一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法
2024-04-05 02:04:05 1
一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法
【專利摘要】本發明公開了一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法，將30克陶粒放入組培瓶中，加植物營養液40mL至剛好沒過陶粒，將生防菌浸種處理過的催芽的辣椒種子定植在陶粒上，待辣椒長至四片真葉，在營養液面以下接種5mL調整濃度為105mL-1的遊動孢子懸浮液。遊動孢子懸浮液由辣椒疫黴菌在CA培養基上間歇光照處理6~8天後低溫誘導得到。應用範圍為以辣椒疫病為靶標的生防菌的篩選等。本發明的方法操作簡單，從育苗到接種周期短，遊動孢子接種便於實施和觀察，在植物病害的生物防治研究工作中具有實際的指導意義。
【專利說明】一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於農業植物保護【技術領域】，涉及多種農作物疫病流行病的篩選方法，更具體的說是一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法。
【背景技術】
[0002]辣椒疫病是由辣椒疫黴菌從ora capsici Leonian)引起的一種世界性土傳病害，在各辣椒產區均有發生。其病原菌除危害辣椒外，也可侵染西葫蘆、黃瓜、南瓜、茄子、番茄等20多種作物。該病害1918年首次在美國新墨西哥州報導，現已在全世界普遍發生。我國最初由愈大紱於20世紀60年代在江蘇發現此病，至今辣椒疫病已在新疆、河北、黑龍江、貴州、廣州、甘肅、雲南、上海和陝西等省(市)發生危害。除我國外，在法國、澳大利亞、韓國以及印度等國均有發生。近年來隨著保護地辣椒種植面積的增加以及辣椒在各主產區的連茬種植，辣椒疫病的發生有逐年加重的趨勢。由於辣椒疫病流行，露地和保護地均發生，常導致植株成片死 亡損失嚴重，一般田塊株發病率20%~30%，發病田塊達70%以上，嚴重地影響了辣椒的產量，給農民造成了巨大的損失。
[0003]辣椒疫黴菌(/%_7(0/7況力ora capsici Leonian)主要以卵孢子、厚垣孢子在植株病殘體、土壤或種子中越冬，可存活2~3年，成為來年病害的初侵染源。越冬後的病菌經雨水或澆水時反濺而傳到辣椒莖基部或葉片、果實上引起發病，尤其是大雨後天氣突然轉晴，氣溫急劇上升病害極易發生流行。病菌生長發育適溫30°C，最高38°C，最低8°C。一般田間溫度25~28°C，相對溼度高於85%的情況下最利於該菌的侵染。病菌從侵入到發病，潛育期不過3~4天，病葉上產生的孢子囊隨灌水、氣流等傳到寄主各部位，又可傳播為害，不斷引起再侵染，造成病害的流行。目前尚無有效防治辣椒疫病的抗病品種，生產上防治主要是以化學藥劑為主。但是由於長期使用化學藥劑，P.capsici已對大多數常用農藥產生了不同程度的抗藥性，由於土壤吸附和微生物降解作用，使用化學藥劑防治疫病效果不佳，而且化學農藥的大量、高頻使用帶來嚴重的環境和農產品中農藥殘留問題。據報導，我國已有多個地區利用自然界有益微生物對植物病害進行生物防治，防治效果較好。長期以來，辣椒疫病的生物防治工作進展緩慢，其中辣椒疫病生防菌的篩選困難是制約辣椒疫病研究的瓶頸之一。為了順利進行辣椒疫病生物防治的研究，關鍵是尋求一種針對辣椒疫病生防菌高效的篩選方法。因此，研究一種高效、簡便、可行的以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法成為辣椒疫病生物防治以及種農作物疫病流行病篩選工作的重要保障。
【發明內容】
