針對所有植物防病、促生、抗逆的解澱粉芽胞桿菌Y15及其應用的製作方法
2024-04-05 07:03:05
本發明屬於植物保護領域，涉及針對所有植物防病、促生、抗逆的解澱粉芽胞桿菌Y15及應用。
背景技術：
中國是農業大國,我國作物(包括蔬菜、果樹、中藥材、糧食作物等)生產總面積已超過22億畝,為世界農業發展做出了巨大貢獻。但是，我國亦是病蟲害多發、頻發和重發大國，病蟲害與水災、旱災並稱為我國三大自然災害。聯合國糧農組織估計，我國每年病蟲害引起的農作物損失達700億-900億元，其中病害佔33％，作物病害正日趨成為限制我國農林業生產可持續發展的重要因素。
植物病害主要包括土傳病害以及地上部病害。植物土傳病害通常引起植物根部乃至全株性的病症,其發生和流行通常屬於積年流行病害，如引發紋枯、枯萎、黃萎、立枯、猝倒、根腐、青枯、軟腐、根結線蟲、胞囊線蟲、根腫等病害。地上部病害主要危害葉片、莖幹、果實等地上部位，主要是藉助氣流和人們的農事活動從溫室外面傳入外，如縮葉病、霜黴病、炭疽病、銹病、灰黴病、病毒病等。這些病害病原物都有寄主範圍廣、抗逆性強、難以根除等特點。
不良環境包括乾旱、洪澇、高溫、寒冷等惡劣天氣，均會對草本作物的生長產生不良影響。20世紀90年代，中國平均每年受旱面積為2733萬hm2，糧食因旱減產量與總產量之比達到了4.7％。而且每年因澇漬災害損失糧食62.3億kg,年均經濟損失46.7億元。高溫、寒冷等天氣亦會對作物生產造成嚴重損害。增加草本作物抵抗外界不良環境能力受到了國內外研究者的高度重視，目前有效的方法非常少。
利用土壤有益微生物來控制病害的發生以及誘導提高作物抗逆能力是近些年來研究的熱點，尤其這些微生物對環境無汙染，引起了科學家們利用生物防治手段控制病害、以及應對不良環境的興趣。解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一種與枯草芽孢桿菌親緣性很高的細菌，在其自身的生長過程中可以產生一系列的代謝產物，這些代謝產物使得解澱粉芽胞桿菌能夠具有廣泛地抑制真菌和細菌的活性，或者誘導植物抗性。因此，近些年大量學者在對解澱粉芽胞桿菌的新發現與新應用以及基因功能研究和發酵條件的優化做了大量的探索。它可以不同方式或途徑影響植物的許多代謝過程，增加植物根長，改變植物根系形態建成，促進根系對水份和營養元素的吸收，解澱粉芽胞桿菌可以提高植物的抗病能力，抵抗病原菌的侵染，以及抗逆能力，增強植物應對寒冷、鹽分、乾旱等環境的脅迫。
解澱粉芽胞桿菌在自然界中分布十分廣闊，同時能夠對多種真菌與細菌產生抑制作用，並且具有豐富的自身代謝產物。因此，在生物防治方面具有廣闊的應用前景，可以適當的代替傳統的化學農藥。同時，隨著分子研究技術的提高，解澱粉芽胞桿菌的基因功能更多地被了解，增加可應用的可行性。以及發酵條件的優化使得解澱粉芽胞桿菌的大規模應用也具備了客觀條件。
技術實現要素：
本發明的目的是針對現有防治植物病害以及抵抗不良環境技術的不足，提供一種綠色環保的能提高廣譜植物防病、促生、抗逆的解澱粉芽胞桿菌Y15。
本發明的目的可通過如下技術方案實現：
針對廣譜植物的防病、促生、抗逆的解澱粉芽胞桿菌Y15，該菌株分類命名為解澱粉芽胞桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)，於2016年11月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.13327。
本發明所述的解澱粉芽胞桿菌Y15在製備廣譜性植物防病、促生、抗逆的製劑中的應用；優選在水果、蔬菜、糧油作物等農作物，菊等園藝花卉，以及鐵皮石斛等中藥材等所有植物上的病害、促進其生長及提高品質、提高其抗逆性的製劑中的應用。所述的解澱粉芽孢桿菌Y15進一步優選在防治西瓜細菌性果斑病、番茄黃化曲葉病毒病、桃樹縮葉病，或促進西瓜、番茄、黃瓜、水稻、空心菜、菊花、鐵皮石斛生長，提高其品質；提高番茄抗旱性中的應用。用本發明所述的針對多種植物防病、促生、抗逆的解澱粉芽胞桿菌Y15製備的菌劑。
所述的的菌劑優選通過以下方法製備得到：
