2所述的合成方法，其特徵在於所述的步驟C中，所述的吸附劑為矽膠，矽膠色譜分離時，收取正己烷與乙醚體積比為1∶0.5～2的洗脫部分。
4.根據權利要求2所述的合成方法，其特徵在於所述步驟C中，所述的吸附劑為聚醯胺，聚醯胺色譜分離時，收取20％～60％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分。
5.根據權利要求2所述的合成方法，其特徵在於所述的步驟C中，所述的吸附劑為大孔樹脂，大孔樹脂色譜分離時，收取20％～50％甲醇、乙醇或丙酮洗脫部分。
6.根據權利要求2所述的合成方法，其特徵在於在步驟C後，將姜酚肟濃縮液於0～40℃下靜置結晶，可獲得粗結晶姜酚肟。
7.根據權利要求2所述的合成方法，其特徵在於，所述的姜酚粗提物為天然提取的粗姜酚，是通過以下步驟製備的1)原料處理將鮮姜洗淨泥土，切成薑絲或薄薑片，在通風乾燥處曬乾，然後磨成100目姜粉，待用，或直接將自然乾燥所獲的乾薑片粉碎成100目姜粉，待用；2)獲得姜酚萃取液用40％～100％有機溶劑萃取乾薑粉，浸泡期間採用溶劑循環或滲漉措施，以提高姜酚的萃取率，浸泡時間不少於12小時；每批乾薑粉萃取3～5次；將所用萃取液收集在一起供下一步用；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯的一種；3)回收溶劑在40～70℃下，蒸餾或分餾步驟2所得的姜酚萃取液，回收溶劑，得姜酚粗提物；4)萃取分離姜酚粗提物在姜酚粗提物中加入0.5～1份體積的正己烷，萃取姜酚，連續萃取2～5次；合併正己烷提取液後，回收75～90％正己烷，殘餘物再用等體積的乙醚萃取姜酚，連續萃取2～3次，回收乙醚後得粗姜酚。
8.根據權利要求7所述的合成方法，其特徵在於所述的步驟2中，採用滲漉法獲得姜酚萃取液，即將姜粉裝柱，使40％～100％有機溶劑緩慢的通過姜粉柱，獲得姜酚萃取液；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙酸乙酯、正己烷的一種。
9.根據權利要求2所述的合成方法，其特徵在於，所述的姜酚粗提物為各種類型的姜油樹脂，是通過以下步驟製備的用20～80％的含水有機溶劑進行萃取姜油樹脂，分餾出姜精油，得姜酚粗提物；所述的有機溶劑選自乙醇、甲醇、丙酮、乙醚。
10.如權利要求1所述的姜酚肟用於製備抗呼吸道合庖病毒藥物、抗腫瘤藥物的用途，以及用於製備抗氧化劑、殺蟲劑的用途。
全文摘要
本發明屬於天然產物的製取、改性與應用領域，具體地涉及一種姜酚衍生物——姜酚肟，以及其合成方法與應用。所述的姜酚肟，是將姜酚粗提物或提純的姜酚通過肟化反應得到的姜酚衍生物。本發明以鮮姜或生薑半成品(如乾薑、姜油樹脂等)為原料，獲得粗姜酚，或者利用純姜酚，再通過肟化反應、分離純化獲得結晶狀態的姜酚肟，並測定其抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、殺蟲等生物活性，從而使姜酚肟應用於上述領域。姜酚肟可以替代姜酚使用，並可用於新型藥品、食品添加劑、綠色農藥等新產品的開發。
文檔編號C07C251/54GK1680290SQ20051003297
公開日2005年10月12日 申請日期2005年1月31日 優先權日2005年1月31日
發明者黃雪松 申請人:暨南大學