一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法

2024-03-02 19:56:15 2

一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法
【專利摘要】本發明公開了一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，以牛肝臟為原料通過超聲提取及低溫離心等工藝製備得到過氧化氫酶粗提液，採用超濾濃縮和凝膠層析技術進行過氧化氫酶的提取純化，取代了利用大量有機溶劑或無機鹽溶液等進行提取的複雜工藝，一方面使提取工藝更加簡單易操作，酶活性及產率均得到大幅度提高，所得過氧化氫酶酶活達到10000U/mg以上，產率達到18％以上，且大大降低了生產成本；另一方面將超濾濃縮產生的透過液重複回收利用，避免了廢水的排放，是一種環境友好型生產工藝。
【專利說明】一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法

【技術領域】
[0001]本發明涉及生物【技術領域】，尤其涉及一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法。

【背景技術】
[0002]過氧化氫酶(Catalase，CAT)，又稱觸酶，是一類廣泛存在於動物、植物和微生物體內的末端氧化酶，是以過氧化氫為底物，通過催化一對電子的轉移而最終將其分解為水和氧氣，其系統名稱是H2O2:H202氧化還原酶，國際酶學委員會的編號為ECl.11.1.6。過氧化氫酶分子結構中含有鐵卟啉環，I個分子酶蛋白中含有4個鐵原子，其作用基團是血紅素。過氧化氫酶主要由四種次單元組成，每一種單元含一種蘇木精衍生物稱為ProtohemelX。不管什麼來源，它的分子量均是225。過氧化氫酶是在生物演化過程中建立起來的生物防禦系統的關鍵酶之一，其生物學功能是催化細胞內過氧化氫分解，防止脫脂過氧化。目前過氧化氫酶主要的應用領域包括:臨床、醫藥及食品加工等領域。
[0003]酶的純化工作非常複雜，除了要保證純度外，酶產品還必須保持其生物活性。純化工藝必須能夠每次都能產生相同數量和質量的酶，重複性良好。這就要求應用適應性非常強的方法而不是用能得到純酶的最好方法去純化酶。在實驗室條件下的好方法卻可能在大規模生產應用中失敗，因為後者要求規模化，且在每日的應用中要有很好的重複性。
[0004]國內外目前生產過氧化氫酶的方法有三個:Novozymes A/S公司由變種黑麴黴在通風攪拌等條件下培養而得；而傑能科公司則由纖維蛋白小球菌經深層發酵提取精製而得。國內由江南大學的華兆哲、陳堅等研究用利用Bacillus subtilis WSHDZ.01胞肉過氧化氫酶的純學提取在這個方面做僅做了嘗試，CN103509766提供了另外一中編號為CGMCCN03449的一株Serratia marcesces SRBC08高產過氧化氫酶菌的菌株為菌種,經過種子培養和在產酶培養基中添加100-200毫克/升煙酸作為誘導劑，調控菌體的生產代謝，該方法通過種子培養、發酵產酶、過氧化氫酶的提取純化等三個步驟得到產品，但亦未見工藝化大生產，目前發酵法雖然採用添加過活性氧、乙醇等誘導CAT表達的發酵策略，但是目前產量提高非常有限，導致生產成本高，不合適工業化生產。
[0005]國內外主要是從豬、牛等動物肝臟中提取純化而得，如CN1436846提出了一種由動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，該方法經過將動物肝臟在酸性條件下粗提、高速離心、硫酸銨沉澱、熱變性等四個步驟最後得到過氧化氫酶溶液，但是該方法中要用到大量的飽和度45%的硫酸銨，在生產中容易造成大量無機鹽的汙染，不是環境友好型生產工藝，而且該方法得到的酶的活性不是很高，並只得到酶溶液而不是幹品；CN101445794提供了另外一種方法，該方法經過中空纖維濾膜兩次滲透，得到過氧化氫酶產品，但是該方法中中空纖維濾膜目前的成本高，難得到在大工業化中經濟實惠的產品，不具備在市場上有競爭能力；US2992167中提供了一個由利用化學溶劑中動物肝臟中提取過氧化氫酶的，但是該方法使用的化學試劑對環境的汙染比較大，生產工藝複雜且對生產條件要求高，造成提取率低，而且容易對人體造成比較大的傷害，不符合目前國內外清潔環保的生產需求。
[0006]目前紡織印染企業生產用的過氧化氫酶產品幾乎都依賴進口，市場為外商所壟斷；食品行業用的過氧化氫酶則完全依靠進口且沒有現貨，因此國內過氧化氫酶製品的研製是市場的需要，也是企業降低成本的需要。在國內微生物發酵法製取過氧化氫酶僅處於實驗室研究階段，尚無工業化生產，而從動物原料中提取過氧化氫酶的研究也是在近幾年才引起重視。哺乳動物組織中過氧化氫酶含量差異很大，肝和腎中含量最高，紅細胞次之，結締組織中含量最低。


