一種枯草芽胞桿菌ATR2及製備方法和應用與流程
2024-04-04 23:43:05 1
本發明涉及微生物農藥及生物醫藥技術領域，更具體涉及一種防治作用的枯草芽胞桿菌(bacillussubtilis)，同時涉及一種防治作用的枯草芽胞桿菌的製備方法，還涉及一種防治作用的枯草芽胞桿菌在防蟲抗病中的應用。該菌株的發酵液對生薑根腐病病原菌短小芽胞桿菌、人類病原菌假結核耶爾森氏菌、炭疽芽胞桿菌、及多種植物病原真菌具有較強的抑制活性，該菌產生的抗菌活性物質為桿菌抗黴素d和表面活性素，此外，該菌發酵液對農業刺吸式口器害蟲蚜蟲和紅蜘蛛等具有較強的毒殺作用，因此該菌株可以用於生產防治農業植物病蟲害、人類醫學病原菌的生物製劑。
背景技術：
自1945年johnson發現枯草芽胞桿菌具有防治植物病害的作用[science1945,102(2650):376-377]，枯草芽胞桿菌作為一種生防細菌防治植物病害成為國內外研究的熱點。枯草芽胞桿菌(bacillussubtilis)是一種重要的植物根系促生菌，在自然界分布廣泛，極易培養。枯草芽胞桿菌在生長代謝過程中可以產生多種抗菌活性物質，目前已報導的枯草芽胞桿菌產生的抗菌活性物質多達60多種，主要包括非核糖體合成途徑合成[生物化學與生物物理進展2002,29(5):667-669]和核糖體合成途徑合成兩大類。非核糖體途徑合成的抗菌活性物質包括脂肽類如表面活性素[biochemicalandbiophysicalresearchcommunications1968,31(3):488-494]、伊枯草菌素家族[biotechnologyandappliedbiochemistry1990,12(4):370-375]、芬原素家族[archivesofmicrobiology1996,165(4):243-251]和羅克黴素[appliedandenvironmentalmicrobiology2016,81(19):6601-6609]；多肽類如桿菌肽[蠶業科學2006,32(3):392-398]和溶桿菌素[植物病理學報2003,33(2):97-103]等；磷脂類如bacilysocin[antimicrobialagentsandchemotherapy2002,46(2):315-320]；多烯類如bacillaene、difficidin和oxydifficidin[thejournalofantibiotics1995,48(9):997-1003]等；核糖體合成途徑合成的抗菌活性物質包括細菌素如枯草菌素[peptides2004,25(9):1415-1424]、枯草桿菌蛋白酶[journalofbiochemistry1985,98(3):585-603]和tasa[journalofbacteriology1999,181(5):1664-1672]；細胞壁降解酶類如幾丁質酶[植物病理學報2004,34(2):166-172]和葡聚糖酶[生命科學儀器2009,7(4):19-23]；某些活性蛋白[江蘇農業學報2005,21(4):288-293]等。
作為一種重要的生防細菌，目前已發現枯草芽胞桿菌可以防治多種植物病害，如水稻紋枯病(rhizoctoniasolani)[biologicalcontrol2009,51(1):61-65]、百合枯萎病(fusariumoxysporum)[西北農林學報2010,19(10)：133-136]、蘋果黴心病(alternariaalternata)[植物病理學報2000,30(1):66-70]、辣椒疫黴病(phytophthoracapsici)[中國生物防治學報2012,28(2):235-242]等。其作用機制主要包括競爭作用，競爭作用是生防微生物發揮作用的重要機制，杜立新等發現,bacillussubtilisbs-208在番茄葉面上的分布不均勻,多定殖於葉面凹陷處、傷口和絨毛根部,且在自然土壤和滅菌土中均能成功定殖[河北農業大學學報2004,27(6):78-82]；拮抗作用，枯草芽胞桿菌可以產生脂肽類、多肽類、細菌素等多種抗菌物質抑制或殺死其他微生物；誘導植物產生抗性，李德全等研究發現bacillussubtilisbs-916能誘導水稻葉鞘細胞pod、ppo和sod活性增強[植物病理學報2008,38(2):192-198]和促進植物生長，張霞等研究發現枯草芽胞桿菌b931可以產生生長素、赤黴素和細胞分裂素等植物激素促進植物生長[作物學報，2007，33(2)：236－241]。
