酮還原酶介導的產生α氯代醇的立體選擇性途徑的製作方法

2024-03-02 14:38:15 1

專利名稱：酮還原酶介導的產生α氯代醇的立體選擇性途徑的製作方法
技術領域：
本公開內容涉及工程化的多肽和其用於從α -氯代酮製備α _氯代醇的用途。2.對序列表、表格或電腦程式的引用根據37C. F. R. 1. 821以計算機可讀形式(CRF)通過EFS-Web使用文件名 CX2-012W01_ST25.txt同時電子提交的序列表通過引用被併入本文。電子版的序列表創建於2010年6月22日，其文件大小為143千字節。3.背景立體選擇性還原α -滷代-酮為其相應的手性滷代-醇是見於許多有用的合成途徑中的轉化。例如，形成抗病毒化合物阿扎那韋(atazanavir)的合成途徑包括還原來源自 L-苯丙氨酸的Boc-氯-酮為相應的手性Boc- (S)-氯-醇。進行這一轉化的標準化學技術產生需要進一步拆分的期望中間產物的非對映體混合物，增加了阿扎那韋生產的成本和降低效率。因此，能夠更有效地立體選擇性還原α-滷代-酮為手性滷代-醇的方法和組合物將是期望的。已經發現屬於酮還原酶(KRED)或羰基還原酶類(EC1. 1. 1. 184)的某些酶可用於立體選擇性轉化前-立體異構的醛或酮底物為相應的手性醇產物。KRED通常將酮或醛底物轉化為相應的醇產物，但是還可以催化逆反應，即醇底物被氧化為相應的酮/醛產物。酶例如KRED對酮和醛的還原以及醇的氧化需要輔因子，其中最常見的為還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)或還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)以及用於氧化反應的煙醯胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)。NADH和NADPH充當電子供體，而NAD和NADP充當電子受體。KRED正日益被用於立體選擇性轉化酮和醛為用於關鍵藥物化合物生產的手性醇化合物。使用KRED來產生有用的化合物的實例包括4-氯乙醯基乙酸酯的不對稱還原(Zhou, J.Am. Chem. Soc. 1983 105 :5925-5926 ；Santaniello, J.Chem. Res. (S) 1984 132-133 ；美國專利第5，559, 030號；美國專利第5，700，670號和美國專利第5，891，685 號)、二氧代羧酸的還原(例如美國專利第6，399，339號)、(S)氯_5_羥基-3-氧代己酸叔丁基酯的還原(例如美國專利第6，645，746號和WO 01/40450)、基於吡咯並三嗪的化合物的還原(例如美國申請第2006/(^86646號)、取代苯乙酮的還原(例如美國專利第 6，800，477號)和酮噻吩烷(ketothiolanes)的還原(W0 2005/054491)。在另一個方法中， 如本文證明的，酮還原可在醇諸如異丙醇的存在下進行，以提供逆反應(醇脫氫)的底物。 以這種方式，酮還原反應中消耗的NADH/NADPH通過逆向、氧化反應再生。美國專利第7，083，973號公開了一種通過利用紅球菌屬(Iihodococcus)和短桿菌屬(Brevikicterium)的某些物種還原含相應酮基團的化合物，製備(3S，2R)_1_滷代-2-羥基-3-(保護的)氨基-4-取代的丁烷的立體選擇性方法。『973專利公開，僅紅球菌屬和短桿菌屬的選定物種催化該還原以形成高量和對映體產率的期望的(3S， 2R)-1-滷代-2-羥基-3-(保護的)氨基-4-取代的丁烷。『973專利公開，將來自150g 紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)ATCC 4277細胞的IOmL細胞提取物加載於
9IOmg (1 -[N-(1-苄基-2-氧-3-氯)丙基]氨基甲酸叔丁基酯底物、葡萄糖脫氫酶(35單位)、0· 7mM NAD+和200mg葡萄糖(反應在pH 6. 0、150RPM攪動和30°C進行)以95%產率和>98%非對映體純度產生(1S，2R)-[N-(1-苄基-2-羥基-3-氯)丙基]氨基甲酸叔丁
基酯產物。因此，能夠以高產率和高的非對映體純度立體選擇性轉化α-滷代-酮為滷代-醇的分離的KRED多肽將是期望的。同樣，利用KRED多肽進行大規模手性滷代_醇的製備的改進方法將是期望的。4.概述本公開內容提供能夠立體選擇性地轉化α -滷代-酮為手性滷代-醇的酮還原酶多肽，和在合成方法中利用這些多肽來製備化學化合物的方法，所述化學化合物諸如生產活性藥物成分諸如抗逆轉錄病毒藥物阿扎那韋中的中間產物。在某些實施方案中，本公開內容提供能夠轉化式(I)化合物N-保護的(S)-3_氨基-1-氯-4-苯基丁 -2-酮(其中R1是保護基)為相應的立體異構醇式(II)產物N-保護的OR，3S) -3-氨基-1-氯-4-苯基丁 -2-醇的酮還原酶多肽，如以下方案1所示。方案權利要求
