牛支原體專用快速培養基及牛支原體的分離純化方法與流程

2024-03-31 04:36:05

本發明屬於動物疫病病原快速診斷領域，尤其是一種牛支原體專用快速培養基及牛支原體的分離純化方法。

背景技術：

牛支原體（Mycoplasmabovis）是感染肉牛和奶牛一種重要的病原微生物，1961年牛支原體首次在美國患有乳腺炎的牛乳中被分離到。牛支原體是一種能夠導致牛發生多種疾病，且感染率極高的重要病原微生物，可以導致牛發生肺炎、關節炎、乳房炎、結膜炎、懷孕母牛流產、生殖器感染等多種疾病，臨床上牛支原體病例多與各種病毒、細菌、寄生蟲的混合感染。隨著經濟不斷的發展和運輸條件的改善，牛隻在國與國、地區與地區之間的交易規模不斷的再增加，該病相繼傳播到南美、歐洲及中東等地區，在世界多個國家和地區，牛支原體已經成為一種重要的病原並在多個國家和地區流行，對肉牛和奶牛產業造成重大影響。牛支原體對畜牧業生產造成嚴重的經濟損失，尤其在北美和歐洲，在美國由於牛支原體引起的疾病每年所造成的損失高達1.40億美元，在歐洲每年由於牛支原體引起的犢牛肺炎約為25 %～33 %，而在美國2015年最新的報告中顯示，近幾年，牛支原體對澳大利亞和美國乳製品和牛肉行業造成巨大的經濟損失，且在逐年遞增，牛支原體現階段不僅引起常見的肺炎，而且引起成年泌乳奶牛的隱形乳房炎和臨床型乳房炎比例也在逐年增多，在臨床型乳房炎病例中，由牛支原體引起的比例已從2003年的3.9 %上升到現在的14.4 %，在鮮乳中牛支原體檢出率也在逐年增高。1983年黎濟申在我國首次報導了從乳房炎牛乳中分離得到牛支原體，此後我國關於牛支原體的報導極少。2008年湖北省相繼報導從肉牛和犢牛肺臟中分離到牛支原體，此後重慶、貴州、新疆、寧夏等全國多個省市報導肉牛和奶牛發生牛支原體疾病,至今，全國所有省、自治區都有關於牛支原體疾病和流行病學的相關報導。這表明牛支原體在我國傳播速度快，傳播範圍廣。牛支原體生長時所需要的營養物質主要靠外界攝取獲得，因為牛支原體自身生物合成及代謝能力有限，,因此牛支原體對體外培養基的選擇相當苛刻，關於牛支原體的PCR等診斷技術都需要獲得牛支原體的純培養物及牛支原體典型的油煎蛋樣菌落，而現有牛支原體培養基抑制雜菌能力弱，培養效率低，培養時間長，容易汙染、易產生誤診和漏診。因此, 為了儘早控制該病在我國的流行，本領域函需高效穩定、快速分離診斷牛支原體的培養基以及分離純化牛支原體的方法,進而開展牛支原體感染的診斷、治療與防控研究。

技術實現要素：

本發明提供了一種成本相對較低的牛支原體培養基，該牛支原體培養基能夠用來較為快速的分離純化牛支原體，蛋白含量高、生長效率高；本發明亦提供了一種應用該培養基分離純化牛支原體的方法，便於快速診斷牛支原體。

本發明為實現上述目的採用的方案為：牛支原體培養基，包括牛支原體液體培養基和牛支原體固體培養基，所述牛支原體液體培養基由以下成分組成：超純水、10%醋酸鉈溶液、PPLO肉湯、滅活馬血清、25%酵母浸出液、青黴素、葡萄糖、丙酮酸鈉、脫氧核糖核苷酸鈉、牛心湯、牛肺消化液和0.4%酚紅。