解澱粉芽胞桿菌Y15在LB培養液中28℃180rpm振蕩培養12-16h，然後6000rpm離心10min得到菌體，用滅菌水將菌體進行稀釋製成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×109-1×1010CFU/mL。
本發明所述的菌劑的製備方法，其特徵在於包括以下步驟：
解澱粉芽胞桿菌Y15在LB培養液中28℃180rpm振蕩培養12-16h，然後6000rpm離心10min得到菌體，用滅菌水將菌體進行稀釋製成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×109-1×1010CFU/mL。
本發明所述菌劑在草本植物防病、促生抗逆中的應用；優選在水果、蔬菜、糧油作物等農作物，菊等園藝花卉，以及鐵皮石斛等中藥材等所有植物上的病害、促進其生長及提高品質、提高其抗逆性的製劑中的應用。
所述的由解澱粉芽孢桿菌Y15製備的菌劑在防治西瓜細菌性果斑病、番茄黃化曲葉病毒病、桃樹縮葉病，或促進西瓜、番茄、黃瓜、水稻、空心菜、菊花、鐵皮石斛生長，提高其品質；提高番茄抗旱性中的應用。
所述的菌劑優選通過灌根處理進行應用。
有益效果
本發明利用對環境無毒害的微生物菌劑防治廣譜性植物土傳病害以及地上部病害(尤其是防治西瓜果斑病)，提供了一種綠色環保的解澱粉芽胞桿菌菌劑，防治優選在水果、蔬菜、糧油作物等農作物，菊等園藝花卉，以及鐵皮石斛等中藥材等所有植物上的土傳病害和地上部病害，促進上述各類作物的生長並提高品質和提高其抗逆性(包括抗旱、抗寒、耐熱、耐澇等，抵抗倒春寒等不良氣候)。解決了化學藥劑等其它方法效果不佳或者有殘留等問題，保護環境，促進農業可持續發展。
該製劑對解澱粉芽胞桿菌Y15灌根處理後對多種植物病害生防效果達到52.17％以上，，作用十分明顯；且對植物的株高以及根長有明顯地提高，對植株具有一定的促生作用，經Y15處理的農田作物與對照組相比，增產超53.99％。該解澱粉芽胞桿菌菌劑，可室溫保存6個月-1年。解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的植物田間防病促生試驗結果表明，對病害防效高達52.17％，增產效果超過53.99％。
附圖說明
圖1、解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑處理對作物病害的生防效果
圖2、解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑處理對作物生物量的影響
圖3、解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑處理對作物抗逆性的影響
生物保藏
解澱粉芽胞桿菌Y15，為解澱粉芽胞桿菌Bacillus amyloliquefaciens，於2016年11月22日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，菌種保藏號為CGMCC NO.13327,地址：北京市朝陽區北辰西路1號院中科院微生物研究所。
具體實施方式
實施例1解澱粉芽胞桿菌菌株Y15的分子學鑑定
Y15由浙江梨園根圍土壤中分離得到。
細菌基因組試劑盒(賽百盛公司)提取細菌基因DNA後，用gyrB通用引物gyrB1(5'–GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3')；gyrB2R(5'–AGCAGGATACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3')從基因組DNA中擴增出gyrB基因片段。具體擴增體系及程序(25ul)如下：引物1、2(10μM)各1μl；Mix:12.5μl；Taq:0.5μl。ddH2O:10μl；模板:1μl。94℃預變性5min，94℃變性1min，56℃退火2min，72℃延伸2min，35個循環，72℃延伸10min，4℃保存。PCR擴增產物用1％瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，90V，30min；EB染色30min，檢測擴增產物。擴增產物純化後連接到pMD19-T載體，轉化於Escherichia coli DH5α，提取陽性克隆質粒，委託TaKaRa公司測序，提交NCBI(National Center for Biotechnology Information)進行比對。比對結果顯示該菌株與Bacillus amyloliquefaciens相似度為100％，故金鼎味解澱粉芽孢桿菌。