除抗病活性，研究發現枯草芽胞桿菌在防蟲等方面也具有較大的應用前景。丁國春等研究發現枯草芽胞桿菌(bacillussubtilus)ar11對南方根結線蟲(meloidogyneincognita)具有較好防治效果[南京農業大學學報2005,28(2):46-49]；劉靜等研究發現枯草芽胞桿菌ja粗提液對紅蜘蛛有殺蟲效應[微生物學報2004,44(4):511-514]；餘瓊等研究發現枯草芽胞桿菌發酵液對於常見的農業害蟲菜青蟲具有毒殺作用[黑龍江科學2011,2(3):13-15]；劉慰等研究發現枯草芽胞桿菌hx08可以產生草酸脫羧酶，對於常見鱗翅目害蟲棉鈴蟲具有致死作用[湖南師範大學自然科學學報2014,37(5):14-20]。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供了一種抗生薑根腐病病原菌短小芽胞桿菌、人類醫學病原菌假結核耶爾森氏菌及炭疽芽胞桿菌、農業植物病原真菌黑麴黴、油菜灰黴及辣椒灰黴病原菌灰葡萄孢、甘蔗鳳梨病病原菌奇異長喙殼、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌的枯草芽胞桿菌atr2，該細菌分類命名：枯草芽胞桿菌bacillussubtilisssp.atr2(cctccno.m2016071)；該枯草芽胞桿菌對上述病原菌均具有拮抗作用，該菌產生的抗菌活性物質為桿菌抗黴素d(bacillomycind)和表面活性素(surfactin)。
本發明的另一個目的是在於提供了一種枯草芽胞桿菌atr2的製備方法，方法易行，成本低廉，操作簡便快速，極大地減少了工作量和縮短了製備時間。
本發明的再一個目的是在於提供了一種枯草芽胞桿菌atr2在製備治療或預防生薑根腐病病原菌短小芽胞桿菌、人類醫學病原菌假結核耶爾森氏菌及炭疽芽胞桿菌、農業植物病原真菌的生物農藥及生物醫藥中的應用，枯草芽胞桿菌atr2高效廣譜的抑菌活性，使其可廣泛應用於多種病原菌的防治中，增加了枯草芽胞桿菌產品的多樣化和系列化，擴大了枯草芽胞桿菌製劑的使用範圍。
本發明的再一個目的是在於提供了一種枯草芽胞桿菌atr2在製備防治或預防農業刺吸式害蟲蚜蟲及紅蜘蛛等的生物農藥中的應用，用該細菌的發酵液，可有效地殺死農作物葉莖上的蚜蟲和紅蜘珠。
為了實現上述的目的，本發明採用以下技術措施：
枯草芽胞桿菌(bacillussubtilis)atr2是一株由本實驗室從中國土壤樣品中分離、並以生薑根腐病病原菌短小芽胞桿菌bacilluspumilusgr8[plantdisease,2013,97(10):1308-1315]為拮抗對象，採用瓊脂擴散法中的牛津杯法(applmicrobiolbiotechnol,2010,86:535–543.)，經過觀測抑菌圈而篩選出來的對短小芽胞桿菌gr8具有明顯抑制作用的細菌菌株。取抗(anti-)的兩個字母at、生薑根腐病(gingerrhizomerot)的一個字母r組成其代碼atr，又因該菌株是從土樣中分離的多株芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為2號的一株，因此將該菌株命名為枯草芽胞桿菌atr2(bacillussubtilisatr2)。
一種枯草芽胞桿菌菌株atr2的製備方法，其步驟是：