[0004]通常的生防菌株篩選採用的是室內盆栽試驗或者田間小區試驗兩種方法，這兩種方法從試驗準備、試驗設計及試驗實施三方面來講要求較高，而且周期長。本發明以辣椒疫病為靶標的生防菌株篩選方法，採用無土栽培方法，陶粒(又稱陶化營養土)作為基質，組培瓶作容器試驗用品價格低廉、便於買到且可重複使用，節約了試驗成本；種植要求簡單，遊動孢子接種便於實施和觀察，周期短，篩選高效。[0005]為實現上述目的，本發明公開了如下的技術方案:
一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法，其特徵在於，包括如下步驟:
(I)種子消毒:將所需數目的辣椒種子用無菌水衝洗一遍，然後先後用75%的酒精和5%的NaClO分別處理30s和5min，選育辣椒品種為改良8819線椒，由青縣鈺禾蔬菜育種中心提供(對外有售)。
[0006](2)種子催芽:將消毒處理的種子於無菌水中浸泡4h，後放入鋪有溼紗布的培養皿中，25°C的培養箱中避光48h催芽至露白；
(3)基質滅菌:將30克陶粒放入組培瓶中，高度為組培瓶高度的1/3，加植物營養液40mL至剛好沒過陶粒，用封瓶膜封好。溼熱滅菌，121°C，30min;其中，陶粒直徑疒8 mm，購買於曹莊子花卉市場。組培瓶高100 mm，口徑50 mm，外徑60 mm，購買於天津市津百順實驗設備有限公司；
所述的植物營養液的配製:1升去離子水中加磷酸銨0.22克、硝酸鉀1.05克、硫酸銨和硝酸銨各0.16克、硫酸亞鐵0.01克，混勻即為營養液；
(4)生防菌浸種:用挑針挑取拮抗細菌菌株的單菌落，轉移至裝有50mL LB細菌培養液的三角瓶中，於37°C、150r.mirT1震蕩培養18 h製成拮抗菌液(調整拮抗菌液菌含量為1.0X IO8 cfu 將已催芽的種子浸入拮抗菌液浸種30 min ;所述的拮抗細菌菌株指的是從蔬菜根際土壤中分離出來後通過平板拮抗實驗篩選的對辣椒疫黴拮抗效果較好的菌株，來源:由天津市植物保護研究所農業微生物發酵研究室提供(對外可以免費提供)。LB細菌培養液指的是=LB細 菌培養液的製備:1升去離子水中加蛋白腖10克，酵母浸膏5克，NaCl 5 克。
[0007](5)定植:將已處理的種子用鑷子均勻點入滅菌基質中，每瓶點8粒種子，封上封瓶膜，放入人工氣候箱培養，人工氣候箱參數設置為:溫度為26°C，溼度為50%，光照16h，黑暗8h ;滅菌基質指的是步驟(3)中的陶粒；
(6)營養液的添加:每周檢查營養液的消耗情況，營養液的添加(指的是上面提到的植物營養液)以不沒過種子為宜；
(7)遊動孢子製備:將辣椒疫黴菌接種在CA培養基(胡蘿蔔培養基)上，間歇光照處理61天後，鏡檢孢子囊數量，當鏡檢視野中有大量孢子囊時，向培養皿中加10 mL無菌自來水，於4°C放置lh，隨後室溫光照Ih誘導遊動孢子釋放，然後用消毒毛筆刷洗培養基表面，四層滅菌紗布過濾，收集遊動孢子懸浮液，鏡檢遊動孢子數量，調整接種濃度為IO5 mL-1 ；
所述的辣椒疫黴菌指的是:由天津市植物保護研究所植病生防室提供(對外可以免費提供)。
[0008]所述的CA培養基指的是胡蘿蔔培養基。製備方法為:將200克胡蘿蔔切片，加500mL去離子水，勻漿機將打碎，雙層紗布過濾，加去離子水補至I升，加20克瓊脂，每瓶100 mL分裝，滅菌備用。
[0009](8)病原菌接種:定植28天後待辣椒長出四片真葉，將移液槍頭插入營養液面以下接種5 mL調整濃度為IO5 mL—1的遊動孢子懸浮液，為了利於辣椒疫病的發生，接種後人工氣候箱參數設置為:溫度為28°C，溼度為70%，光照8h，黑暗16h。接種後第3、5天調查發病情況。
[0010]本發明更加詳細的描述如下:一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法，包括如下步驟:
(I)種子消毒:將所需數目的辣椒種子，例如選育由青縣鈺禾蔬菜育種中心提供的辣椒品種為改良8819線椒作為辣椒種子。用無菌水衝洗一遍，然後先後用75%的酒精和5%的NaClO分別處理30s和5min。
[0011](2)種子催芽:將消毒處理的種子於無菌水中浸泡4h，後放入鋪有溼紗布的培養皿中，25°C的培養箱中避光48h催芽至露白。
