腸道病毒71型基因組的序列及其應用的製作方法

2024-04-06 00:15:05

專利名稱：：腸道病毒71型基因組的序列及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及腸道病毒，更具體的涉及腸道病毒71型基因組的序列及其應用。
背景技術：
：2008年全國大面積爆發了兒童手足口病。引起此次手足口病的罪魁禍首就是人腸道病毒71型(EV71)。截止到2008年12月16曰，NCBI公布的EV71相關序列為2145個，但其中並沒有EV71病毒全基因序列，因此無法得到全面資料以準確判斷全球以及我國人腸道病毒71型的流行和遺傳變異情況，進而無法了解目前全球手足口病的流行和遺傳衍化情況。
發明內容本發明要解決的技術問題在於提供一種EV71病毒的全基因序列。為解決上述問題，本發明一方面提供了一種腸道病毒71型全基因組序列，其具有SEQIDNO:l所示的核苷酸序列。本發明另一方面提供了所述序列及與所述序列同源性達50-95%的序列在製備用於預防腸道病毒71型疫苗和血清學診斷ELISA試劑中的用途。本發明另一方面提供了所述序列及與所述序列同源性達50-95%的序列在製備抗腸道病毒71型中和抗體中的用途。本發明的有益效果在於該序列為進一步獲得我國華南地區EV71型遺傳衍化特徵提供了客觀依據，為進一步研製開發針對我國不同地區發病A^的血清學ELISA診斷試劑和疫苗提供了可靠的數據資料，為深入研究EV71的遺傳變異規律及手足口病的致病機制提供了寶貴資源。圖1是用megalign中的聚類clusterW進行一個聚類後，獲得的比對結果。圖2是EV71VP1區進化樹分析結果。具體實施例方式病毒基因組核酸的提取和測序1.採集標本採集深圳市東湖醫院收治的手足口病人的病毒分離標本，包括糞便、皰滲液、腦脊液和咽拭子，用於採集咽拭子的無菌拭子要;^文在適當的保存液中，如維持液或生理鹽水，以防乾燥。2.標本處理2.1糞便標本的處理2.1.1每管中加入10mlPBS、lg玻璃珠和lml氯仿;2丄2在生物安全拒中從每份糞便標本中取大約2g加入到標記好的離心管中；2丄3將剩餘的原始標本留在原容器中並在-20。C凍存；2丄4擰緊離心管，機械震蕩器劇烈震蕩20分鐘；2.1.5蓋好離心機的蓋子，密封離心桶，冷凍離心機在1500g離心20分鐘；2丄6在生物安全拒中將每一份標本的上清液分別吸入2個有外螺旋蓋的凍存管中；2丄7—管糞便懸液凍存於-20。C作為備份，另一管存於4-8。C以備接種。2.2皰滲液標本的處理皰滲液標本直接用於病毒分離。2.3腦脊液標本的處理腦脊液標本直接用於病毒分離。2.4咽拭子標本的處理在標本保存液中充分攪動咽拭子(至少40下)，以洗下拭子上粘附的病毒及含有病毒的細胞，然後在4。C條件下，10000rpm離心20分鐘，用上清接種到細胞上，如果發現有細菌汙染，須用濾器過濾除菌。3.分離病毒3.1顯微鏡下觀察單層細胞，以確保細胞是健康的，一個健康的4單層細胞會在傳代後3天左右形成；3.2倒掉生長液(GM)，換上1-1.2ml的維持液(MM);3.3每一份標本需要同時接種2支RD細胞和2支HEp-2細胞，正確標記每支細胞培養管(包括標本的編號、日期、傳代數)；3.4每一種細胞至少標記一管作為陰性對照；3.5每支試管接種0.2ml的標本懸液，34-35。C溫度培養；3.6每天使用倒置顯微鏡觀察細胞培養管，以觀察有特徵性的腸道病毒致細胞病變效應(CPE)的出現(如細胞變圓，折光增強並脫離管壁等)；3.7記錄接種管和對照管細胞所發生的變化至少一周，記錄CPE(l+-4+)、提示細胞受毒性反應、老化或汙染的影響而發生的變化(l+，<25%;2+,25%國50%;3+，50%-75%;4+，75%-100%);3.8如果有特徵性的腸道病毒CPE出現，要如實記錄，並觀察直到75。/。的細胞發生變化(3+CPE)，然後儲藏在-20。C以備二次傳代。同一病例的二次傳代的病毒分離物可以放到一起用於進一步的鑑定；3.9第l代培養見可疑細胞病變時繼續傳代，待細胞病變穩定出現後-2(TC或-7(TC凍存；3.10—代陽性分離物再傳二代，如果又有明顯的CPE出現，將病毒保存在-20。