1. 一種工程化的酮還原酶多肽，所述工程化的酮還原酶多肽能夠以SEQ ID N0:2活性的至少約1. 2倍的相對活性轉化( -叔丁基4-氯-3-氧-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯為叔丁基OS，3R) -4-氯-3-羥基-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯，其中所述多肽包括與 SEQ ID NO 2至少約70%相同的胺基酸序列，並包括一種或多種下述特徵對應於SEQ ID NO :2的胺基酸2的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸觀的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸34的殘基是選自天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸47的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性胺基酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸50的殘基是選自賴氨酸和精氨酸的鹼性胺基酸； 對應於SEQ ID NO :2的胺基酸81的殘基是選自天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸90的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸91的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性胺基酸，選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的芳香族胺基酸，或選自賴氨酸和精氨酸的鹼性胺基酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸94的殘基是鹼性胺基酸精氨酸； 對應於SEQ ID NO :2的胺基酸112的殘基是選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的芳香族胺基酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸117的殘基是選自天冬氨酸和穀氨酸的酸性胺基酸； 對應於SEQ ID NO 2的胺基酸143的殘基是選自賴氨酸和精氨酸的鹼性胺基酸； 對應於SEQ ID NO :2的胺基酸144的殘基是選自天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸145的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和甲硫氨酸的非極性胺基酸，或選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸的脂肪族胺基酸； 對應於SEQ ID NO 2的胺基酸148的殘基是選自脯氨酸和組氨酸的受限制的胺基酸； 對應於SEQ ID NO :2的胺基酸150的殘基是選自亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性或脂肪族胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸152的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性或脂肪族胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸153的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性或脂肪族胺基酸，或選自組氨酸和脯氨酸的受限制的胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸158的殘基是選自天冬醯胺、穀氨醯胺和絲氨酸的極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸190的殘基是選自丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性或脂肪族胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸198的殘基是選自天冬醯胺、穀氨醯胺和蘇氨酸的極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸199的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的脂肪族或非極性胺基酸，或選自天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性胺基酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸200的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸、異亮氨酸和甘氨酸的非極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸217的殘基是選自天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸225的殘基是選自纈氨酸、亮氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸231的殘基是選自酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的芳香族胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸232的殘基是選自亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸233的殘基是選自天冬醯胺、穀氨醯胺、絲氨酸和蘇氨酸的極性胺基酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸244的殘基是選自丙氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、甘氨酸和甲硫氨酸的非極性胺基酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸沈0的殘基是選自酪氨酸和色氨酸的芳香族胺基酸；且對應於SEQ ID NO :2的胺基酸沈1的殘基是選自天冬醯胺、穀氨醯胺和蘇氨酸的極性胺基酸。
2.如權利要求1所述的多肽，其中所述胺基酸序列包括相對於SEQIDNO :2的一種或多種以下胺基酸取代:P2L ；V28A ；A34S ；A47V ；E50K ；D81N ；S90V ；I91L ；I91W ；I91R ；I91K ； K94R ；D112Y ；G117D ；S143R ；V144T ；G145A ；R148H ；A150G ；F152L ；N153G ；N153V ；N153H ； T158S ；G190A ；S198N ；I199M ；I199L ；I199N ；M200I ；A217T；I225V ；P231F ；A232V ；E233Q ； D244G ；F260Y 和 S261N。
3.如權利要求2所述的多肽，其中所述多肽包括選自以下組成的組的胺基酸序列SEQ ID NO :4、6、14、16、18、20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、50、52、54、56、60、62、65、66、 68、70、72、74、76、78 和 80。
4.如權利要求1所述的多肽，其中所述相對活性是SEQID NO :2活性的至少約1.5倍。
5.如權利要求4所述的酮還原酶，其中所述多肽包括選自以下組成的組的胺基酸序列SEQ ID NO :6、18、22、30、38、40、50、52、54 和 56。
6.如權利要求1所述的多肽，其中所述相對活性是SEQID NO 2活性的至少約3倍。
7.如權利要求6所述的多肽，其中所述多肽包括選自以下組成的組的胺基酸序列SEQ ID NO :6,50,52 和 56。
8.如權利要求1所述的多肽，其中所述胺基酸序列包括一種或多種下述特徵 對應於SEQ ID NO :2的胺基酸91的殘基選自亮氨酸、色氨酸、精氨酸和賴氨酸組成的組；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸144的殘基是蘇氨酸； 對應於SEQ ID NO 2的胺基酸145的殘基是丙氨酸； 對應於SEQ ID NO 2的胺基酸150的殘基是甘氨酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸153的殘基選自甘氨酸、纈氨酸和組氨酸組成的組； 對應於SEQ ID NO 2的胺基酸190的殘基是丙氨酸；對應於SEQ ID NO :2的胺基酸199的殘基選自甲硫氨酸、亮氨酸和天冬醯胺組成的組；且對應於SEQ ID NO 2的胺基酸沈0的殘基是酪氨酸。
9.如權利要求8所述的多肽，其中所述多肽包括選自以下組成的組的胺基酸序列SEQ ID NO :16、18、22、24、26、28、30、32、34、38、40 和 52。
10.如權利要求10所述的多肽，其中所述胺基酸序列包括一種或多種下述特徵 對應於SEQ ID NO 2的胺基酸91的殘基是精氨酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸145的殘基是丙氨酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸153的殘基選自甘氨酸和組氨酸組成的組；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸190的殘基是丙氨酸；且對應於SEQ ID NO 2的胺基酸沈0的殘基是酪氨酸。
11.如權利要求10所述的多肽，其中所述多肽包括選自以下組成的組的胺基酸序列 SEQ ID NO :18、22、30、38、40 和 52。