[0012](3)基質滅菌:將30克陶粒放入組培瓶中，高度大約為組培瓶高度的1/3，加植物營養液40mL至剛好沒過陶粒，用封瓶膜封好。溼熱滅菌，121 °C，30min。其中，陶粒直徑2~8mm，購買於曹莊子花卉市場。組培瓶高100 mm，口徑50 mm，外徑60 mm，購買於天津市津百順實驗設備有限公司。植物營養液的配製:I升去離子水中加磷酸銨0.22克、硝酸鉀1.05克、硫酸銨和硝酸銨各0.16克、硫酸亞鐵0.01克，混勻即為營養液。
[0013](4)生防菌浸種:用挑針挑取拮抗細菌菌株的單菌落，轉移至裝有50 mLLB細菌培養液的三角瓶中，於37°C、150r.mirT1震蕩培養18 h製成拮抗菌液(調整菌含量為
1.0XlO8 cfu.ml/1),將已催芽的種子浸入拮抗菌液浸種30 min。
[0014](5)定植:將已處理的種子用鑷子均勻點入滅菌基質中，每瓶點8粒種子，封上封瓶膜，放入人工氣候箱培養。人工氣候箱參數設置為:溫度為26°C，溼度為50%，光照16h，黑暗8h。
[0015](6)營養液的添加:每周檢查營養液的消耗情況，營養液的添加以不沒過種子為且。
[0016](7)遊動孢子製備:將辣椒疫黴菌接種在CA培養基(胡蘿蔔培養基)上，間歇光照處理61天後，鏡檢孢子囊數量。當鏡檢視野中有大量孢子囊時，向培養皿中加10 mL無菌自來水，於4°C放置lh，隨後室溫光照Ih誘導遊動孢子釋放，然後用消毒毛筆刷洗培養基表面，四層滅菌紗布過濾，收集遊動孢子懸浮液，鏡檢遊動孢子數量，調整接種濃度為IO5mL、
[0017](8)病原菌接種:定植28天後待辣椒長出四片真葉，將移液槍頭插入營養液面以下接種5 mL調整濃度為IO5 mL—1的遊動孢子懸浮液。為了利於辣椒疫病的發生，接種後人工氣候箱參數設置為:溫度為28°C，溼度為70%，光照8h，黑暗16h。接種後第3、5天調查發病情況。
[0018]本發明公開的以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法與現有技術相比所具有的積極效果在於:
(I)節約成本，環保。本發明中所用到的組培瓶及陶粒均可無限多次重複使用，汙染少，保護環境。
[0019](2)篩選速度快。辣椒疫黴遊動孢子接種環境溼度為100%，陶粒空隙大，有利於遊動孢子侵染，加快辣椒疫病的發生，提高了篩選效率。
[0020](3)篩選效率高。本發明所涉及的試驗空間小，無土栽培辣椒生長快，辣椒疫病發生快，每批次可做多個生防菌株的篩選，大大提高了生防菌的篩選效率。
[0021]【具體實施方式】:
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。拮抗細菌菌株指的是從蔬菜根際土壤中分離出來後通過平板拮抗實驗篩選的對辣椒疫黴拮抗效果較好的菌株，來源:由天津市植物保護研究所農業微生物發酵研究室提供(對外可以免費提供)；陶粒、改良8819線椒、組培瓶均有市售。
[0022]實施例1:
一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法:
(1)種子消毒:將所需數目的辣椒種子用無菌水衝洗一遍，然後先後用75%的酒精和5%的NaClO分別處理30s和5min，選育辣椒品種為改良8819線椒；
(2)種子催芽:將消毒處理的種子於無菌水中浸泡4h，後放入鋪有溼紗布的培養皿中，25°C的培養箱中避光48h催芽至露白；
(3)基質滅菌:將30克直徑2mm陶粒放入組培瓶中，陶粒高度為組培瓶高度的1/3，加植物營養液40mL，用封瓶膜封好；溼熱滅菌，12rC,30min ;組培瓶高100 mm, 口徑50 mm，外徑 60 mm ；
(4)生防菌浸種:用挑針挑取拮抗細菌菌株的單菌落，轉移至裝有50 mL LB細菌培養液的三角瓶中，於37°C、150r.min—1震蕩培養18 h製成含量為1.0XlO8 cfu.mL-1拮抗菌液，將已催芽的種子浸入拮抗菌液浸種30 min ;所述的LB細菌培養液指的是:I升去離子水中加蛋白腖10克，酵母浸膏5克，NaCl 5克；
