一種利用甘蔗末梢獲取轉基因甘蔗的方法與流程

2024-04-05 16:31:05

本發明涉及一種甘蔗育種領域，具體涉及一種利用甘蔗末梢獲取轉基因甘蔗的方法。

背景技術：

植物轉基因技術是植物學研究領域的重要基礎，是開展功能基因組學和植物轉基因育種的基礎手段。植物轉基因技術的優化一直以來是研究者們長期關注的重點，轉基因技術的研究逐漸升入，也日趨完善。近年來，隨著工業和城市的發展，植物的立地環境日益惡劣，面臨的生物和非生物脅迫也越來越嚴重。轉基因植物的種植能有效緩解目前的困境。轉基因作物的面積也逐年增加，這也對植物轉基因技術的提出了新的要求。根據不同植物的再生特性，建立高效快速的轉基因技術是研究者追求的目標。

甘蔗是一種重要的糖料和能源作物，甘蔗糖佔世界食糖總量的70％以上。甘蔗作是目前栽培作物中光合效率最高、產量最高的高光效C4作物，是生產乙醇的最佳能源作物。同時，以甘蔗為原料所生產的工業用品多大上百種，具有較高的附加值。然而，在生產上由於甘蔗是異源多倍體，遺傳背景複雜，導致常規的雜交育種周期長，效率低，給培育具有突破性的甘蔗新品種帶來重重困難。轉基因技術能夠快速對現有品種進行定向改良，因此，在甘蔗育種上有著廣泛對應用前景。甘蔗由於其本身的複雜性，以及種植的區域性導致研究相對落後，在甘蔗轉基因技術方面尤為突出，直到上世紀九十年代才通過愈傷組織途徑獲得了轉基因植株。目前，甘蔗轉基因所常用的方法都是在水稻，玉米等作物的轉化方法的基礎上所建立的。轉化受體材料多為愈傷組織或胚狀體。這兩者都需要一定的時間進行愈傷組織的誘導，比較費時費力，同時受到再生體系建立困難的限制。

技術實現要素：

為了克服現有技術的不足，本發明的目的在於提供一種採用甘蔗末梢作為材料，通過農桿菌介導直接侵染傷口，將外源目的基因導入甘蔗細胞中，經過細胞途徑再生出轉基因植株，具有育種時間短、成本低、材料容易獲取、無需獲取愈傷組織、操作簡單等優點。

實現本發明的目的可以通過採取如下技術方案達到：

一種利用甘蔗末梢獲取轉基因甘蔗的方法，具體為：採用攜帶有外源目的基因的農桿菌轉染甘蔗莖節的尾部的末梢切片，再對轉染後的甘蔗莖節的尾部的末梢切片進行選擇性培養和誘導生根，獲得轉基因甘蔗植株。

一種利用甘蔗末梢獲取轉基因甘蔗的方法，包括如下步驟：

1)將含有外源目的基因的農桿菌培養至對數生長期，收集菌體，再將菌體重懸在含有50-200μM乙醯丁香酮的MS液體培養基中，得到轉化菌液；

2)取田間種植的健康甘蔗植株，截取被甘蔗葉片包被的甘蔗莖節的尾部的末梢，表面消毒後獲得外植體；

3)將步驟1)所獲得的轉化菌液倒入培養皿中，將步驟2)所獲的外植體置於培養皿中，將外植體切成外植體切片；

4)將含有外植體切片和轉化菌液的培養皿蓋好，培養10-30分鐘，獲得受體；

5)在無菌環境下將受體取出，用無菌紙吸乾受體表面液體，再將受體置於共培養培養基上，在23-27℃的黑暗環境下培養3-4天進行轉化，獲得轉化材料；

6)將轉化材料置於選擇培養基培養，進行再生；待苗高為2-3cm時，切取植株接到生根培養基進行生根誘導，得到生根的植株；

7)將生根的植株煉苗、移栽，得到轉基因甘蔗植株。

優選地，步驟1)中將含有外源目的基因的農桿菌培養至對數生長期，具體為將含有外源目的基因的農桿菌培養至OD600＝0.5-0.8。

優選地，步驟2)中的健康甘蔗的品種具體為新臺糖20號或新臺糖22號。

優選地，步驟3)中的外植體切片的厚度為0.3cm

優選地，步驟4)的具體操作為將含有外植體切片和轉化菌液的培養皿蓋好，放入真空瓶中，在真空度為20-30mm Hg的條件下，培養10-30分鐘。

優選地，步驟1)所述的外源目的基因為Bar基因、5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶基因、抗潮黴素基因中的一種。