a、生薑根腐病拮抗菌分離與培養：稱取土樣0.1到0.2g加入到1ml的無菌水中，10倍梯度稀釋後塗布於luria-bertani瓊脂培養基後，再在平板上塗布108cfu/mlb.pumilusgr8。平板於30℃培養24h，挑選形成抑菌圈的平板，從抑菌圈內挑取目的細菌進行劃線，挑取單菌落接種於luria-bertani培養基上培養。重複該純化過程三次，獲得純化的單菌落，將這些分離的細菌接種在luria-bertani培養液中培養，28℃，180rpm，恆溫振蕩培養72h。收集發酵液，8000rpm，4℃離心10min；收集離心後上清液通過0.22μm濾膜過濾除菌，得到無菌上清液，4℃保存待用。該luria-bertani培養液(lb)的組成為：1％胰蛋白腖(重量/體積)0.5％酵母提取物(重量/體積)，1％nacl(重量/體積)，ph7.0。
b、生薑根腐病拮抗菌篩選：取150μl108cfu/mlb.pumilusgr8塗布在luria-bertani平板(60mm)表面，在每個平板中央輕輕放置1個無菌牛津杯(6mm×8mm×10mm)，待牛津杯自然沉降10分鐘後，向每個牛津杯中加入200μl上述所製備的無菌上清液樣品，然後將平板置入培養箱中，28℃，培養24h後，測量各個樣品的抑菌圈直徑。篩選到一株對生薑根腐病病原菌抑制效果較好的細菌菌株，取抗(anti-)的兩個字母at、生薑根腐病(gingerrhizomerot)的一個字母r組成其代碼atr，又因該菌株是從土樣中分離的多株芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為2號的一株，因此將該菌株命名為枯草芽胞桿菌atr2(bacillussubtilisatr2)。該luria-bertani培養液(lb)的組成為：1％胰蛋白腖(重量/體積)0.5％酵母提取物(重量/體積)，1％nacl(重量/體積)，ph7.0。獲得了一株抗生薑根腐病的枯草芽胞桿菌atr2。
該枯草芽胞桿菌atr2(bacillussubtilisatr2)已於2016年2月23日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc，湖北省武漢市武昌珞珈山)，保藏編號為cctccno.m2016071。
所述的枯草芽胞桿菌atr2(bacillussubtilisssp.atr2)中含有seqidno.1所示的核苷酸序列。
枯草芽孢桿菌atr2的具體特徵如下：
a.形態學特徵：枯草芽胞桿菌atr2的細胞形態為杆狀，產生橢圓形芽胞。
b.培養特徵：枯草芽胞桿菌atr2在luria-bertani瓊脂平板培養基中於28℃培養72小時後，形成圓盤狀菌落，菌落呈乳白色、邊緣不整齊、表面粗糙。
c.生化特性：枯草芽胞桿菌atr2的生理生化特徵如表一所示。
表一枯草芽胞桿菌atr2菌株的生理生化特徵
z+、–分別代表陽性和陰性反應。
d.分子生物學鑑定：以枯草芽胞桿菌atr2的基因組dna為模板，利用細菌16srdna的通用引物(27f:5-agagtttgatcctggctcag-3,1492r:5-tacggctaccttgttacgactt-3)用pcr技術按下列程序進行atr2的16srdna擴增：94℃變性5分鐘，然後94℃30秒,54℃1分30秒，72℃2分鐘，35個循環；最後72℃延伸7分鐘。pcr產物經過1％(重量/體積)瓊脂糖凝膠電泳，用dna膠回收試劑盒進行回收，回收的pcr產物測序。得到的atr2的16srdna(genebank:kp685408.1)列為seqidno.1所示的核苷酸序列。
該seqidno.1序列經ncbiblast生物學軟體比對分析表明，atr2的16srdna與枯草芽胞桿菌bacillussubtilisncdo1769的16srdna相似性最高，達98％。
綜合拮抗菌atr2的菌落形態特徵、顯微結構及16srdna序列分析結果，atr2屬於枯草芽胞桿菌(bacillussubtilis)。
e.生物活性：枯草芽胞桿菌atr2發酵液具有高效、廣譜的抗菌活性，對一些農業病原細菌和真菌以及醫學病原細菌均具有較強抗菌活性。對供試的幾種植物病原細菌和真菌及醫學病原細菌的抗菌活性見表二。