【發明內容】

[0007]本發明的目的是針對現有的過氧化氫酶提取工藝的不足，提供一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，本發明以牛肝臟為原料，順次經過搗碎勻漿、超聲處理和低溫離心製備過氧化氫酶粗提液，將所得粗提液採用超濾濃縮和凝膠層析技術進行過氧化氫酶的提取及純化，取代利用大量有機溶劑提取、大量無機鹽沉澱等對環境汙染的方法，且將超濾濃縮得到的大量透過液進行重複利用，具有節能減排、經濟環保且酶活高的優點，適合工業化生產的要求。
[0008]本發明的技術方案為:
[0009]一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特徵在於，
[0010]以牛肝臟為原料提取獲得過氧化氫酶粗提液，將所得過氧化氫酶粗提液採用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜，以10_20L/h的流速進行超濾濃縮，收集超濾截留液得到含有高濃度過氧化氫酶的過氧化氫酶濃縮液；
[0011]此外，還包括以下步驟:
[0012]步驟一、純化，將所得過氧化氫酶濃縮液採用Sephacryl S-200凝膠進行凝膠過濾層析，用PH值為7.0-7.8的磷酸緩衝液進行洗脫，流速為1.0-2.0L/h，收集層析洗脫液得到純化的過氧化氫酶母液；
[0013]步驟二、冷凍乾燥，將所得過氧化氫酶母液經過冷凍乾燥，既得所述過氧化氫酶。
[0014]優選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，所述過氧化氫酶粗提液的製備方法包括以下步驟:
[0015]步驟一、搗碎勻漿，將切碎的牛肝臟和pH值為7.0-7.8的磷酸緩衝液按照體積比I: 6-10混合後，保持溫度25-30°C進行搗碎20-30min，得到牛肝勻漿；
[0016]步驟二、超聲提取，將所得牛肝勻漿進行超聲振蕩10_30min，超聲波強度為30-80W，得到牛肝過氧化氫酶勻漿；
[0017]步驟三、離心分離，將所得牛肝過氧化氫酶勻漿在10-30°C下進行離心15_25min，取上層清液既得所述過氧化氫酶粗提液。
[0018]優選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，並調節所得透過液的PH值為7.0-7.8後，可取代磷酸緩衝液與切碎的牛肝臟混合後進行搗碎。
[0019] 優選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，在進行凝膠過濾層析之前用PH值為7.0-7.8的磷酸緩衝液對所述凝膠柱進行衝洗。
[0020]優選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，步驟二中冷凍乾燥溫度為-55—60°C。
[0021]優選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，離心分離的轉速為大於或等於5000rpm。
[0022]優選的是，所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，所用磷酸緩衝液的濃度均為 0.09-0.llmol/L。
[0023]本發明具有以下有益效果:首先，本發明將經過搗碎勻漿後的牛肝臟進行超聲處理，使過氧化氫酶快速高效釋放，大大縮短過氧化氫酶的提取時間，並大幅度提高過氧化氫酶的產率。
[0024]其次，本發明將所得過氧化氫酶粗提液採用超濾濃縮和凝膠層析技術進行過氧化氫酶的提取及純化，取代利用大量有機溶劑提取、大量無機鹽沉澱等對環境汙染的方法，且將超濾濃縮得到的大量透過液進行重複利用，具有節能減排、經濟環保且酶活高的優點，是一種環境友好型生產工藝。本發明所述方法提取得到的過氧化氫酶酶活至少達到1000U/mg以上，產品回收率達到18%以上，均高於現有的從動物肝臟中提取過氧化氫酶的方法，適合工業化生產的要求。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0025]圖1為本發明所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法的工藝流程圖。