作為優選，所述牛支原體液體培養基由以下組分組成：10%醋酸鉈溶液1-2.5mL/L、PPLO肉湯20-23g、滅活馬血清100-120mL/L、25%酵母浸出液90-110 mL/L、青黴素200-300萬單位、葡萄糖1-1.2g、丙酮酸鈉1.8-2.1g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1-0.3g、牛心湯150-170 mL/L、牛肺消化液100-120 mL/L和0.4%酚紅 4.3-4.6 mL/L，剩餘體積用超純水補夠。

最優選，所述牛支原體液體培養基由以下組分組成：10%醋酸鉈溶液1mL/L、PPLO肉湯21g、滅活馬血清100mL/L、25%酵母浸出液200mL/L、青黴素300萬單位、葡萄糖1g、丙酮酸鈉2g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1g、牛心湯150 mL/L、牛肺消化液100 mL/L和0.4%酚紅 4.5 mL/L，剩餘體積用超純水補夠

作為優選,所述酵母浸出液的製備方法為:將250g鮮酵母溶於1000 mL超純水，攪拌均勻，充分溶解後煮沸15min，快速冷卻，4000r/min離心15min，提取上清液，再煮沸15min，快速冷卻，用K型澄清濾極過濾，再用0.22um無菌濾膜過濾除菌，置4℃保存備用。

採用上述方法製備得到的酵母浸出液具備以下優點: 攪拌均勻增加了鮮酵母的溶解性，使用K型澄清濾極過濾的浸出液顏色為淡黃色，儘量避免對培養基渾濁度的幹擾，使用0.22um無菌濾膜過濾除菌避免了高溫高壓滅菌法對浸出液成份的破壞。

作為優選，所述牛心湯的製備方法為：將提出勁健的牛心攪碎，稱取500g混合均勻放入4℃冰箱24h，出去血液和浮油，用紗布包裹隔，加水1000 mL煮沸半小時，使肉渣完全凝結成塊並擠壓收集全部濾液，使用0.8um濾膜，加水補足1000mL，加入蛋白腖5g，NaCl 0.8g，磷酸鹽0.6g，溶解後校正Ph值7.6-7.8，使用0.22um無菌濾膜過濾除菌，分裝後-20℃保存備用。

作為優選，所述牛肺消化液的製備方法為：將健康的牛肺攪碎，稱取600 g放入2 L燒杯，加入1 L超純水，在電爐上加熱至80 ℃並不斷攪拌。再加入8 g/L 碳酸鈉溶液1 L並攪拌，冷卻至45℃後加入12 g胰酶溶液，在45 ℃條件下水浴3 h，過一會攪拌一次並不斷除去液面油脂，邊攪拌邊加入16 mL濃鹽酸，加入煮沸15 min，先經雙層紗布過濾，3000 r/min離心15 min，濾紙過濾後煮沸15 min，冷卻至室溫，用1 moL/L NaOH調pH至7.8，121 ℃高壓滅菌15 min，4 ℃冰箱保存。

本發明還提供上述培養基的製備方法,所述液體培養基的製備方法為:將配方量的超純水,10%的醋酸鉑溶液,PPLO肉湯,葡萄糖,丙酮酸鈉,脫氧核糖核苷酸鈉，牛心湯,牛肺消化液，0.4%酚紅充分混勻,調Ph值為7.8,121℃高壓滅菌15分鐘,冷卻至50-55℃,加入配方量的無菌的滅活的馬血清,酵母浸出液,無菌的青黴素水溶液, 最後微調Ph值至7.8。

作為優選,所述固體培養基的製備方法為: 10%的醋酸鉑溶液,PPLO肉湯,葡萄糖,丙酮酸鈉,脫氧核糖核苷酸鈉，牛心湯, 牛肺消化液，0.4%酚紅充分混勻,調Ph值為7.8,121℃高壓滅菌15分鐘,冷卻至50-55℃,加入配方量的無菌的滅活的馬血清,酵母浸出液,無菌的青黴素水溶液, 最後微調Ph值至7.8。混勻後倒平板,得固體培養基。