經室內毒力生物測定，枯草芽胞桿菌atr2發酵液對農業刺吸式害蟲蚜蟲和紅蜘蛛有較高毒殺作用，其發酵液使用24h後對蚜蟲的致死率達93.33％，發酵液10倍稀釋液使用48h後對紅蜘蛛的致死率達60.00％
表二atr2發酵上清液的抗菌譜
註：a「+」表明對相應菌株有抗菌活性，「-」表示對相應菌株無抗菌活性。
f.atr2活性物質理化性質：採用瓊脂擴散法測定atr2發酵上清液的熱穩定性。在60℃和80℃分別處理髮酵上清液2h後，其抑菌活性沒有明顯變化，100℃處理2h仍能保持較強的抑菌活性。由此可知，上清液中的抑菌活性物質具有較好的溫度耐受性。
使用酸鹼調節atr2發酵上清液的ph至設定值後，室溫放置2h，再調回到原ph，然後分別測定各處理上清液抑菌活性的變化。在ph4-ph10的範圍內，發酵上清液均保持較高的抑菌活性，ph值為2時活性略有所下降，但仍具有很強的抗菌活性。由此說明，上清液中抑菌活性成分具有較寬的ph耐受性。
使用200μg/ml的蛋白酶k於58℃水浴中處理atr2的發酵上清液2h後，其抑菌活性沒有顯著變化，說明上清液中的抑菌活性成分對蛋白酶k不敏感。使用20mg/ml的胰蛋白酶，37℃水浴處理上清液2h後，其抑菌活性沒有顯著變化，說明上清液中的抑菌活性成分對胰蛋白酶不敏感。由此說明，上清液中抑菌活性成分對常見的蛋白酶不敏感。
g.atr2活性物質純化及鑑定：atr2抗菌活性物質的純化首先通過酸沉澱法進行初步純化並對活性物質進行濃縮，通過薄層層析法進行進一步純化，最後通過高效液相色譜進行活性物質的分離。收集的活性峰，進一步通過lc-ms對抗菌活性物質進行鑑定。lc-ms結果表明，抗菌活性物質為一組分子量為1031，1045，1059，1073等相差一個亞甲基的同系物，通過二級質譜對其組成成分進行進一步分析，最終確定抗菌活性物質的組成，該抗菌活性物質為bacillomycind，屬於脂肽類伊枯草菌素家族。
atr2活性物質桿菌抗黴素d不僅對革蘭氏陽性細菌如短小芽胞桿菌等具有拮抗作用，而且對革蘭氏陰性細菌，如假結核耶爾森氏菌等也具有較強拮抗作用。
除了桿菌抗黴素，枯草芽胞桿菌atr2還可以產生一組分子量為1008，1022，1036等相差一個亞甲基的同系物，通過二級質譜對其組成成分進行進一步分析，最終確定該物質的組成，該物質為surfactin，屬於脂肽類表面活性素家族。
h.atr2發酵特性：菌株atr2易於培養，發酵性能優良，通過搖瓶發酵選擇最佳發酵配方，優化發酵條件，採用不同的含固量和不同的c/n比進行正交試驗，獲得菌株atr2的最佳培養基配方：1.5％玉米澱粉(重量/體積)，1.5％豆餅粉(重量/體積)，0.4％酵母浸粉(重量/體積)，0.5％蛋白腖(重量/體積)，0.5％葡萄糖(重量/體積)，0.2％k2hpo4(重量/體積)，0.04％mgso4，ph7.5。
一種枯草芽胞桿菌atr2在製備治療或預防生薑根腐病病原菌短小芽胞桿菌、人類醫學病原菌假結核耶爾森氏菌及炭疽芽胞桿菌、農業植物病原真菌的生物農藥及生物醫藥中的應用，其應用過程如下：
a：枯草芽孢桿菌atr2抗病原細菌的應用過程：
接種待測的病原細菌短小芽孢桿菌、假結核耶爾森氏菌及炭疽芽胞桿菌於luria-bertani培養液中培養，28℃，180rpm，12h，用無菌水將菌濃度稀釋到0.5麥氏濁度。分別取4ml上述濃度菌液與已溶化並冷卻至50℃左右的100ml的瓊脂培養基混合，搖勻後，將25ml該混合培養基加到無菌培養皿中，待瓊脂凝固後，用無菌打孔器(內徑10mm)打孔，每平板3孔，兩孔加入200μl的無菌上清液樣品，另一孔加無菌水作對照，然後將平板置入培養箱中，28℃，培養24h後，觀測抑菌效果。該試驗重複3次，每次設3個重複。
以上所述的病原細菌為生薑根腐病原菌短小芽孢桿菌、假結核耶爾森氏菌、炭疽芽胞桿菌。
b.枯草芽孢桿菌atr2抗農業病原真菌的應用過程：
