大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標及其lamp引物組合物和應用的製作方法
2024-03-30 14:22:05 2
大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標及其lamp引物組合物和應用的製作方法
【專利摘要】本發明屬於基因工程領域，公開了大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標及其特異性LAMP引物組合物和應用。大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef-α，核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，該靶標序列特異性的LAMP引物組合物，正向內引物FIP如SEQ?ID?NO.2所示，反向內引物BIP如SEQ?ID?NO.3所示，正向外引物F3如SEQ?ID?NO.4所示，反向外引物B3如SEQ?ID?NO.5所示。本發明的檢測體系在LAMP擴增條件下，能快速、高效、高特異、高靈敏地檢測到大豆南方莖潰瘍病菌，用于田間檢疫、進出口檢疫等的現場檢測，易於大範圍推廣應用。
【專利說明】大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標及其LAMP引物組合物和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於基因工程領域，涉及大豆擬莖點種腐病菌的檢測靶標及其PCR引物組合物和應用。
【背景技術】
[0002]大豆南方莖潰瘍[Diaporthephaseolorum(Cke.&E11.) Sacc.var.meridional isMorgan-Jones (簡稱DPM)]是我國重點關注的大豆上13種檢疫性病原菌之一 [1]。該病害於1973年在美國首次報導，20世紀80年代在美國廣泛傳播，已遍及美國南部各省，某地區損失高達100%，目前分布在巴西、玻利維亞、巴拉圭、美國和阿根廷，並且疫區還在不斷擴大，是國外大豆生產上重要病害，經濟影響很大[2，3]。 [0003]目前，我國尚沒有DPM發生危害的報導。該病菌可通過種子和病殘體遠距離傳播，並且抗逆性很強，病殘體在_15°C~_18°C下可存活14個月。中國大豆產區具有和疫區類似的氣候條件，一旦傳入我國大豆產區，將對我國的大豆生產產生嚴重影響。
[0004]因其近年來在國外發生普遍、經濟影響大、傳入風險高且在我國尚未有發生的報導。為了阻止大豆南方莖潰瘍病菌傳播範圍的不斷擴大，使大豆南方莖潰瘍得到控制，需要對其進行快速、準確地檢測。
[0005]環介導等溫擴增法(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP),是有日本的榮研株式會社的Notomi等人於2000年開發的一種新型的核酸擴增方法，其特點是針對靶基因的6個區域設計4條特異性引物，在鏈置換DNA酶(Bst DNA polymerase)的作用下，60~65°C恆溫擴增，15~60min即可觀察結果，效率可達IO9~IOltl個數量級，具有操作簡單、特異性強、產物易檢測等特點。在DNA合成時，從脫氧核酸三磷酸基質(dNTPs)中析出的焦磷酸根離子與反應溶液中的鎂離子反應，產生大量焦磷酸鎂沉澱，呈現白色。因此，可以把渾濁度作為反應的指標，只用肉眼觀察白色渾濁沉澱，就能鑑定擴增與否，而不需要繁瑣的電泳和紫外觀察。由於LAMP反應不需要PCR儀和昂貴的試劑，反應產物可通過是否形成白色沉澱(渾濁)或SYBR GREEN I染色後的顏色變化來判斷是否反應。隨著技術的不斷完善和發展，會在食品檢測臨床疾病診斷等領域有著廣泛的應用前景&6]。
【發明內容】
[0006]本發明的目的在於提供一種大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl-Ci。
[0007]本發明的另一目的是提供該大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl-Ci的其特異性LAMP引物組合物。
[0008]本發明的又一目的是提供該大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl-Ci及其特異性LAMP引物組合物的應用。
[0009]本發明的目的可通過如下技術方案實現:
[0010]大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl- a，核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。[0011]所述的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl在檢測或鑑定大豆南方莖潰瘍病菌中的應用。