(5)定植:將已處理的種子用鑷子均勻點入步驟(3)滅菌基質中，每瓶點8粒種子，封上封瓶膜，放入人工氣候箱培養，人工氣候箱參數設置為:溫度為26°C，溼度為50%，光照16h，黑暗 8h ；
(6)植物營養液的添加:每周檢查營養液的消耗情況，植物營養液的添加以不沒過種子為宜；
(7)遊動孢子製備:將辣椒疫黴菌接種在CA培養基上，間歇光照處理6天後，鏡檢孢子囊數量，當鏡檢視野中有大量孢子囊時，向培養皿中加10 mL無菌自來水，於4°C放置lh，隨後室溫光照Ih誘導遊動孢子釋放，然後用消毒毛筆刷洗培養基表面，四層滅菌紗布過濾，收集遊動孢子懸浮液，鏡檢遊動孢子數量，調整接種濃度為IO5 mL-1 ；
所述的CA培養基指的是胡蘿蔔培養基，其配方為:將200克胡蘿蔔切片，加500 mL去離子水，勻漿機將打碎，雙層紗布過濾，加去離子水補至I升，加20克瓊脂，每瓶100 mL分裝，滅菌備用；
(8)病原菌接種:定植28天後待辣椒長出四片真葉，將移液槍頭插入營養液面以下接種5 mL調整濃度為IO5 mL—1的遊動孢子懸浮液，接種後人工氣候箱參數設置為:溫度為28°C，溼度為70%，光照8h，黑暗16h，接種後第3、5天調查發病情況。所述的植物營養液的配製:1升去離子水中加磷酸銨0.22克、硝酸鉀1.05克、硫酸銨和硝酸銨各0.16克、硫酸亞鐵0.01克。
[0023]實施例2
一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法:
(1)種子消毒:將所需數目的辣椒種子用無菌水衝洗一遍，然後先後用75%的酒精和5%的NaClO分別處理30s和5min，選育辣椒品種為改良8819線椒；
(2)種子催芽:將消毒處理的種子於無菌水中浸泡4h，後放入鋪有溼紗布的培養皿中，25°C的培養箱中避光48h催芽至露白；
(3)基質滅菌:將30克直徑8mm陶粒放入組培瓶中，組培瓶高100 mm，口徑50 mm，外徑60mm。陶粒高度為組培瓶高度的1/3，加植物營養液40mL，用封瓶膜封好；溼熱滅菌，121 °C，30min ;所述的植物營養液的配製:1升去離子水中加磷酸銨0.45克、硝酸鉀1.25克、硫酸銨和硝酸銨各0.45克、硫酸亞鐵0.02克。
[0024](4)生防菌浸種:用挑針挑取拮抗細菌菌株的單菌落，轉移至裝有50 mL LB細菌培養液的三角瓶中，於37°C、150r.min—1震蕩培養18 h製成含量為1.0XlO8 cfu.mL-1拮抗菌液，將已催芽的種子浸入拮抗菌液浸種30 min ;所述的LB細菌培養液指的是:I升去離子水中加蛋白腖10克，酵母浸膏5克，NaCl 5克；
(5)定植:將已處理的種子用鑷子均勻點入步驟(3)滅菌基質中，每瓶點8粒種子，封上封瓶膜，放入人工氣候箱培養，人工氣候箱參數設置為:溫度為26°C，溼度為50%，光照16h，黑暗 8h ； (6)植物營養液的添加:每周檢查營養液的消耗情況，植物營養液的添加以不沒過種子為宜；
(7)遊動孢子製備:將辣椒疫黴菌接種在CA培養基上，間歇光照處理61天後，鏡檢孢子囊數量，當鏡檢視野中有大量孢子囊時，向培養皿中加10 mL無菌自來水，於4°C放置lh，隨後室溫光照Ih誘導遊動孢子釋放，然後用消毒毛筆刷洗培養基表面，四層滅菌紗布過濾，收集遊動孢子懸浮液，鏡檢遊動孢子數量，調整接種濃度為IO5 mL-1 ；
所述的CA培養基指的是胡蘿蔔培養基，其配方為:將200克胡蘿蔔切片，加500 mL去離子水，勻漿機將胡蘿蔔片打碎，雙層紗布過濾，加去離子水補至I升，加20克瓊脂；
每瓶100 mL分裝，滅菌備用；
(8)病原菌接種:定植28天後待辣椒長出四片真葉，將移液槍頭插入營養液面以下接種5 mL調整濃度為IO5 mL—1的遊動孢子懸浮液，接種後人工氣候箱參數設置為:溫度為28°C，溼度為70%，光照8h，黑暗16h，接種後第3、5天調查發病情況。
[0025]實施例3 實際應用情況