本發明的第三個目的是提供牛支原體分離純化的方法,包括以下步驟:

1. 用無菌棉籤在牛的鼻腔、病死解剖牛的氣管、喉頭、肺臟、胸腔或腫大的關節採樣，或無菌條件下剪切小塊病樣組織接種到5mL的液體培養基中並棄去棉籤,置於37℃、5%CO2培養箱中培養, 48 h液體培養基均變黃，略微渾濁，經0.22 μm濾膜過濾，過濾液體傳代培養，傳至第3代液體培養基變為黃色，澄清透明，無沉澱。

2.將傳至第3代液體培養基轉接固體培養基培養3 d長出針尖大小菌落，40倍顯微鏡下呈現牛支原體典型的「油煎蛋」樣菌落，用接種環無菌刮取平板上的菌落接種到新的液體培養基中培養生長,再將變黃的培養物接種到固體培養基上;重複該步驟3次,確保分離到牛支原體特徵菌落。

步驟1和2表明，由於牛支原體病通常都是牛支原體和其它細菌的混合感染，其它細菌同時也生長或抑制牛支原體的生長，影響牛支原體的分離，因此，初代接種的液體培養基顏色變黃後立即使用0.22 μm無菌濾膜過濾去除其它細菌，由於牛支原體呈現多型性且較小，可以通過0.22 μm無菌濾膜，將過濾的液體繼續接種於新的牛支原體液體培養基進行增值純化。直至接種的第三代液體培養基變黃且澄清透明後接種於牛支原體固體培養基中，再反覆純化三代，確保分離到牛支原體典型的「油煎蛋」樣菌落。

3.在顯微鏡下選取單個的特徵菌落,並在平板底部做好標記;用無菌接種環挑取單一菌落並接種到5mL液體培養基中培養,當pH下降,液體由紅色變為黃色時,重複步驟2，如此重複3次,得到純化的牛支原體,將液體培養物和甘油以50%比列混合，振蕩混勻後一80℃保存。

本發明對培養基進行了營養成分的篩選,通過添加脫氧核糖核苷酸鈉和牛心湯，增加了牛支原體培養基的營養成分,使其富含DNA合成的必需物質膽固醇及蛋白質;通過增加酵母浸出液，提供了牛支原體生長所必須的核酸、核酸前體、維生素、胺基酸和生長因子。上述物質對於促進牛支原體的生長繁殖及提高牛支原體在培養基中生長率起到重要作用。經反覆實驗表明,本發明的培養基能有效促進牛支原體的繁殖, 培養12小時後牛支原體蛋白含量為0.43-0.48 mg/mL，培養24小時後牛支原體蛋白含量為0.72-0.81mg/mL，培養36小時後牛支原體蛋白含量為1.06-1.13 mg/mL，培養48小時後牛支原體蛋白含量為1.58-1.69 mg/mL，培養60小時後牛支原體蛋白含量為1.36-1.41 mg/mL，培養72小時後牛支原體蛋白含量為1.39-1.42 mg/mL 。而在未添加上述成分之前,培養48小時後牛支原體蛋白含量最高為1.26-1.32 mg/mL 。通過提高醋酸砣添加量、提高青黴素的濃度,可阻止環境中其他雜菌的生長,使培養基在2-8℃存儲時間從之前的2-3月延長到半年。

利用上述培養基對牛支原體分離純化,是在液體培養基上對牛支原體進行增值並過濾後繼續培養增值，利用固體培養基分離菌落,將分離的菌落再置於液體培養基中生長,重複上述步驟直至得到純化的牛支原體。利用本發明的培養基進行牛支原體分離純化的成功率高,在正確採樣的前提下,通過最初病料接種、過濾接種和分離,到後來挑取單菌落增殖的純化步驟,均能從臨床病樣中成功分離純化出牛支原體。

具體實施方式

下述實施例中的實驗方法,如無特殊說明,均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料,如無特殊說明,均為市售。