[0012]針對所述的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tef設計的特異性LAMP引物組合物，其特徵在於包括正向內引物FIP如SEQ ID N0.2所示，反向內引物BIP如SEQ ID N0.3所示，正向外引物F3如SEQ ID N0.4所示，反向外引物B3如SEQ ID N0.5所示。
[0013]所述的針對所述的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl-Ci設計的特異性LAMP引物組合物在檢測或鑑定大豆南方莖潰瘍病菌中的應用。
[0014]一種用於檢測大大豆南方莖潰瘍病菌的LAMP檢測試劑盒，包含所述的特異性的LAMP引物組合物。
[0015]所述的用於檢測大豆南方莖潰瘍病菌的LAMP檢測試劑盒，包含:由20mM正向內引物FIP、20mM反向內引物BIP, IOmM正向外引物F3、10mM反向外引物B3,10%10xThermoPolReaction Buffer,50mM MgSO4UOmMdNTP Mixture、5M 甜菜鹼、8000U/mLBst DNAPolymerase Large fragment及超純水組成的檢測溶液。
[0016]一種檢測大豆南方莖潰瘍病菌的方法，提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模板，利用所述的特異性的LAMP引物組合物進行LAMP反應；擴增產物加入SYBR GREEN I染料，在常光和/或紫外光下檢測結果，如果反應產物在常光下變顯黃色、在紫外光下產生強烈螢光，則表示存在大豆南方莖潰瘍病菌，在常光下顯橙色、紫外光下無螢光產生則表示不含該病菌。
[0017]所述的檢測大豆南方莖潰瘍病菌的方法優選提取待檢微生物的DNA，取IDNA溶液，加入19.5 ill所述的檢測溶液和2.5 ill滅菌去離子水進行LAMP反應，LAMP反應程序為:64°C 70min。
[0018]有益效果:
[0019]本發明提供了一個新的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl-Ci，並分析該靶標序列Tefl- a和其他近似種病菌在序列上的差異，設計了 4條特異性的LAMP引物，在此基礎上建立了檢測大豆南方莖潰瘍病菌的LAMP反應體系。本發明的檢測體系在LAMP擴增條件下，能快速、高效、高特異、高靈敏地檢測到大豆南方莖潰瘍病菌，具有優異的種間特異性、種內通用性以及靈敏度，能很好滿足目前對大大豆南方莖潰瘍病菌的現場檢測的迫切需要，用于田間檢疫、進出口檢疫等的現場檢測，易於大範圍推廣應用。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1實施例2大豆南方莖潰瘍病菌種間特異性試驗常光照射圖
[0021]其中，I號、2號為大豆南方莖潰瘍病菌不同菌株,3號、4號為大豆北方莖潰瘍病菌不同菌株，5~7號為擬莖點種腐病菌不同菌株，8號為陰性對照。
[0022]圖2實施例2大豆南方莖潰瘍病菌種間特異性試驗紫外光照射圖
[0023]其中，I號、2號為大豆南方莖潰瘍病菌不同菌株,3號、4號為大豆北方莖潰瘍病菌不同菌株，5~7號為擬莖點種腐病菌不同菌株，8號為陰性對照。
[0024]圖3實施例3大豆南方莖潰瘍病菌屬間特異性試驗常光光照射圖
[0025]其中，I號、2號為大豆南方莖潰瘍病菌不同菌株，3號為大豆鏽菌，4號為膠胞炭疽菌，5號為平頭炭疽菌，6號為稻瘟菌，7號為鏈格孢菌，8號為球黑孢菌，9號為大豆疫黴菌，10號為菜豆殼球孢菌，11號為米麴黴菌，12號為菊池尾孢菌，13號為油瓶黴菌，14號為丁香疫黴菌，15號為薴麻疫黴，16號為陰性對照。
[0026]圖4實施例3大豆南方莖潰瘍病菌屬間特異性試驗紫外光照射圖
[0027]其中，1號、2號為大豆南方莖潰瘍病菌不同菌株，3號為大豆鏽菌，4號為膠胞炭疽菌，5號為平頭炭疽菌，6號為稻瘟菌，7號為鏈格孢菌，8號為球黑孢菌，9號為大豆疫黴菌，10號為菜豆殼球孢菌，11號為米麴黴菌，12號為菊池尾孢菌，13號為油瓶黴菌，14號為丁香疫黴菌，15號為薴麻疫黴，16號為陰性對照。
[0028]圖5實施例4大豆南方莖潰瘍病菌靈敏度試驗常光照射圖
[0029]LAMP擴增不同濃度大豆南方莖潰瘍病菌基因組DNA ;從左到右分別為25 μ L的反應體系中分別含有lOOng、10ng、lng、lOOpg、10pg、lpg、100fg、1Ofg大豆南方莖潰瘍病菌DNA的LAMP擴增結果。LAMP擴增反應能特異性地識別大豆南方莖潰瘍病菌，圖片表示靈敏度能夠達到1ng/μ L。
[0030]圖6實施例4大豆南方莖潰瘍病菌靈敏度試驗紫外光照射圖