C冰箱(二代病毒)。因第二代病毒滴度高於第一代病毒，所以選用第二代病毒進行鑑定。3.11如果7天之後沒有CPE出現，那麼盲傳1代繼續觀察7天。盲傳2代後，仍然沒有出現CPE，則判定為陰性；如果接種後24小時內出現CPE，很可能是標本中的非特異性成分導致的毒性反應。4.提取病毒核酸可使用商業化試劑盒來提取RNA，例如使用QIAGENViralRNAMiniExtractionKit(QIAGEN公司)從臨床標本或病毒分離培養物中提取病毒RNA:4.1向一支1.5ml離心管中加入560pi的AVL緩衝液(含CarrierRNA);4.2再向這支離心管中加入140^臨床標本或病毒分離培養物，充分混勻至少15秒；4.3室溫下(15。C-25。C)放置IO分鐘，瞬時離心；4.4加入560pi純乙醇，充分混勻至少15秒，瞬時離心；4.5小心加入約630[xl的混合溶液至QIAamp柱中，將QIAamp柱套在收集管上，然後8000rpm離心5秒，使液體通過濾膜；4.6棄去收集管中的液體，重複步驟4.6;4.7棄去收集管中的液體，小心加入750pl的AW1緩衝液至QIAamp柱中，8000rpm離心5秒，使液體通過濾膜；4.8棄去收集管中的液體，小心加入750pi的AW2緩衝液至QIAamp柱中，8000rpm離心5秒，使液體通過濾膜；4.9棄去收集管中的液體，13000rpm再次離心1分鐘；4.10將QIAamp柱放入一支幹淨的1.5ml的離心管中；4.11向膜上加入40)il的EB緩衝液，然後室溫靜置2-5分鐘；4.128000rpm離心1分鐘，離心下來的液體即為所需的核酸溶液；4.13RNA的檢測4.13.1將制膠用具以及電泳槽用水沖洗乾淨後，使用3%過氧化氫室溫浸泡15分鐘，最後使用lxTBE沖洗2-3次，再加入lxTBE電泳緩沖液。4.13.2將1.20/o瓊脂糖凝膠方tA水平電泳槽中，將RNA樣品(2-5pl)和等體積的2xGelloadingbufferAmbion混合均勻，加到凝膠點樣孔中，電泳。4.13.3將膠在EB溶液中染色IO分鐘，紫外燈檢測。4.13.4Agilent2100bioanalyzer(Agilent公司)檢測RNA濃度和質5基因組測序5.1反轉錄第一鏈的合成5.11在200pl的PCR管中加入以下試劑(試劑盒購自invitrogen公司)mRNAl(MN6引物(lug/pl)或oligo(dT)18-20(500ug/pl)1dNTPmix(10mM)2pL5丄2在PCR儀上65。C變性5分鐘後，立即將EP管置於冰上，離心。5.1.3按照下列的配比準備反應混合物，5x1ststrandbuffer4lOOmMDTT1RNAseOUT(40U小L)1|iL5.1.4將步驟5.1.3中的6pl混合物加入步驟1中的EP管中，混勻後如果是N6引物則逆轉錄室溫(25-C)放置10分鐘，如果是oligo(dT)則42。C放置2分鐘。5丄5取出EP管後加入1^SuperscriptII(200U/W),混勻，放入PCR儀，按照以下程序進行反應Step142°C50分鐘Step270°C15分鐘Step34°C保存5.2保守區引物設計在NCBI資料庫(http:〃www.ncbi.nlm.nih.gov/)中選取已經提交的小RNA病毒序列，通過軟體比對進行保守區篩選，對保守區高的部分選取相應的序列作為引物，對於分段擴增的區域，引物擴增片段需要有200bp左右的重疊區。這裡以比對軟體megalign為例，列舉引物設計過程。首先，從NCBI下載一系列序列，用megalign中的聚類clusterW進行一個聚類，獲得比對結果，如附圖1所示。黑箭頭表示選取出的保守區高的區域，可以用來作為擴增引物，對於一條片斷長度大的病毒，可以選取多個這樣的區域，將病毒分為幾個相互重疊的片段，分別進行擴增測序，選取的序列可以有個別鹼基的不同，但不要出現在3，區。