實施例2
解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑的製備方法如下：
解澱粉芽胞桿菌Y15在LB培養液中28℃180rpm振蕩培養12-16h，然後6000rpm離心10min得到菌體，用滅菌水將菌體進行稀釋製成菌劑，菌劑成品中活菌總濃度為1×109-1×1010CFU/mL。
實施例3解澱粉芽胞桿菌Y15溫室促生試驗
方法：將參試西瓜、番茄、黃瓜種子用10％H2O2表面消毒10min，無菌水洗淨後晾乾備用。每個營養缽播種10粒種子。正常澆水管理4周後，將長勢一致的苗移栽至330ml塑料杯中，移栽時將懸浮好的解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑以1.0×107CFU/mL的濃度灌根施用於作物根部，每株30mL量。然後置於溫室中培養，28℃，70％相對溼度。以清水處理作為對照，每組處理48株苗，隨機放置，共重複三次。30d後測定西瓜、番茄、黃瓜植株株高、莖粗、鮮重、乾重等生物量。
將參試水稻、空心菜種子用10％H2O2表面消毒10min，無菌水洗淨後晾乾備用。將水稻、空心菜種子用1.0×107CFU/mL的濃度的解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑浸種5min。再在每個營養缽(高13cm，直徑9cm)播種4粒種子，出苗後(7d)，將懸浮好的解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑以1.0×107CFU/mL的濃度灌根施用於作物根部，每株30mL量。以清水處理作為對照。每組處理48株苗，隨機放置，共重複三次。接種30d後測定水稻、空心菜植株株高、莖粗、鮮重、乾重等生物量。
將參試的菊花從宿根(老根)萌發的新枝上剪取長12cm的嫩梢作為插條，從節基部削平，切去基部的兩片大葉，再將上部的葉子修去一半(減少水分蒸發，防止插條萎蔫)即可扦插至盆缽中(直徑9cm，高13cm)。將懸浮好的解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑以1.0×107CFU/mL的濃度灌根施用於作物根部，每株30mL量。以清水處理作為對照。每組處理48株苗，隨機放置，共重複三次。接種30d後測定植株株高、莖粗、鮮重、乾重等生物量。
生物量增加(％)＝(處理組植株乾重-對照植株乾重)/對照植株乾重×100％
如表1、2、3、4、5、6所示，解澱粉芽胞桿菌Y15能夠顯著促進茄科番茄、葫蘆科西瓜、黃瓜，水稻，葉類蔬菜空心菜，菊花的生長，表現在作物的鮮重乾重，莖長，莖粗與對照相比，都有顯著的增加，結果計算得解澱粉芽胞桿菌Y15對茄科番茄、葫蘆科西瓜、黃瓜，水稻，葉類蔬菜空心菜，菊花的生物量增加分別達到27.87％、12.93％、29.70％、40.00％、23.08％、43.90％。
表1解澱粉芽胞桿菌Y15對西瓜生物量的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
表2解澱粉芽胞桿菌Y15對番茄生物量的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
表3解澱粉芽胞桿菌Y15對黃瓜生物量的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
表4解澱粉芽胞桿菌Y15對水稻生物量的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