室內測定7株自篩生防菌對辣椒疫病防治效果。
[0026]辣椒疫黴菌立枯絲核菌(TPAizoc5.ο^3/?Υ)、番爺灰黴菌ciflerea)及瓜果腐黴菌O0FiAiaw aphaniderma turn )四種土傳病害病原菌由天津市植物保護研究所植病生防室提供(對外可以免費提供)。
[0027]7 個自篩菌株(TB1309、TB1312、TB1317、TB1321、TB1335、TB 1340, TB 1348)
的製備方法如下:
(1)從天津、河北、山東、山西、福建、河南及江蘇等地蔬菜根際土壤中分離細菌I萬餘
株;
(2)篩選出對辣椒疫黴菌{Phytophthoracapsici)有明顯拮抗作用的細菌802株；
(3)進一步用立枯絲核菌iRhizoctoniasolani )、番爺灰黴菌iBotrytis cinerea)及瓜果腐黴菌O0FiAiwffi aphani derma turn )為祀標篩選出對以上病原真菌有較好拮抗作用的菌株62株；
(4)從62株菌株中挑選對四種病原菌拮抗效果均好的7株:TB1309、TB1312、TB1317、TB1321、TB1335、 TBI340, TBI348?
[0028]試驗選取對辣椒疫黴菌iPhytoph thora capsici )、立枯絲核菌{Rhizoc toniasolani )、番爺灰黴菌 iBo tryti s cinerea )及瓜果腐黴菌 iiythi um aphani derma turn )四種土傳病害病原菌拮抗效果均較好的7個自篩菌株(TB1309、TB1312、TB1317、TB1321、TB1335、TB 1340, TB1348)進行辣椒疫病防治效果測定。
[0029]對照菌株選取生防枯草芽孢桿菌B579，由天津市植物保護研究所植病生防研究室提供(對外可以免費提供)；
CKl:既不接種生防菌也不接種病原菌；
陽性對照CK2:只接種病原菌，不接種生防菌。每個處理10瓶辣椒幼苗。
[0030]具體步驟:
(I)種子消毒:將800粒改良8819線椒種子(由青縣鈺禾蔬菜育種中心提供)用無菌水衝洗一遍，然後先後用75%的酒精和5%的NaClO分別處理30s和5min。
[0031](2)種子催芽:將消毒處理的種子置於無菌水中浸泡4h，後放入鋪有溼紗布的培養皿中，25 0C的培養箱中避光48h催芽至露白。
[0032](3)基質滅菌:準備100個組培瓶，每瓶放入30克陶粒，高度大約為組培瓶高度的1/3，加植物營養液40mL至剛好沒過陶粒，封瓶膜封好。溼熱滅菌，121°C，30min。其中，陶粒直徑2~8 mm不等，購買於天津市曹莊子花卉市場。組培瓶高100 mm, 口徑50 mm，外徑60mm，購買於天津市津 百順實驗設備有限公司。營養液的配製:1升去離子水中加磷酸銨0.22克、硝酸鉀1.05克、硫酸銨和硝酸銨各0.16克、硫酸亞鐵0.01克，混勻即為營養液。
[0033](4)生防菌浸種:用挑針挑取拮抗細菌菌株的單菌落，轉移至裝有50 mLLB細菌培養液的三角瓶中，於37°C、150r.mirT1震蕩培養18 h製成拮抗菌液(調整菌含量為
1.0XlO8 cfu.ml/1),將已催芽的種子浸入拮抗菌液浸種30 min。
[0034](5)定植:將已處理的辣椒種子用鑷子均勻點入滅過菌的基質中，每瓶點8粒種子，封上封瓶膜，放入人工氣候箱培養。人工氣候箱參數設置為:溫度為26°C，溼度為50%，光照16h，黑暗8h。定植28天後待辣椒長出四片真葉，即可做病原菌接種試驗。
[0035](6)植物營養液的添加:每周檢查植物營養液的消耗情況，營養液的添加以不沒過種子為宜。
[0036](7)遊動孢子製備:將辣椒疫黴菌接種在CA培養基(胡蘿蔔培養基)上，間歇光照處理61天後，鏡檢孢子囊數量。當鏡檢視野中有大量孢子囊時，向培養皿中加10 mL無菌自來水，於4°C放置lh，隨後室溫光照Ih誘導遊動孢子釋放，然後用消毒毛筆刷洗培養基表面，四層滅菌紗布過濾，收集遊動孢子懸浮液，鏡檢遊動孢子數量，調整接種濃度為IO5mL、