EV71五對序列分別設計為EV71F1TTAAAACAGCTGTGGGTTGEV71R1CGTTTATGTATGGCACTATTATEV71F2CCAGAGTATGTCATTGGGACAGTEV71R2TATCCACGCCCTGACGTGCTTCAEV71F3CCATTCATGTCACCTGCGAGEV71R3CGGTGTTTGCTCTTGAACTGCATEV71F4TCCTGGCTCAAGAAGTTCAATGAEV71R4TTAACCCACTGGATCTCTCCTTEV71F5AAAAGTTTAGGGATATCACCAAEV71R5GCTATTCTGGTTATAACAAA5.3保守區引物擴增5.3.1配置PCR擴增體系根據所用酶的不同，按照擴增酶的說明書配置PCR擴增體系(根據擴增結果和擴增保真度要求改變PCR擴增體系，一般taq酶擴增就可滿足要求)，taq酶擴增體系如下反應體系組成體積體積Taq酶0.250.1nl10xBuffer52^dNTP(10mM)4^11.6^上遊引物(20^m)2^0.8^1下遊引物(20pm)2^0.8^超純水35.7514.1模板DNA(步驟2所得)1^0.6^1總體系50[il20PCR擴增體系配置過程需在水上完成，注意不同模板之間的區分，PCR擴增體系需混合均勻，且PCR管管蓋要蓋嚴，防止PCR體系在反應過程中蒸乾。5.3.2PCR擴增及檢測將PCR管放在PCR儀上，合上PCR儀頂蓋並蓋緊，根據設計的保守區引物的TM值，設置PCR反應程序，PCR程序如下94°C5分鐘94°C30秒、(Tm-3畫5)。C72°C72°C10°C45秒l分30秒5分鐘保存35-40個循環反應完畢，取出PCR管，4。C短期存放；用2。/。濃度的TAE瓊脂糖凝膠電泳檢測。5.4PCR產物回收和連接5.4.1PCR產物膠回收a.徹底洗淨電泳槽和配膠槽，然後用純水或lxTAE衝洗2-3遍；在洗淨電泳槽中加入新的lxTAE緩沖液，並配製一塊2%的瓊脂糖凝膠。b.將5pl6x溴酚藍加入20^DNA溶液中，混勻後加入到一個加樣孔中，每個樣品需要隔一個加樣孔，點上相應DNAmarker。c.100V電泳2小時，電泳時環境溫度不能過高。d.將染色槽用自來水清洗乾淨後用純水或lxTAE沖洗2-3遍，倒入新的lxTAE;加入適量EB,攪拌均勻，將膠放入染色槽，染色IO分鐘;e.取一2ml的eppendorf管，並記錄重量，備用；f.取一張保鮮膜，將染好的膠放在膜上，放入凝膠成像儀照相併存儲膠圖，然後將膠連同膜放於紫外分析儀上，準備切膠；g.以DNAmarker做為參照，切取目的條帶，放入稱量好的eppendorf管中，每個樣品用一個對應的刀片；h.將切割後的凝膠放入凝膠成像儀照相併存儲膠i.稱量放有膠塊的eppendorf管重量，並記錄；j.用AxygeneGelExtractionKit(Axygene^^司)進4亍月交純4b回收，回收產物溶於20plDHPC水。k.取2pl電泳確定膠回收正確，並估測PCR回收產物濃度。5.4.2連接以目前使用的TaKaRaPMD18-T連接試劑盒(TaKaRa公司)為例反應體系組成體積PCR回收產物4.5pipMD18-Tvector0.5nlSolutionI5^1總體積10nl連接體系4'C過夜連接(通過改變PCR回收產物和pMD18-T的含量可以提高連接效率)，第二天回收連接產物，-20匸冷凍保存或者轉化。5.5化學轉化5.5.1AIX平板準備a.用70%的乙醇擦拭潔淨工作檯、各移液衝&,將平亞全部攤開擺放，開紫外照射。b.從烘箱中取出LB固體培養基，並使其冷卻到用手掌捂住不會感覺到太燙手，放入潔淨工作檯照紫外。c.紫外照射約20分鐘以後，關閉紫外，開送風排臭氧。d.以氨千抗生素(AMP):培養基-1:1000的比例在培養基中加入AMP,充分搖勻，注意消除氣泡。e.往平皿中倒入培養基，等所有平板的培養基全部凝固後，收板，倒置。f.根據平板大小配製IPTG+X-GAL的混合液(1:4),一般的用量標準為9cm平板加30ptl混合液，12cm平板力口45nl混合液，15cm平板力口65^混合液。g.將塗布器用70%的乙醇浸溼，並放在乙醇燈上灼燒殺菌後，可放在平板頂蓋的內側面上冷卻至室溫。h.按加量標準在各平板中加入IPTG+X-GAL的混合液，用已冷卻的塗布器將其均勻的塗布在平才a面上，至塗幹。i.塗菌時加菌液量標準同上，塗布時不要塗得太幹，否則菌無法生長。