優選地，步驟5)所述共培養培養基為含有1-2mg/L 2,4-D、1-2mg/L 6-BA、5.5g/L脂粉的MS培養基，所述共培養培養基的pH＝5.5。

優選地，步驟6)所述選擇培養基為含有1-2mg/L 2,4-D、1-2mg/L6-BA、5.5g/L瓊脂粉和抗性篩選物質的MS培養基，所述選擇培養基的pH＝5.8。

優選地，步驟6)所述生根培養基為含有1-3mg/L萘乙酸、5.0g/L瓊脂粉和抗性篩選物質的MS培養基，所述生根培養基的pH＝5.8。

優選地，所述抗性篩選物質為草丁膦、草甘膦、潮黴素中的一種。

相比現有技術，本發明的有益效果在於：

(1)本發明採用甘蔗末梢作為材料，通過農桿菌介導直接侵染傷口，將外源基因導入甘蔗細胞中，經過細胞途徑再生出轉基因植株。本方法可以簡化甘蔗轉化過程，整個過程只需要3個月。同時，轉化所用的受體材料也容易得到，不受材料的限制，適合大規模的甘蔗轉基因批量生產，具有著成本低廉、效率高、操作簡單。

(2)本發明採用甘蔗末梢作為受體材料，目前採用的愈傷組織轉基因方法相比較，方法培養時間短，避免了長期組織培養過程中，外源激素導致變異的影響。

(3)本發明轉化效率高，得到的嵌合體少；而且具有可拓展性，可以適用於大規模轉基因甘蔗的研製，大大減少工作量，降低研究費用。

附圖說明

圖1為轉化材料在選擇培養基中生長狀態圖。

圖2為轉化後在生根培養基中生長狀態圖。

圖3為轉基因甘蔗抗潮黴素基因PCR檢測電泳圖。

具體實施方式

下面，結合具體實施方式，對本發明做進一步描述：

實施例1：

一種利用甘蔗末梢獲取轉基因甘蔗的方法，包括如下步驟：

1)製備含有Bar基因的農桿菌LBA4404。LBA4404感受態細胞購買於寶生物工程(大連)有限公司，Bar基因來源於商業載體pCAMBIA3301。將Pcambia3301質粒按照《分子克隆》的方法，導入到LBA4404細胞中。挑取含有Bar基因的農桿菌LBA4404單菌落，接種於5mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養基中，28℃搖床過夜，再接著將0.5ml菌液接種於50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養基中培養至OD600為0.5。將菌液於4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。用5mL含50μM AS(乙醯丁香酮)的MS液體培養基重新懸浮沉澱，將菌液轉入50mL的含50μM AS的MS液體培養基中，27℃搖床上培養至OD600為0.5，得到轉化菌液。

2)取田間種植的健康甘蔗植株，截取被甘蔗葉片包被的甘蔗莖節的尾部的末梢，70％酒精表面消毒後獲得外植體；所述健康甘蔗植株的品種為新臺糖22號。

3)將步驟1)所獲得的轉化菌液倒入培養皿中，將步驟2)所獲的外植體置於培養皿中，將外植體切成厚度為0.3cm的外植體切片。

4)將含有外植體切片和轉化菌液的培養皿蓋好，培養10-30分鐘，獲得受體。

5)在無菌環境下將受體取出，用無菌紙吸乾受體表面液體，再將受體置於共培養培養基上，在25℃的黑暗環境下培養3天進行轉化，獲得轉化材料；所述共培養培養基為含有1.5mg/L 2,4-D、1.5mg/L6-BA、5.5g/L脂粉的MS培養基，所述共培養培養基的pH＝5.5。

6)將轉化材料置於選擇培養基培養，進行再生(如圖1所示)；待苗高為2-3cm時，切取植株接到生根培養基進行生根誘導，得到生根的植株(如圖2所示)；所述選擇培養基為含有1.5mg/L 2,4-D、1.5mg/L 6-BA、5.5g/L瓊脂粉、5mg/L草丁膦的MS培養基，所述選擇培養基的pH＝5.8。所述生根培養基為含有1mg/L萘乙酸、5.0g/L瓊脂粉、5mg/L草丁膦的MS培養基，所述生根培養基的pH＝5.8。