實施例1

本發明的牛支原體培養基由液體培養基和固體培養基組成,具體為:

液體培養基配方為：10%醋酸鉈溶液1mL/L、PPLO肉湯21g、滅活馬血清100mL/L、25%酵母浸出液200mL/L、青黴素300萬單位、葡萄糖1g、丙酮酸鈉2g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1g、牛心湯150 mL/L、牛肺消化液100 mL/L和0.4%酚紅 4.5 mL/L，剩餘體積用超純水補夠。

配製1000mL本發明的液體培養基的方法如下：準備1000mL三角瓶一個，量取200mL超純水加入到準備的三角瓶內，使用移液器吸取2mL10%醋酸鉈溶液緩慢滴加到三角瓶內，然後依次稱取並加入PPLO肉湯21g，葡萄糖1g，丙酮酸鈉2g，脫氧核糖核苷酸鈉0.1g，0.4%酚紅 4.5 mL，充分混勻後121℃高壓滅菌15分鐘；冷卻至50-55℃，加入滅活馬血清100mL，無菌的25%酵母浸出液200mL，無菌的牛心湯150 mL，無菌的牛肺消化液100 mL/L，無菌的青黴素300萬單位水溶液（(溶於50mL滅菌超純水），用滅菌超純水調至1000mL，無菌條件下調pH值至7.8，放置於4℃冰箱保存備用。

固體培養基配方為：10%醋酸鉈溶液1mL/L、PPLO瓊脂33g、滅活馬血清100mL/L、25%酵母浸出液100 mL/L、青黴素300萬單位、葡萄糖1g、丙酮酸鈉2g、脫氧核糖核苷酸鈉0.1g、牛心湯150 mL/L，無菌的牛肺消化液100 mL/L，和0.4%酚紅 4.5 mL/L，剩餘體積用超純水補夠。

配製1000mL本發明的液體培養基的方法如下：準備1000mL三角瓶一個，量取200mL超純水加入到準備的三角瓶內，使用移液器吸取2mL10%醋酸鉈溶液緩慢滴加到三角瓶內，然後依次稱取並加入PPLO肉湯21g，葡萄糖1g，丙酮酸鈉2g，脫氧核糖核苷酸鈉0.1g，0.4%酚紅 4.5 mL，充分混勻後121℃高壓滅菌15分鐘；;放入50-55℃的水浴鍋中冷卻，加入滅活馬血清100mL，無菌的25%酵母浸出液200mL，無菌的牛心湯150 mL，無菌的牛肺消化液100 mL/L，無菌的青黴素300萬單位水溶液（(溶於50mL滅菌超純水），用滅菌超純水調至1000mL後混勻，無菌條件下調pH值至7.8，,混勻後倒平板,放置於4℃冰箱保存備用。

本發明的牛支原體培養基的菌體蛋白含量的測定:

取4隻試管，分別加入液體培養基15mL/管，無菌操作下，在第1管中加入滅菌超純水0.75 mL（按液體培養基5%量添加）作為空白對照，在2、3、4管中分別加入牛支原體培養物0.75 mL（按液體培養基5%量添加），震蕩器混勻，將試管放置37℃ CO2培養箱中靜置培養，每日觀察顏色變化,每間隔12小時從待測菌液中取樣，無菌操作條件下每管分別吸取2 mL待測菌液置於無菌離心管中，12000 r/min離心15 min，倒掉上清，吸取等量0.01 moL/L PBS緩衝液置於離心管中，用渦旋振蕩器將離心管底部沉澱混勻，再次12000 r/min離心15 min，如此反覆洗滌3次，製成菌懸液待測，製成菌懸濁液用微量核算蛋白檢測儀測定蛋白含量，求2、3、4號試管測試值的平均值。連續測試72h，結果顯示，培養48小時後牛支原體蛋白含量最高，為1.58-1.69 mg/mL。

應用實施例1製備的培養基分離純化牛支原體的方法如下:

用無菌棉籤,從活體病牛的鼻腔中取樣,立即將棉籤放入含有5mL培養基的試管中用力攪拌擠壓,棄棉籤，或將病死解剖牛的氣管、喉頭、肺臟、胸腔或腫大的關節採樣，或無菌條件下剪切小塊病樣組織接種到5mL的液體培養基將試管放置37℃ CO2培養箱中靜置培養。每天觀察培養基顏色變化情況，將變黃的培養液用0.22 微分μm除菌濾膜過濾，重複培養過濾液兩次後接種於牛支原體固體培養基中，5 % CO2 37 ℃靜置培養3 d～5 d，40倍顯微鏡下觀察菌落形態。選取單個菌落接種於液體培養基中培養,當液體由紅色變為黃色後,重複該步驟;如此重複3次,即可得到純化的牛支原體,加甘油於-80℃保存。

實施例2

本實施例與實施例1的不同之處在於:

液體培養基配方為：10%醋酸鉈溶液2mL/L、PPLO肉湯21g、滅活馬血清200mL/L、25%酵母浸出液100mL/L、青黴素300萬單位、葡萄糖1g、丙酮酸鈉2g和0.4%酚紅 4.5 mL/L，剩餘體積用超純水補夠。

固體培養基配方為：10%醋酸鉈溶液1mL/L、PPLO瓊脂33g、滅活馬血清200mL/L、25%酵母浸出液100 mL/L、青黴素300萬單位、葡萄糖1g、丙酮酸鈉2g和 0.4%酚紅 4.5 mL/L，剩餘體積用超純水補夠。其餘部分均相同。

實施例3

本實施例與實施例1的不同之處在於:

液體培養基配方為：10%醋酸鉈溶液1.5mL/L、PPLO肉湯20g、滅活馬血清110mL/L、25%酵母浸出液210mL/L、青黴素200萬單位、葡萄糖1.1g、丙酮酸鈉1.8g、脫氧核糖核苷酸鈉0.2g、牛心湯140 mL/L、肺消化液牛110 mL/L和0.4%酚紅 4.3mL/L，剩餘體積用超純水補夠。

固體培養基配方為：0%醋酸鉈溶液1mL/L、PPLO瓊脂31g、滅活馬血清110mL/L、25%酵母浸出液210mL/L、青黴素200萬單位、葡萄糖1.1g、丙酮酸鈉1.8g、脫氧核糖核苷酸鈉0.2g、牛心湯140 mL/L、牛肺消化液110 mL/L和0.4%酚紅 4.3mL/L，剩餘體積用超純水補夠。其餘部分均相同。

實施例4

本實施例與實施例1的不同之處在於:

液體培養基配方為：10%醋酸鉈溶液2.5mL/L、PPLO肉湯23g、滅活馬血清230mL/L、25%酵母浸出液220mL/L、青黴素300萬單位、葡萄糖1.2g、丙酮酸鈉2.1g、脫氧核糖核苷酸鈉0.3g、牛心湯170mL/L、牛肺消化液120 mL/L和0.4%酚紅 4.6mL/L，剩餘體積用超純水補夠。

固體培養基配方為：10%醋酸鉈溶液2.5mL/L、PPLO瓊脂33g、滅活馬血清230mL/L、25%酵母浸出液220mL/L、青黴素300萬單位、葡萄糖1.2g、丙酮酸鈉2.1g、脫氧核糖核苷酸鈉0.3g、牛心湯170mL/L、牛肺消化液120 mL/L和0.4%酚紅 4.6mL/L，剩餘體積用超純水補夠。其餘部分均相同。

最後應說明的是:以上所述僅為本發明的優選實施例而已,並不用於限制本發明,儘管參照前述實施例對本發明進行了詳細的說明,對於本領域的技術人員來說,其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改,或者對其中部分技術特徵進行等同替換。凡在本發明的精神和原則之內,所作的任何修改、等同替換、改進等,均應包含在本發明的保護範圍之內。