j.塗板完成後，在平板背面標記所塗內容及塗布時間。5.5.2連接產物轉化a.將感受態細胞(CaCl2法製備的感受態細胞)置於冰上融化；給各EB管編號，並以每管100pl的量分裝感受態細胞。b.將10pl步驟5.4所得連接產物和1-2pl質粒(陽性對照)分別加入到lOOpl感受態細胞中，輕柔吹打混勻，水浴30分鐘。c.42。C熱敷90秒，並立刻放回冰浴2-5分鐘。d.每PE管加入800^的LB液體培養基，37°C200rpm搖床培養l小時。e.5000rpm離心5分鐘，棄上清700pl。f.將PE管內剩餘的約100nl菌液吹打混勻，塗平板。g.將塗布好的平板置於培養箱中，37t:培養14-16小時。h.第二天回收平板，觀察培養狀況，進行克隆鑑定。5.6克隆鑑定通過菌落PCR驗證上述步驟轉化獲得的白斑克隆是否是陽性克隆，步驟如下5.6.1用滅過菌的牙籤挑取白色斑點的單克隆溶於10^無菌水中，從IOW菌液中吸取3pl做PCR反應，程序可以按照先前設定的10目的片革殳擴增的程序進行反應體系為模板DNATaq酶10xBufferdNTP(10mM)上遊引物(20^m)下遊引物(20^m)超純水總體積3^1;0.12化I.60.80.8II.7"20pl5.6.2電泳;險測菌落PCR結果，將陽性結果菌液接入到液體LB培養基中，37。C和200-220rpm振蕩培養12-16小時。5.7質粒提取(試劑盒購自axygen公司)將接入LB液體培養基的菌液收集1ml保存菌種，剩餘LB菌液提取質粒5.7.1取1-4ml在LB培養基中培養過夜的菌液於離心管中，12000rpm離心1分鐘，棄去上清。5.7.2用250^1已加入RNaseA的BufferSI均勻懸浮細菌沉澱。5.7.3加入250^BufferS2，溫和並充分地上下翻轉混合4-6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液。5.7.4加入350|alBufferS3,溫和並充分地上下翻轉混合6-8次，12000rpm離心10分鐘。5.7.5吸取步驟4中的離心上清並轉移到DNA製備管(置於2ml離心管中)，12000rpm離心1分鐘。5.7.6將製備管置回離心管,加500^BufferWl,12000rpm離心1分鐘，棄濾液。5.7.7將製備管置回離心管，加700nlBufferW2,12000rpm離心1分鐘，棄濾液，以同樣的方法再用700piBufferW2洗滌一次。棄濾液。5.7.8將製備管置回2ml離心管中，12000rpm離心1分鐘。5.7.9將製備管移入新的1.5ml離心管中，在DNA製備膜中心加60-80nl無菌水，室溫靜置2分鐘，12000rpm離心1分鐘。5.7.10電泳鑑定正確。5.8測序將電泳鑑定質粒提取效果好的樣品送樣測序。將測序結果通過專業生物學軟體Seqman進行拼接，通過上述軟體將各個片段一一拼接，可以獲得全長小RNA病毒基因組序列，通過測定多個獨立克隆，可以得到準確的病毒基因組。病毒基因組序列分析序列一致性分析利用網站分析方法http:〃www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index,html，將目標序列輸入到網站數據提交處，參數無特殊要求，點擊運行就可獲得結果。1.病毒的生物信息學分析Shzh/S121/08/CHN%A=27.30%G=23.81%T=24.55%C=24.34%Ambiguous=0.000/oA+T=51.85%C+G=48.15Totalnumberofbasesis7404[3565]2.核苷酸序列分析:SEQIDNO:l與其他病毒抹各區核苷酸水平一致性分析clastalWregionNo.ofcomparedBrCrMSshzh98shzh03TW/2086/98TW/2272/985865/sin/000009CA16G105，UTR7508686969786878882PIregion25868183卯9489878368VP42078384949687878468VP27628082919288888270VP37268282879490898172VP18918284929589848359P2region173477829094797981812A450798291948383807912tableseeoriginaldocumentpage133.