接種待測的病原真菌於pda平板培養，28℃，48h，用無菌打孔器打取10mm菌餅，將上述菌餅接種於另一pda平板中央，在距離病原菌中心左右兩側2cm處，分別用無菌打孔器(內徑10mm)打孔，一孔加入200μl的無菌上清液樣品，另一孔加無菌水作對照。然後將平板置入培養箱中，28℃，培養至對照側真菌長滿平皿時，觀測抑菌效果。該試驗重複3次，每次設3個重複。
所述的病原真菌為黑麴黴、油菜灰黴及辣椒灰黴病原菌灰葡萄孢、甘蔗鳳梨病病原菌奇異長喙殼、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌。
一種枯草芽胞桿菌atr2在製備防治或預防農業刺吸式口器害蟲蚜蟲及紅蜘蛛等的生物農藥中的應用，其應用過程如下：
以蟲害嚴重的菜葉上的蚜蟲或紅蜘蛛作為試蟲，選取生長一致的植物葉片製成約6cm的葉段。先用毛筆挑取生理狀態一致的試蟲30頭於葉段上，葉段置於一平皿中，室溫放置3-5小時，待試蟲自然聚集於葉段上後，將該平皿置於小型噴霧器下進行噴霧，噴液量為2ml，藥液沉降1min後取出葉段，轉移至另一置有一張溼潤濾紙的塑料平皿中(平皿的上層蓋子制數個通氣小孔)，鋪上兩層衛生紙，蓋上平皿的上層蓋子。每處理設3個重複，並設不含藥液(ph7.4的pbs緩衝液)的處理作空白對照。將處理的試蟲置於溫度為(25±1)℃、光周期l：d＝(16：8)h條件下飼養和觀察。處理後48h檢查試蟲死亡情況，分別記錄總蟲數和死蟲數。根據實驗數據，計算處理的校正死亡率。
本發明與現有技術相比，具有以下優點和效果：
枯草芽胞桿菌atr2具有高效、廣譜的抗菌活性，對生薑根腐病病原菌短小芽胞桿菌、人類病原菌假結核耶爾森氏菌、炭疽芽胞桿菌、及多種植物病原真菌具有較強的抑制活性，其可產生多種抗菌活性物質如桿菌抗黴素d(bacillomycind)和表面活性素(surfactin)等，且抗菌活性物質具有較好的酸鹼及溫度耐受性，同時，該菌發酵液對農業刺吸式口器害蟲蚜蟲和紅蜘蛛等具有較強的毒殺作用，其發酵液使用24h後對蚜蟲的致死率達93.33％，發酵液10倍稀釋液使用48h後對紅蜘蛛的致死率達60.00％.。因此利用該菌株生產防治農業植物病蟲害、及人類醫學病原菌的生物製劑，能夠增加枯草芽胞桿菌產品的多樣化和系列化，擴大枯草芽胞桿菌製劑的使用範圍；作為一種植物根際促生菌，枯草芽胞桿菌不僅可以防蟲抗病，還可以促進植物生長；目前已有多種枯草芽胞投入市場並得到廣泛使用，其生產和使用成本低、對人、畜及動植物無害，不汙染環境，減少了化學農藥對環境的汙染。因而，從高效的防蟲抗病活性、對人和動植物安全、不汙染環境、生產和使用成本低及市場需求等方面考慮，枯草芽孢桿菌atr2具有良好的推廣應用前景。
具體實施方式
實施例1：
一種抗生薑根腐病的枯草芽胞桿菌的製備方法，其步驟如下：
a、生薑根腐病拮抗菌分離與培養：稱取土樣0.1到0.2g加入到1ml的無菌水中，10倍梯度稀釋後塗布於luria-bertani瓊脂培養基後，再在平板上塗布108cfu/mlb.pumilusgr8。平板於30℃培養24h，挑選形成抑菌圈的平板，從抑菌圈內挑取目的細菌進行劃線，挑取單菌落接種於luria-bertani培養基上培養。重複該純化過程三次，獲得純化的單菌落，將這些分離的細菌接種在luria-bertani培養液中培養，28℃，180rpm，恆溫振蕩培養72h。收集發酵液，8000rpm，4℃離心10min；收集離心後上清液通過0.22μm濾膜過濾除菌，得到無菌上清液，4℃保存待用。該luria-bertani培養液(lb)的組成為：1％胰蛋白腖(重量/體積)0.5％酵母提取物(重量/體積)，1％nacl(重量/體積)，ph7.0。