[0031]LAMP擴增不同濃度大豆南方莖潰瘍病菌基因組DNA ;從左到右分別為25 μ L的反應體系中分別含有100ng、10ng、lng、100pg、10pg、lpg、100fg、1Ofg大豆擬莖點種腐病菌DNA的LAMP擴增結果。LAMP擴增反應能特異性地識別大豆南方莖潰瘍病菌，圖片表示靈敏度能夠達到1OOpg/μ L。
[0032]圖7感病大豆植株LAMP檢測試驗常光、紫外光照射圖
[0033]其中I為大豆南方莖潰瘍病菌標準菌株基因組，2-7為接種大豆南方莖潰瘍病菌菌株6天後的大豆植株基因組，8為接種空白PDA培養基6天後的大豆植株基因組，9為健康大豆植株基因組，10為陰性對照。上一排為常光照射圖，下一排為紫外光照射圖。
【具體實施方式】
[0034]實施例1
[0035]一種用於檢測大豆南方莖潰瘍病菌的LAMP檢測試劑盒，包含:由20mM正向內引物FIP、20mM反向內引物BIP，1OmM正向外引物F3、10mM反向外引物B3，10%10xThermoPoIReaction Buffer、50mM MgSO4、IOmMdNTP Mixture、5M 甜菜喊、8000U/mLBst DNA Polymerase Large fragment,加入超純水製備成檢測溶液。各組分的濃度表示其在檢測溶液中的終濃度。
[0036]實施例2大豆南方莖潰瘍病菌種間特異性試驗
[0037]為了驗證LAMP方法的特異性，選擇大豆南方莖潰瘍病菌標準菌株(ATCC&200236?)與大豆南方莖潰瘍病菌同種的大豆北方莖潰瘍病菌以及同屬不同種的大豆擬莖點種腐病菌的DNA作為模板，取3 μ IDNA溶液，加入19.5 μl實施例1所述的檢測溶液和
2.5 μl滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為:64°C 70min ;擴增產物加入SYBR GREENI染料，在常光和紫外光下檢測，結果如圖1和圖2所示。圖1顯示特異性引物特異性地識別大豆南方莖潰瘍病菌，含有大豆南方莖潰瘍病菌的樣品(I號和2號管)會在常光下變成黃色，而其他種(3~7號管)和陰性對照(8號管)在常光下變成橙色；圖2顯示含有大豆南方莖潰瘍病菌的樣品(I號和2號管)在紫外光下產生強烈突光，而其他種(3~7號管)和陰性對照(8號管)在紫外光下不產生螢光，這表明本發明建立的LAMP檢測方法具有很高的種間特異性。
[0038]實施例3大豆南方莖潰瘍病菌屬間特異性試驗
[0039]為了驗證LAMP方法的特異性，選擇大豆南方莖潰瘍病菌標準菌株與大豆南方莖潰瘍病菌不同屬的菌(大豆鏽菌；膠胞炭疽菌；平頭炭疽菌；稻瘟菌；鏈格孢菌；球黑孢菌；大豆疫黴菌；菜豆殼球孢菌；米麴黴菌；菊池尾孢菌)的DNA作為模板，取3 μ lDNA溶液，加入19.5 μ l實施例1所述的檢測溶液和2.5 μl滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為:640C 70min ;擴增產物加入SYBR GREEN l染料，在常光、紫外光下檢測，結果如圖3和4所示。結果顯示特異性引物特異性地識別大豆南方莖潰瘍病菌，含有大豆南方莖潰瘍病菌的樣品(1號和2號管)在常光下變成黃色，紫外光下產生強烈突光；而其他種(3~15號管)在常光下變成橙色，紫外光下也不產生螢光，陰性對照(16號)在常光下變成橙色，紫外光下也不產生螢光，這表明本發明建立的LAMP檢測方法具有很高的屬間特異性。
[0040]實施例4大豆南方莖潰瘍病菌靈敏度試驗
[0041 ] 為了確定LAMP檢測方法的靈敏度，將提取的標準大豆南方莖潰瘍病菌菌株DNA用分光光度計測定濃度(1 μ g/ μ l)後用DEPC水進行10倍比稀釋，_70°C保存作為模板。分別取10倍比稀釋後的各濃度DNA稀釋液3 μ l作為模板，加入19.5 μ l實施例1所述的檢測溶液和2.5 μ l滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為:64°C 70min ;擴增產物加入SYBRGREEN I染料，在常光和紫外光下檢測，結果如圖5和圖6所示，1~3管在常光下變成黃色，紫外光下產生強烈螢光，表明本發明方法的靈敏度為lng/uL。
[0042]實施例5感病大豆植株LAMP檢測試驗
[0043]用NaOH鹼裂解法提取6株接種大豆南方莖潰瘍病菌6天後的大豆植株的DNA，將其作為模板用於LAMP擴增，將大豆南方莖潰瘍病菌標準菌株DNA作為陽性對照，健康植株DNA和滅菌水取代DNA擴增作為陰性對照。取3uLDNA溶液，加入19.5 μ l實施例1所述的檢測溶液和2.5 μ l滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為:64°C 70min。擴增產物加入SYBR GREEN I染料，在常光和紫外光下檢測，結果如圖7所示，顯示本方法能夠從接種大豆南方莖潰瘍病菌的大豆植株(2~7號管)在常光下變成黃色,紫外光下產生強烈突光,能夠特異性地檢測出大豆南方莖潰瘍病菌，效果和直接檢測大豆南方莖潰瘍病菌(1號管)DNA沒有差別，而接種空白PDA培養基6天後的大豆植株(8號管)、健康植株(9號管)和陰性對照滅菌水(10號管)則在常光下變成橙色，紫外光下也不產生螢光，可見本方法可以用于田間檢測(圖7)。