【具體實施方式】
[0026]下面結合附圖對本發明做詳細說明，以令本領域普通技術人員參閱本說明書後能夠據以實施。
[0027]如圖1所示，一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其中，
[0028]以牛肝臟為原料提取獲得過氧化氫酶粗提液，將所得過氧化氫酶粗提液採用0.004-0.006μπι的中空纖維濾膜，本發明所用濾膜為由北京海德能提供的型號為HU10-90，孔徑為0.005μπι的中空纖維濾膜，並以10_20L/h的流速進行超濾濃縮，截留分子量10萬以上的肽鏈，收集超濾截留液得到含有高濃度過氧化氫酶的過氧化氫酶濃縮液，而將超濾透過液回收到儲蓄罐中，並利用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調節透過液的pH值為7.0-7.8備用。另外，在進行超濾濃縮之前先用純淨水對超濾設備進行衝洗，將超濾設備的管道及容器衝洗乾淨後再加入所述過氧化氫酶粗提液進行超濾濃縮。
[0029]此外，還包括以下步驟:
[0030]步驟一、純化，將所得過氧化氫酶濃縮液採用Sephacryl S-200凝膠進行凝膠過濾層析，在進行凝膠過濾層析之前用濃度為0.09-0.llmol/L, pH值為7.0-7.8的磷酸緩衝液對所述凝膠柱進行衝洗，上樣後用濃度為0.09-0.llmol/L, pH值為7.0-7.8的磷酸緩衝液進行洗脫，流速為1.0-2.0L/h，收集層析洗脫液得到純化的過氧化氫酶母液；
[0031]步驟二、冷凍乾燥，將所得過氧化氫酶母液經過冷凍乾燥，既得所述過氧化氫酶，冷凍乾燥溫度為-55-60°C，優選_55°C，所用冷凍乾燥儀器為FD-18S型冷凍乾燥機。
[0032]所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，所述過氧化氫酶粗提液的製備方法包括以下步驟:
[0033]步驟一、搗碎勻漿，將新鮮牛肝臟用水洗淨後切碎，將切碎的牛肝臟和pH值為
7.0-7.8的磷酸緩衝液按照體積比1: 6-10混合後，保持溫度25-30°C用組織搗碎勻漿機進行搗碎20-30min，勻漿機轉速為2000-3000rpm，得到牛肝勻漿；
[0034]步驟二、超聲提取，將所得牛肝勻漿進行超聲振蕩10_30min，超聲波強度為30-80W,使細胞破碎，細胞內的過氧化氫酶快速溶出，得到牛肝過氧化氫酶勻漿；
[0035]步驟三、離心分離，將所得牛肝過氧化氫酶勻漿用低溫離心機在10_30°C下進行離心15-25min，離心分離的轉速大於或等於5000rpm，取上層清液既得所述過氧化氫酶粗提液。
[0036]所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法中，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，並調節所得透過液的PH值為7.0-7.8後，可取代磷酸緩衝液與切碎的牛肝臟混合後進行搗碎，從而將超濾產生的大量透過液回收利用，實現提取工藝中的廢水零排放。
[0037]實施例1
[0038]將新鮮牛肝20kg用自來水洗淨，切碎，加入6倍體積的pH值為7.2的磷酸緩衝液，用組織搗碎勻漿機搗碎，然後超聲波強度為20W提取20min，得到牛肝勻漿，取牛肝勻漿，然後用低溫離心機在15°C下於6000rpm離心20分鐘，上層清液為得到過氧化氫酶粗提液。先衝洗超濾設備，確定管道及容器乾淨後，原料槽裝入料液，用北京海德能HU10-90，，以1L/h的流速進行超濾濃縮，得到過氧化氫酶濃縮液，而透過液回收到儲罐中，然後調節PH值為7.2後替代進行搗碎時的磷酸緩衝液使用。將得到的過氧化氫酶濃縮液採用SephacrylS-200凝膠柱進行凝膠過濾層析，裝柱後，用濃度為0.lmol/L，pH值為7.2的磷酸緩衝液衝洗後上樣，用0.lmol/L，pH值為7.2的磷酸緩衝液進行洗脫，流速1.0L/h，收集酶液得到過氧化氫酶母液，純化後的過氧化氫酶母液採用FD-18S型冷凍乾燥機，_55°C冷凍乾燥，得到過氧化氫酶產品，酶活達11000U/mg。
[0039]實施例2
[0040]將新鮮牛肝20kg用自來水洗淨，切碎，加入6倍體積的pH值為7.4的磷酸緩衝液，用組織搗碎勻漿機搗碎，然後超聲波強度為20W提取25min，得到牛肝勻漿，取牛肝勻漿，然後用低溫離心機在15°C下於6000rpm離心20分鐘，上層清液為得到過氧化氫酶粗提液。先衝洗超濾設備，確定管道及容器乾淨後，原料槽裝入料液，用北京海德能HU10-90，以15L/h的流速進行超濾濃縮，得到過氧化氫酶濃縮液，而透過液回收到儲罐中，然後調節PH值為7.4後替代進行搗碎時的磷酸緩衝液使用。將得到的過氧化氫酶濃縮液採用SephacrylS-200凝膠柱進行凝膠過濾層析，裝柱後，用濃度為0.lmol/L，pH值為7.4的磷酸緩衝液衝洗後上樣，用0.lmol/L，pH值為7.4的磷酸緩衝液進行洗脫，流速1.5L/h，收集酶液得到過氧化氫酶母液，純化後的過氧化氫酶母液採用FD-18S型冷凍乾燥機，_55°C冷凍乾燥，得到過氧化氫酶產品，酶活達11000U/mg。