12.如權利要求8所述的多肽，其中所述相對活性是SEQID NO :2活性的至少約3倍， 且其中對應於SEQ ID NO 2的胺基酸145的殘基是丙氨酸。
13.如權利要求12所述的多肽，其中所述多肽包括SEQID NO :52的胺基酸序列。
14.如權利要求1所述的多肽，其中所述多肽能夠在M小時內以至少70%的轉化率轉化包含初始濃度為至少10g/L的(S)-叔丁基4-氯-3-氧-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯的反應混合物為叔丁基OS，3R) -4-氯-3-羥基-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯。
15.如權利要求14所述的多肽，其中所述多肽能夠在M小時內達到至少95%的轉化率。
16.如權利要求14所述的多肽，其中所述多肽能夠轉化(S)-叔丁基4-氯-3-氧-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯為至少97 %非對映體過量的叔丁基OS，3R) -4-氯-3-羥基苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯。
17.如權利要求14所述的多肽，其中所述反應混合物包含少於約5g/L的所述多肽。
18.如權利要求14所述的多肽，其中所述反應混合物包含初始濃度為至少100g/L的 (S)-叔丁基4-氯-3-氧-1-苯基丁烷-2-基氨基甲酸酯。
19.一種工程化的酮還原酶多肽，所述多肽能夠以比參考多肽SEQ IDNO :2大至少2倍的活性氧化異丙醇(IPA)為丙酮，其中所述多肽包含與選自SEQ ID N0:6、56、60、62、64、 66、68、70、72、74、76、78和80的序列具有至少70%同一性的胺基酸序列。
20.如權利要求19所述的多肽，其中所述胺基酸序列與選自SEQIDN0:6、56、60、62、 64、66、68、70、72、74、76、78和80的序列具有至少95%同一性。
21.如權利要求19所述的多肽，其中所述胺基酸序列包括至少一種下述特徵對應於SEQ ID NO 2的胺基酸144的殘基是半胱氨酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸145的殘基選自丙氨酸和纈氨酸組成的組；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸150的殘基選自異亮氨酸、絲氨酸和色氨酸組成的組；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸190的殘基選自穀氨醯胺、脯氨酸和纈氨酸組成的組；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸199的殘基選自甘氨酸和亮氨酸組成的組；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸200的殘基是異亮氨酸；對應於SEQ ID NO 2的胺基酸204的殘基是苯丙氨酸；且對應於SEQ ID NO 2的胺基酸225的殘基是纈氨酸。
22.如權利要求19所述的多肽，其中所述胺基酸序列包含與SEQIDNO 2相比的至少一種以下取代V144C、A150I、A150S、A150W、G190P、G190V、M200I 和 V204F。
23.如權利要求19所述的多肽，其中所述胺基酸序列包含與SEQIDNO 2相比的至少一種以下組的胺基酸取代G145A 和 I199L ；和 G145A 和 I225V。
24.如權利要求19所述的多肽，其中所述活性比參考多肽SEQID NO :2大至少5倍， 且其中所述胺基酸序列包含與SEQ ID N0:2相比的至少一種以下取代A150W、M200I和 G190V。
25.如權利要求19所述的多肽，其中所述胺基酸序列選自SEQID NO :6、56、60、62、64、 66、68、70、72、74、76、78 和 80。
26.一種組合物，所述組合物包含權利要求1-25任一項的多肽。
27.一種多核苷酸，所述多核苷酸編碼權利要求1-25任一項的多肽。
28.—種表達載體，所述表達載體包含可操作地連接於能夠指導編碼的多肽在宿主細胞中表達的控制序列的權利要求27的多核苷酸。
29.如權利要求觀所述的表達載體，其中所述控制序列包含分泌信號。
30.一種宿主細胞，所述宿主細胞包含權利要求27或觀任一項的表達載體。
31.如權利要求30所述的宿主細胞，其中編碼多肽的所述多核苷酸的密碼子已被優化以在所述宿主細胞中表達。
32.—種製備權利要求1至25任一項的工程化的酮還原酶多肽的方法，所述方法包括培養權利要求30的宿主細胞，並從所述宿主細胞分離所述多肽。
33.一種製備大於約95%非對映體過量的式(II)化合物的方法，所述方法包括
34.如權利要求33所述的方法，其中R1是選自以下組成的組的氮保護基甲醯基、 三苯甲基、甲氧基三苯甲基、甲苯磺醯基、鄰苯二甲醯亞氨基、乙醯基、三氯乙醯基、氯乙醯基、溴乙醯基、碘乙醯基、苄氧羰基(Cbz)、9_芴基甲氧羰基(FMOC)、2_三甲矽烷基乙氧羰基(Teoc)U-甲基-1-(4-聯苯基)乙氧羰基(Bpoc)、叔丁氧羰基(BOC)、烯丙氧基羰基 (Alloc)、三滷代乙醯基、苄基、苯甲醯基和硝基苯基乙醯基。