[0044]參考文獻
[0045]1.吳品珊，嚴進(2003)值得關注的大豆新病害.植物檢疫17:226 - 228.[0046]2.Backman P, Weaver D, Morgan - Jones G (1985) Soybean stem canker: anemerging disease problem.Plant Disease69:641 - 647.[0047]3.Pioli RN, Morandi ENj Martinez MCj Lucca Fj Tozzini A，et al.(2003)Morphologic,molecular, and pathogenic characterization of Diaporthephaseolorum variability in the core soybean - producing area of Argentina.Phytopathology93:136 - 146.[0048]4.Notomi Tj Okayama H，Masubuchi Hj Yonekawa Tj Watanabe K，et al.(2000)Loop - mediated isothermal amplification of DNA.Nucleic Acids Res28:E63.[0049]5.Mori Y，Nagamine K，Tomita N，Notomi T (2001) Detection of loop -mediatedisothermal amplification reaction by turbidity derived from magnesiumpyrophosphate formation.Biochem Biophys Res Commun289:150 - 154.
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【權利要求】
1.大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl-a，其特徵在於核苷酸序列如SEQIDN0.1所示。
2.SEQ ID N0.1所示的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl-a在檢測或鑑定大豆南方莖潰瘍病菌中的應用。
3.針對權利要求1所述的大豆南方莖潰瘍病菌的檢測靶標序列Tefl-a設計的特異性的LAMP引物組合物，其特徵在於包括正向內引物FIP如SEQ ID N0.2所示，反向內引物BIP如SEQ ID N0.3所示，正向外引物F3如SEQ ID N0.4所示，反向外引物B3如SEQ ID N0.5所示。
4.權利要求3所述的特異性的LAMP引物組合物在製備檢測或鑑定大豆南方莖潰瘍病菌的試劑中的應用。
5.一種用於檢測大大豆南方莖潰瘍病菌的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於包含權利要求3所述的特異性的LAMP引物組合物。
6.根據權利要求5所述的用於檢測大豆南方莖潰瘍病菌的LAMP檢測試劑盒，其特徵在於所述的試劑盒包含:由20mM正向內引物FIP、20mM反向內引物BIP，IOmM正向外引物F3、IOmM 反向外引物 B3,10%10xThermoPol Reaction Buffer>50mM MgSO4、IOmMdNTP Mixture、5M甜菜鹼、8000U/mLBst DNA Polymerase Large fragment及超純水組成的檢測溶液。
7.—種檢測大豆南方莖潰瘍病菌的方法，其特徵在於提取待檢微生物的DNA，以提取的DNA為模板，利用權利要求3所述的特異性的LAMP引物組合物進行LAMP擴增反應；擴增產物加入SYBR GREEN I染料，在常光和/或紫外光下檢測結果，如果反應產物在常光下變顯黃色、在紫外光下產生強烈螢光，則表示存在大豆南方莖潰瘍病菌，在常光下顯橙色、紫外光下無突光產生則表不不含·該病菌。
8.根據權利要求7所述的檢測大豆南方莖潰瘍病菌的方法，其特徵在於提取待檢微生物的DNA，取3 ill DNA溶液，加入19.5 權利要求6所述的檢測溶液和2.5 滅菌去離子水進行LAMP反應，反應程序為:64°C 70min ;增產物加入SYBR GREEN I染料，在紫外光下檢測結果，如果反應產物產生強烈螢光，則表示存在大豆南方莖潰瘍病菌，無螢光產生則表示不含該病菌。
【文檔編號】C12Q1/04GK103710440SQ201310686657
【公開日】2014年4月9日 申請日期:2013年12月13日 優先權日:2013年12月13日
【發明者】鄭小波, 沈浩, 戴婷婷, 王源超, 張海峰 申請人:南京農業大學