[0041]實施例3
[0042]將新鮮牛肝20kg用自來水洗淨，切碎，加入6倍體積的pH值為7.6的磷酸緩衝液，用組織搗碎勻漿機搗碎，然後超聲波強度為25W提取30min，得到牛肝勻漿，取牛肝勻漿，然後用低溫離心機在10°C下於7000rpm離心20分鐘，上層清液為得到過氧化氫酶粗提液。先衝洗超濾設備，確定管道及容器乾淨後，原料槽裝入料液，用北京海德能HU10-90，以15L/h的流速進行超濾濃縮，得到過氧化氫酶濃縮液，而透過液回收到儲罐中，然後調節PH值為7.6後替代進行搗碎時的磷酸緩衝液使用。將得到的過氧化氫酶濃縮液採用SephacrylS-200凝膠柱進行凝膠過濾層析，裝柱後，用濃度為0.lmol/L，pH值為7.6的磷酸緩衝液衝洗後上樣，用0.lmol/L，pH值為7.6的磷酸緩衝液進行洗脫，流速1.5L/h，收集酶液得到過氧化氫酶母液，純化後的過氧化氫酶母液採用ro-18S型冷凍乾燥機，-55°C冷凍乾燥，得到過氧化氫酶產品，酶活達12000U/mg。
[0043]儘管本發明的實施方案已公開如上，但其並不僅僅限於說明書和實施方式中所列運用，它完全可以被適用於各種適合本發明的領域，對於熟悉本領域的人員而言，可容易地實現另外的修改，因此在不背離權利要求及等同範圍所限定的一般概念下，本發明並不限於特定的細節和這裡示出與描述的圖例。
【權利要求】
1.一種從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特徵在於， 以牛肝臟為原料提取獲得過氧化氫酶粗提液，將所得過氧化氫酶粗提液採用孔徑為0.004-0.006 μ m的中空纖維濾膜，以10_20L/h的流速進行超濾濃縮，收集超濾截留液得到含有高濃度過氧化氫酶的過氧化氫酶濃縮液； 此外，還包括以下步驟: 步驟一、純化，將所得過氧化氫酶濃縮液採用Sephacryl S-200凝膠進行凝膠過濾層析，用PH值為7.0-7.8的磷酸緩衝液進行洗脫，流速為1.0-2.0L/h，收集層析洗脫液得到純化的過氧化氫酶母液； 步驟二、冷凍乾燥，將所得過氧化氫酶母液經過冷凍乾燥，既得所述過氧化氫酶。
2.如權利要求1所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特徵在於，所述過氧化氫酶粗提液的製備方法包括以下步驟: 步驟一、搗碎勻漿，將切碎的牛肝臟和PH值為7.0-7.8的磷酸緩衝液按照體積比I: 6-10混合後，保持溫度25-30°C進行搗碎20-30min，得到牛肝勻漿； 步驟二、超聲提取，將所得牛肝勻漿進行超聲振蕩10_30min，超聲波強度為30-80W，得到牛肝過氧化氫酶勻漿； 步驟三、離心分離，將所得牛肝過氧化氫酶勻漿在10-30°C下進行離心15-25min，取上層清液既得所述過氧化氫酶粗提液。
3.如權利要求2所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特徵在於，將所述超濾濃縮得到的透過液進行收集，並調節所得透過液的PH值為7.0-7.8後，可取代磷酸緩衝液與切碎的牛肝臟混合後進行搗碎勻漿。
4.如權利要求1所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特徵在於，在進行凝膠過濾層析之前用PH值為7.0-7.8的磷酸緩衝液對所述凝膠柱進行衝洗。
5.如權利要求1所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特徵在於，步驟二中冷凍乾燥溫度為-55—60°C。
6.如權利要求2所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特徵在於，離心分離的轉速為大於或等於5000rpm。
7.如權利要求2或4所述的從牛肝臟中提取過氧化氫酶的方法，其特徵在於，所用磷酸緩衝液的濃度均為0.09-0.llmol/L.
【文檔編號】C12N9/08GK104178466SQ201410408847
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年8月19日 優先權日:2014年8月19日
【發明者】張春穎, 楊旭錦 申請人:西藏天虹科技股份有限責任公司