[0037](8)病原菌接種:定植28天後待辣椒長出四片真葉，每瓶選取5棵長勢一致的辣椒苗做防效試驗。將移液槍頭插入營養液面以下接種5 mL調整濃度為IO5 mL—1的遊動孢子懸浮液。為了利於辣椒疫病的發生，接種後人工氣候箱參數設置為:溫度為28°C，溼度為70%，光照8h，黑暗16h。接種後第3、5天調查發病情況。
[0038]表1拮抗菌株對辣椒疫病盆栽防治效果
【權利要求】
1.一種以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法，其特徵在於按如下的步驟進行: (1)種子消毒:將所需數目的辣椒種子用無菌水衝洗一遍，然後先後用75%的酒精和5%的NaClO分別處理30s和5min，選育辣椒品種為改良8819線椒； (2)種子催芽:將消毒處理的種子於無菌水中浸泡4h，後放入鋪有溼紗布的培養皿中，25°C的培養箱中避光48h催芽至露白； (3)基質滅菌:將30克直徑2~8mm陶粒放入組培瓶中，陶粒高度為組培瓶高度的1/3，加植物營養液40mL，用封瓶膜封好；溼熱滅菌，12rC,30min ； (4)生防菌浸種:用挑針挑取拮抗細菌菌株的單菌落，轉移至裝有50mL LB細菌培養液的三角瓶中，於37°C、150r.min—1震蕩培養18 h製成含量為1.0XlO8 cfu.mL-1拮抗菌液，將已催芽的種子浸入拮抗菌液浸種30 min ;所述的LB細菌培養液指的是:I升去離子水中加蛋白腖10克，酵母浸膏5克，NaCl 5克； (5)定植:將已處理的種子用鑷子均勻點入步驟(3)滅菌基質中，每瓶點8粒種子，封上封瓶膜，放入人工氣候箱培養，人工氣候箱參數設置為:溫度為26°C，溼度為50%，光照16h，黑暗 8h ； (6)植物營養液的添 加:每周檢查植物營養液的消耗情況，植物營養液的添加以不沒過種子為宜； (7)遊動孢子製備:將辣椒疫黴菌接種在CA培養基上，間歇光照處理61天後，鏡檢孢子囊數量，當鏡檢視野中有大量孢子囊時，向培養皿中加10 mL無菌自來水，於4°C放置Ih,隨後室溫光照Ih誘導遊動孢子釋放，然後用消毒毛筆刷洗培養基表面，四層滅菌紗布過濾，收集遊動孢子懸浮液，鏡檢遊動孢子數量，調整接種濃度為IO5 mL-1 ； 所述的CA培養基指的是胡蘿蔔培養基，其配方為:將200克胡蘿蔔切片，加500 mL去離子水，勻漿機將胡蘿蔔片打碎，雙層紗布過濾，加去離子水補至I升，加20克瓊脂，每瓶100 mL分裝，滅菌備用； (8)病原菌接種:定植28天後待辣椒長出四片真葉，將移液槍頭插入營養液面以下接種5 mL調整濃度為IO5 mL—1的遊動孢子懸浮液，接種後人工氣候箱參數設置為:溫度為28°C，溼度為70%，光照8h，黑暗16h，接種後第3、5天調查發病情況。
2.權利要求1所述以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法，其中步驟(3)所述的植物營養液的配製:1升去離子水中加磷酸銨0.22、.45克、硝酸鉀1.05^1.25克、硫酸銨和硝酸銨各0.16~0.45克、硫酸亞鐵0.01~0.02克。
3.權利要求2所述以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法，其中步驟(3)所述的組培瓶高100 mm，口徑50 mm,外徑60 mm。
4.權利要求3所述的以辣椒疫病為靶標的生防菌株高效篩選方法在提高多種農作物疫病流行病篩選方面的應用。
5.權利要求4所述的應用，其中的多種農作物指的是辣椒、西葫蘆、黃瓜、南瓜、茄子、番爺疫病流行病篩選方面的應用。
【文檔編號】C12R1/645GK103981249SQ201410247409
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月6日 優先權日:2014年6月6日
【發明者】田濤, 孫冰冰, 李偉, 魏軍 申請人:天津市植物保護研究所