表5解澱粉芽胞桿菌Y15對空心菜生物量的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
表6解澱粉芽胞桿菌Y15對菊花生物量的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
實施例4解澱粉芽胞桿菌Y15溫室大棚對細菌性病害防效試驗
方法：將參試西瓜種子用10％H2O2表面消毒10min，無菌水洗淨後晾乾備用。
將催芽後的西瓜種子播種於裝有無菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播種前保持土壤較為乾燥。待西瓜長到6葉期時，將懸浮好的解澱粉芽胞桿菌Y15生防菌劑以1.0×107CFU/mL的濃度灌根施用於作物根部，隨後置於溫室中培養，28℃，70％相對溼度以上，16/8h光周期。待接種生防菌5天後，進行病原菌的接種，接種濃度為107CFU/ml，採用手動式噴器將該菌成霧狀噴施於葉片的表面，使葉片溼潤而菌液又恰好不流下來，接種前所有植株均未發病，接種病原菌3天後，開始發病並統計其發病率，並計算防效。
西瓜細菌性果斑病葉片分級標準:(Ofir Bahar(2009))
發病率統計(病情統計)：
0級:不發病；
1級:病葉上有零星病斑，病斑佔葉面積的10％以下；
2極:病葉上有少量病斑，病斑佔葉面積的11％～25％；
3級:病葉上病斑數量中等，病斑佔葉面積的26％～50％；
4級:病葉上病斑數量較多，病斑佔葉面積的51％～75％；
5級:病葉上有許多病斑，病斑佔葉面積的76％～90％；
6級：病葉上有大量病斑，病斑佔葉面積90％以上；
病害嚴重度％＝[Σ(病級株數×代表級數)/植株總數×最高代表級值]×100％；
防效％＝(對照發病率－處理防病率)/對照發病率×100％.
試驗結果顯示，解澱粉芽胞桿菌Y15能夠顯著降低西瓜細菌性果斑病的發病率，其平均防效達50.17％。
表7.解澱粉芽胞桿菌Y15對西瓜細菌性果斑病的防效
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
實施例5解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的防治病毒病試驗
方法：將番茄種子(上海合作903)表面消毒(70％無水乙醇浸泡1～2min，0.05％次氯酸鈉溶液浸泡10min，滅菌水衝洗6次)，播種於育苗穴盤中並放置於28℃，16/8h光周期、70％相對溼度的溫室中進行培育。待番茄苗長到3～4葉期時(25d)進行移栽。將番茄苗移栽至裝滿基質的盆缽中，每缽一株，置於條件為28℃、16/8h光周期、70％相對溼度的溫室內培育。番茄移栽當日進行生防菌第一次灌根處理，灌根處理菌液濃度約為5×107CFU/mL，每株苗用量為30mL，緩慢澆灌於番茄根部，同時進行噴霧處理，菌液濃度為5×107CFU/mL，按照0.01％的終濃度加入表面活性劑吐溫-20，對番茄葉片均勻噴霧。番茄移栽7d後進行病毒接種。接種方法為：將沒有攜帶TYLCV的煙粉蝨在表現TYLCD症狀的番茄植株上飼養48h，然後將待接種的健康植株移至粉蝨溫室內，每株番茄30頭左右，接種3d後使用吡蟲啉除去煙粉蝨，將各處理移至防蟲溫室(28℃，16/8h光周期，70％相對溼度)中(Sade D,Eybishtz A,Gorovits R,et al.A developmentally regulated lipocalin-like gene is overexpressed in tomato yellow leaf curl virus-resistant tomato plants upon virus inoculation，and its silencing abolishes resistance[J].Plant Molecular Biology.2012,80:273-287.)。以清水處理作為空白對照，每個處理48株苗，3次重複。病毒接種40d左右，統計病情。