7)打開瓶蓋，煉苗1周，進行移栽。洗淨植株根部的培養基後植株移栽到育苗盤的基質中(基質為園土和泥炭土按質量比1：1混合得到)。

實施例2：

一種利用甘蔗末梢獲取轉基因甘蔗的方法，包括如下步驟：

1)製備含有5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合成酶(EPSPS)基因的農桿菌LBA4404。LBA4404感受態細胞購買於寶生物工程(大連)有限公司，含EPSPS的質粒有廣東省農業科學院保存。挑取含有EPSPS基因的農桿菌LBA4404單菌落，接種於5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養基中，28℃搖床過夜，再接著將0.5ml菌液接種於50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養基中培養至OD600為0.7左右。將菌液於4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。用5mL含100μM AS(乙醯丁香酮)的MS液體培養基重新懸浮沉澱，將菌液轉入50mL的含100μM AS的MS液體培養基中，27℃搖床上培養至OD600為0.7，得到轉化菌液。

2)取田間種植的健康甘蔗植株，截取被甘蔗葉片包被的甘蔗莖節的尾部的末梢，70％酒精表面消毒後獲得外植體；所述健康甘蔗植株的品種為新臺糖20號。

3)將步驟1)所獲得的轉化菌液倒入培養皿中，將步驟2)所獲的外植體置於培養皿中，將外植體切成厚度為0.3cm的外植體切片；

4)將含有外植體切片和轉化菌液的培養皿蓋好，放入真空瓶中，在真空度為20-30mm Hg的條件下，培養10-30分鐘。

5)在無菌環境下將受體取出，用無菌紙吸乾受體表面液體，再將受體置於共培養培養基上，在23℃的黑暗環境下培養3天進行轉化，獲得轉化材料；所述共培養培養基為含有1mg/L 2,4-D、1mg/L6-BA、5.5g/L脂粉的MS培養基，所述共培養培養基的pH＝5.5。

6)將轉化材料置於選擇培養基培養，進行再生；待苗高為2cm時，切取植株接到生根培養基進行生根誘導，得到生根的植株；所述選擇培養基為含有1mg/L 2,4-D、1mg/L 6-BA、5.5g/L瓊脂粉、5mg/L草甘膦的MS培養基，所述選擇培養基的pH＝5.8。所述生根培養基為含有1mg/L萘乙酸、5.0g/L瓊脂粉、5mg/L草甘膦的MS培養基，所述生根培養基的pH＝5.8。4周後，可見植株高約6cm，下部出現長約2cm的根。

7)打開瓶蓋，煉苗1周，進行移栽。洗淨植株根部的培養基後植株移栽到育苗盤的基質中(基質為園土和泥炭土按質量比1：1混合得到)。

實施例3：

一種利用甘蔗末梢獲取轉基因甘蔗的方法，包括如下步驟：

1)按照《分子克隆》的方法製備含有抗潮黴素基因(hpt)的農桿菌LBA4404。LBA4404感受態細胞購買於寶生物工程(大連)有限公司，含抗潮黴素基因(hpt)的質粒有廣東省農業科學院保存。挑取含有抗潮黴素基因(hpt)的農桿菌LBA4404單菌落，接種於5ml含有50mg/L利福平的YEB液體培養基中，28℃搖床過夜，再接著將0.5ml菌液接種於50mL含有50mg/L利福平的YEB液體培養基中培養至OD600為0.5左右。將菌液於4℃、5000rpm離心5min，收集菌體。用5mL含200μM AS(乙醯丁香酮)的MS液體培養基重新懸浮沉澱，將菌液轉入50mL的含200μM AS的MS液體培養基中，27℃搖床上培養至OD600為0.8，得到轉化菌液。

2)取田間種植的健康甘蔗植株，截取被甘蔗葉片包被的甘蔗莖節的尾部的末梢，70％酒精表面消毒後獲得外植體；所述健康甘蔗植株的品種為臺糖公司選育的新臺糖20號。

3)將步驟1)所獲得的轉化菌液倒入培養皿中，將步驟2)所獲的外植體置於培養皿中，將外植體切成厚度為0.3cm的外植體切片；

4)將含有外植體切片和轉化菌液的培養皿蓋好，放入真空瓶中，在真空度為20-30mm Hg的條件下，培養20-30分鐘。

5)在無菌環境下將受體取出，用無菌紙吸乾受體表面液體，再將受體置於共培養培養基上，在27℃的黑暗環境下培養4天進行轉化，獲得轉化材料；所述共培養培養基為含有2mg/L 2,4-D、2mg/L6-BA、5.5g/L脂粉的MS培養基，所述共培養培養基的pH＝5.5。