b、生薑根腐病拮抗菌篩選：取150μl108cfu/mlb.pumilusgr8塗布在luria-bertani平板(60mm)表面，在每個平板中央輕輕放置1個無菌牛津杯(6mm×8mm×10mm)，待牛津杯自然沉降10分鐘後，向每個牛津杯中加入200μl上述所製備的無菌上清液樣品，然後將平板置入培養箱中，28℃，培養24h後，測量各個樣品的抑菌圈直徑。篩選到一株對生薑根腐病病原菌抑制效果較好的細菌菌株，取抗(anti-)的兩個字母at、生薑根腐病(gingerrhizomerot)的一個字母r組成其代碼atr，又因該菌株是從土樣中分離的多株芽孢桿菌中篩選出來的、且編號為2號的一株，因此將該菌株命名為枯草芽胞桿菌atr2(bacillussubtilisatr2)。該luria-bertani培養液(lb)的組成為：1％胰蛋白腖(重量/體積)0.5％酵母提取物(重量/體積)，1％nacl(重量/體積)，ph7.0。獲得了一株抗生薑根腐病的枯草芽胞桿菌atr2。
該枯草芽胞桿菌atr2(bacillussubtilisssp.atr2)已於2016年2月23日保藏於中國典型培養物保藏中心(簡稱cctcc，湖北省武漢市武昌珞珈山)，保藏編號為cctccno.m2016071。所述的枯草芽胞桿菌atr2(bacillussubtilisssp.atr2)中含有seqidno.1所示的核苷酸序列。
實施例2：
一種枯草芽胞桿菌atr2在製備防治或預防農業刺吸式口器害蟲蚜蟲及紅蜘蛛等的生物農藥中的應用，其具體步驟如下：
以蟲害嚴重的菜葉上的蚜蟲或紅蜘蛛作為試蟲，選取生長一致的植物葉片製成約6cm的葉段。先用毛筆挑取生理狀態一致的試蟲30頭於葉段上，葉段置於一平皿中，室溫放置3-5小時，待試蟲自然聚集於葉段上後，將該平皿置於小型噴霧器下進行噴霧，噴液量為2ml，藥液沉降1min後取出葉段，轉移至另一置有一張溼潤濾紙的塑料平皿中(平皿的上層蓋子制數個通氣小孔)，鋪上兩層衛生紙，蓋上平皿的上層蓋子。每處理設3個重複，並設不含藥液(ph7.4的pbs緩衝液)的處理作空白對照。將處理的試蟲置於溫度為(25±1)℃、光周期l：d＝(16：8)h條件下飼養和觀察。處理後48h檢查試蟲死亡情況，分別記錄總蟲數和死蟲數。根據實驗數據，計算處理的校正死亡率。
所述的農業刺吸式口器害蟲具體為蚜蟲、紅蜘蛛。
實施例3：
一種枯草芽胞桿菌atr2在製備治療或預防生薑根腐病病原菌短小芽胞桿菌、人類醫學病原菌(假結核耶爾森氏菌、炭疽芽胞桿菌)、農業植物病原真菌(黑麴黴、油菜灰黴及辣椒灰黴病原菌灰葡萄孢、甘蔗鳳梨病病原菌奇異長喙殼、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌)的生物農藥及生物醫藥中的應用，其應用過程如下：
a：枯草芽孢桿菌atr2抗病原細菌的應用過程：
接種待測的病原細菌短小芽孢桿菌、假結核耶爾森氏菌及炭疽芽胞桿菌於luria-bertani培養液中培養，28℃，180rpm，12h，用無菌水將菌濃度稀釋到0.5麥氏濁度。分別取4ml上述濃度菌液與已溶化並冷卻至50℃左右的100ml的瓊脂培養基混合，搖勻後，將25ml該混合培養基加到無菌培養皿中，待瓊脂凝固後，用無菌打孔器(內徑10mm)打孔，每平板3孔，兩孔加入200μl的無菌上清液樣品，另一孔加無菌水作對照，然後將平板置入培養箱中，28℃，培養24h後，觀測抑菌效果。該試驗重複3次，每次設3個重複。
所述的病原細菌為生薑根腐病病原菌短小芽孢桿菌、假結核耶爾森氏菌、炭疽芽胞桿菌。
b：枯草芽孢桿菌抗病原真菌的應用過程：
接種待測的病原真菌於pda平板培養，28℃，48h，用無菌打孔器打取10mm菌餅，將上述菌餅接種於另一pda平板中央，在距離病原菌中心左右兩側2cm處，分別用無菌打孔器(內徑10mm)打孔，一孔加入200μl的無菌上清液樣品，另一孔加無菌水作對照。然後將平板置入培養箱中，28℃，培養至對照側真菌長滿平皿時，觀測抑菌效果。該試驗重複3次，每次設3個重複。
所述的病原真菌為黑麴黴、油菜灰黴及辣椒灰黴病原菌灰葡萄孢、甘蔗鳳梨病病原菌奇異長喙殼、油菜炭疽病病原菌十字花科炭疽刺盤孢菌、香蕉枯萎病病原菌尖孢鐮刀菌。
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中國科學院武漢病毒研究所
一種枯草芽胞桿菌atr2及製備方法和應用
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