番茄黃化曲葉病毒病病情指數分級標準(Friedmann M,Lapidot M,Cohen S,et al.A novel source of resistance to tomato yellow leaf curl virus exhibiting a symptomLess reaction to viral infection[J].Journal of the American Society for Horticultural Science.1998,123:1004-1007.)：
0級：無症狀；
1級：頂部葉片輕度黃化，葉邊緣輕度捲曲，花期花輕度脫落；
2級：頂部葉片中度黃化，葉邊緣中度捲曲褶皺，花期花輕度脫落，結果期產量輕度減產；
3級：葉片嚴重黃化，捲曲，褶皺，花期花中度脫落，結果期產量中度減產；
4級：大面積葉片嚴重畸形縮小，植株生長緩慢，明顯矮化，花期花嚴重脫落，結果期產量嚴重減收或絕產。
病害嚴重度％＝[∑(發病植株數×病級數)/(總植株數×最高病級數)]×100；
生防效果％＝[(對照病害嚴重度－處理病害嚴重度)/對照病害嚴重度]×100
試驗結果顯示，解澱粉芽胞桿菌Y15能夠顯著降低番茄黃化曲葉病毒病的發病率，其平均防效達47.05％。
表8解澱粉芽胞桿菌Y15對番茄黃化曲葉病毒病的防效
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
實施例6解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的防治果樹病害及提高果實產量試驗
方法：選擇3年生桃樹，於上年秋季施基肥時，當年初春長出新葉時以及開花前採用1.0×107CFU/mL濃度的解澱粉芽孢桿菌Y15菌劑澆灌於處理組根部，共3次。每處理選擇100顆桃樹，同時設置清水對照組。於當年夏季桃樹採收期對桃樹縮葉病發病率進行統計，並對果實產量以及品質進行調查。
發病率％＝[發病植株數/調查總植株數]×100；
生防效果％＝[(對照病發病率－處理髮病率)/對照病發病率]×100
試驗結果顯示，解澱粉芽胞桿菌Y15能夠顯著降低桃樹縮葉病的病害嚴重度，其平均防效達57.40％；並且能夠顯著提高產量以及品質。
表9解澱粉芽胞桿菌Y15對桃樹縮葉病的防效
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
表10解澱粉芽胞桿菌Y15對桃樹果實生物量的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
實施例7解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的中藥材溫室促生長試驗
選取前期準備的已生長約45d的鐵皮石斛組培苗為材料。在無菌的超淨臺內,在每株鐵皮石斛組培苗基部接種1.0×107CFU/mL濃度的解澱粉芽孢桿菌Y15菌劑1mL,所有實驗組培苗進行(25±1)℃恆溫光照培養,每天連續光照12h,光照強度為2000lx。定期觀察各組培苗的生長狀況,90d後,觀察組培苗的葉片數、株高、莖粗等,比較實驗組與對照組的組培苗生長長勢,判斷菌株的促生效果。
結果顯示，解澱粉芽胞桿菌Y15能夠顯著促進鐵皮石斛的生長並且提高其有效成分含量。
表11解澱粉芽胞桿菌Y15對鐵皮石斛生長的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。
實施例8解澱粉芽胞桿菌Y15菌劑處理的誘導抗逆性試驗
方法：將參試番茄種子用10％H2O2表面消毒10min，無菌水洗淨後晾乾備用。
將催芽後的番茄種子播種於裝有無菌土壤中盆砵中，每盆一粒，播種前保持土壤較為乾燥。待番茄長到6葉期時，將懸浮好的解澱粉芽胞桿菌Y15生防菌劑以1.0×107CFU/mL的濃度灌根施用於作物根部，隨後置於溫室中培養，1個月後進行斷水乾旱，乾旱脅迫持續15d，乾旱脅迫後正常澆水，觀察番茄幼苗的恢復生長情況。每組處理48株苗，隨機放置，共重複3次。在溫室中按照完全隨機區組設計擺放。
澆水進行恢復生長1d後，解澱粉芽胞桿菌Y15處理組植株恢復正常生長，而對照組植株全部死亡。
表12解澱粉芽胞桿菌Y15對番茄耐旱性的影響
註：不同小寫字母者表示在0.05水平上差異顯著。