6)將轉化材料置於選擇培養基培養，進行再生；待苗高為3cm時，切取植株接到生根培養基進行生根誘導，得到生根的植株；所述選擇培養基為含有2mg/L 2,4-D、2mg/L 6-BA、5.5g/L瓊脂粉、50mg/L潮黴素，所述選擇培養基的pH＝5.8。所述生根培養基為含有3mg/L萘乙酸、5.0g/L瓊脂粉、50mg/L潮黴素的MS培養基，所述生根培養基的pH＝5.8。4周後，可見植株高約6cm，下部出現長約2cm的根。

7)打開瓶蓋，煉苗1周，進行移栽。洗淨植株根部的培養基後植株移栽到育苗盤的基質中(基質為園土和泥炭土按質量比1：1混合得到)。

驗證實施例

選取實施例1-3所製備的轉基因甘蔗，進行轉化效果進行檢測，具體操作如下:

實施例1的檢測操作步驟及其結果如下：

A、取種植在育苗盤中再生植株葉片，採用微量法提取總DNA(王繼華，李餘良，胡建廣，等.一種轉基因甘蔗基因組DNA的快速提取方法，甘蔗糖業，2007，(6)：6-7)進行PCR擴增。

B、PCR擴增引物是依據質粒表達載體中Bar序列設計。上遊序列：5'-ACCATCGTCAACCACTACAT-3'下遊序列：5'-AGTCC AGCTGCCAGAAACCC-3'。PCR反應體系：模板DNA 50～100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG3 0.35μL，10mmol/L ZG4 0.35μL，25mmol/L MgCl2 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，補ddH2O至15μL。反應條件：95℃預變性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

C、質量體積比1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

本實施例1通過對獲得的轉抗除草劑轉基因甘蔗進行除草劑抗性鑑定，結果表明能夠獲得大量的轉基因抗除草劑甘蔗，表明該方法切實可行。

實施例2的檢測操作及其結果如下：

抗除草劑轉基因甘蔗檢測：

A、取種植在育苗盤中再生植株葉片，採用微量法提取總DNA(王繼華，李餘良，胡建廣，等.一種轉基因甘蔗基因組DNA的快速提取方法，甘蔗糖業，2007，(6)：6-7)進行PCR擴增。

B、PCR擴增引物是依據質粒表達載體中EPSPS序列設計。上遊序列：SU1 5'-ATGGAATCCCTGACGTTACAACC-3'下遊序列：SD15'-T TAGGCAGGCGTACTCATTC-3'。PCR反應體系：模板DNA 50～100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L SU10.35μL，10mmol/L SD1 0.35μL，25mmol/L MgCl2 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，補ddH2O至15μL。反應條件：95℃預變性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

C、質量體積比1％瓊脂糖凝膠電泳檢測。

本實施例通過對獲得的轉抗除草劑轉基因甘蔗進行除草劑抗性鑑定，結果表明能夠獲得大量的轉基因抗除草劑甘蔗，表明該方法切實可行。

實施例3的檢測操作及其結果如下：

A、取種植在育苗盤中再生植株葉片，採用微量法提取總DNA(王繼華，李餘良，胡建廣，等.一種轉基因甘蔗基因組DNA的快速提取方法，甘蔗糖業，2007，(6)：6-7)進行PCR擴增。

B、PCR擴增引物是依據質粒表達載體中EPSPS序列設計。上遊序列：ZG15 5'-GATCGTTATGTTTATCGGCACT-3'下遊序列：ZG16'-TTGGCGACCTCGTATTGG-3'。PCR反應體系：模板DNA50～100ng，10×Buffer 1.5μL，10mmol/L dNTP 0.35μL，10mmol/L ZG15 0.35μL，10mmol/L ZG16 0.35μL，25mmol/L MgCl2 1.0μL，Taq酶(5U/μL)0.2μL，補ddH2O至15μL。反應條件：95℃預變性3min；95℃30sec，60℃40sec，72℃40sec，35個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

C、質量體積比1％瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示，圖中左起第一泳道為marker，其他為樣品。

本實施例通過對獲得的轉抗潮黴素基因甘蔗進行潮黴素抗性鑑定，結果表明能夠獲得大量的轉基因抗除草劑甘蔗，表明該方法切實可行。

對於本領域的技術人員來說，可根據以上描述的技術方案以及構思，做出其它各種相應的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應該屬於本發明權利要求的保護範圍之內。