35.如權利要求33所述的方法，其中R1是叔丁氧羰基。
36.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括約6.5至約9. 5的pH。
37.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括約9.O的pH。
38.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括從約25°C至約60°C的溫度。
39.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括約45°C的溫度。
40.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括含水共溶劑系統。
41.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括包含從約90 10(v/v)至約 10 90 (ν/ν)的有機溶劑與水的比例的含水共溶劑系統。
42.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括包含從約5%至約40%異丙醇的含水共溶劑系統。
43.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括包含約10%異丙醇的含水共溶劑系統。
44.如權利要求33所述的方法，其中所述反應條件包括包含約pH9.0和約10%異丙醇的含水共溶劑系統。
45.如權利要求33所述的方法，其中所述多肽的濃度少於約5g/L。
46.如權利要求33所述的方法，其中所述多肽的濃度少於約lg/L。
47.如權利要求33所述的方法，其中所述式(I)化合物的濃度是至少約100g/L。
48.如權利要求33所述的方法，其中所述式(I)化合物的濃度是至少約150g/L。
49.如權利要求33所述的方法，其中所述多肽是大致上純的多肽。
50.如權利要求33所述的方法，所述方法還包括選自以下組成的組的輔因子再生系統葡萄糖脫氫酶和葡萄糖、甲酸脫氫酶和甲酸、亞磷酸脫氫酶和亞磷酸、以及異丙醇和仲醇脫氫酶。
51.如權利要求50所述的方法，其中所述輔因子再生系統是仲醇脫氫酶。
52.如權利要求51所述的方法，其中所述仲醇脫氫酶是所述工程化的酮還原酶多肽。
53.如權利要求33所述的方法，其中所述非對映體過量是大於約97%。
54.如權利要求33所述的方法，其中在少於約M小時內至少約95%的所述式(I)化合物被轉化為所述式(II)化合物。
55.如權利要求33所述的方法，其中在少於約M小時內至少約95%的所述式(I)化合物被轉化為所述式(II)化合物，其中所述式(I)化合物的濃度是至少約150g/L且所述多肽的濃度是少於約lg/L。
56.一種製備大於約95%非對映體過量的式(III)化合物的方法，所述方法包括
57.如權利要求56所述的方法，其中R1是選自以下組成的組的氮保護基甲醯基、 三苯甲基、甲氧基三苯甲基、甲苯磺醯基、鄰苯二甲醯亞氨基、乙醯基、三氯乙醯基、氯乙醯基、溴乙醯基、碘乙醯基、苄氧羰基(Cbz)、9_芴基甲氧羰基(FMOC)、2_三甲矽烷基乙氧羰基(Teoc)U-甲基-1-(4-聯苯基)乙氧羰基(Bpoc)、叔丁氧羰基(BOC)、烯丙氧基羰基 (Alloc)、三滷代乙醯基、苄基、苯甲醯基和硝基苯基乙醯基。
58.如權利要求56所述的方法，其中R1是叔丁氧羰基(BOC)。
59.如權利要求56所述的方法，其中進行將式(II)化合物與鹼接觸的所述步驟而不純化和/或分離所述式(II)化合物。
60.如權利要求56所述的方法，所述方法還包括從所述有機溶劑萃取物結晶所述式 (III)化合物。
61.如權利要求56所述的方法，其中所述有機溶劑選自甲苯、異丙醇、MTBE、正丁醇和乙腈。
62.如權利要求61所述的方法，其中所述有機溶劑是MTBE。
63.如權利要求62所述的方法，所述方法還包括用結晶溶劑交換所述有機溶劑萃取物的有機溶劑，並從所述結晶溶劑結晶所述式(III)化合物。
64.如權利要求63所述的方法，其中所述結晶溶劑是庚烷。
65.如權利要求56所述的方法，其中所述鹼選自氫氧化鉀(KOH)、叔丁醇鉀、碳酸鉀和三乙胺。
66.如權利要求65所述的方法，其中所述鹼是氫氧化鉀(KOH)。
67.如權利要求56所述的方法，其中所述非對映體過量大於約97%。
全文摘要
本公開內容涉及工程化的酮還原酶多肽和其用於從α-氯代酮製備α-氯代醇的用途。還提供了編碼工程化的酮還原酶多肽的多核苷酸和能夠表達工程化的酮還原酶多肽的宿主細胞。
文檔編號C12N15/53GK102482648SQ201080027481
公開日2012年5月30日 申請日期2010年6月22日 優先權日2009年6月22日
發明者亞加迪什·馬維納哈利, 史蒂文·詹姆斯·科利爾, 榮貴·彭, 麥可·沃格爾, 韋絲娜·米切爾 申請人:科德克希思公司