胺基酸序列分析http:〃www,ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.htmlSEQIDNO:2與其他病毒林各區胺基酸水平一致性分析clastalWtableseeoriginaldocumentpage13VPl區進化樹分析利用進化樹分析軟體mega3進行分析。分析結果見附圖2，通過對該抹病毒的VP1基因序列與已經公布的腸道病毒71型的基因序列進行核苷酸親緣關係樹分析比較，確定了其為C4亞型。病毒基因組為7404個核苷酸的單股正鏈RNA，僅有一個開放閱讀框(ORF)，編碼2194個胺基酸的多聚蛋白，在其兩側為5'和3，非編碼區(UTRs),在3，非編碼區的末端含有一個長度可變的多聚腺苷酸尾巴(polyA)。多聚蛋白可進一步被水解成P1、P2、P3三個前體蛋白，Pl前體蛋白可降解成VP1、VP2、VP3、VP4四個病毒外殼蛋白，抗原決定簇基本上位於VP1-VP3上，而VP1蛋白是主要的病毒中和決定因子，它直接決定病毒的抗原性，具有與病毒血清型完全對應遺傳多樣性，以及其變異快速的特點，VP1基因成了EV71基因分型的最重要的對象。所述序列可用於製備用於預防EV71型腸道病毒感染疫苗。所述序列還可用於製備腸道病毒71型中和抗體。序列表深圳市第三人民醫院腸道病毒71型基因組的序列及其應用1Patentlnversion3.517404RNA人腸道病毒1uuaaaacagcuguggguugcacccacucacagggcccacugggcgcaagcacucugguac60cucgguaccuuugugcgccuguuuuauaccccccccccagugaaacuuagaagcagcaaa120ccacgaucaauagcaggcauaacgcuccaguuaugucuugaucaagcacuucuguuuccc180cggaccgaguaucaauagacugcucgcgcgguugaaggagaaaacguucguuauccggcu240agcuacuucgggaaaccuaguaacaccaugaaaguugcggagggcuucguucagcacucc300cccaguguagaucaggucgaugagucaccgcauuccccacgggcgaccguggcgguggcu360gcguuggcggccugcccaugggguaacccauggggcgcucuaauacggacauggugugaa420gagucuacugagcuaguuaguaguccuccggccccugaaugcggcuaaucccaacugcgg480agcacacgcccacaagccagcggguagugugucguaacgggcaacucugcagcggaaccg540acuacuuuggguguccguguuuccuuuuaucuuuauauuggcugcuuauggugacaauua600aagaauuguuaccauauagcuauuggauuggccauccagugugcaacagagcaauuguuu660accuauuuauugguuuuguaccauuaaccuugaagacugugaccacccuuaauuauaucu720ugacccuuaacacagcuaaacauggguucgcaggugucuacacagcgcuccgguucucac780gaaaacucaaacucagccacugaggguuccaccauaaacuacaccaccauuaauuauuac840aaagacuccuaugcugcuacagcaggcaaacagagucucaagcaggauccagacaaguuu900gcaaauccuguuaaggacaucuucacugaaauggcagcgccacugaaguccccauccgcu960gaggcaugcggauacagugaucgaguggcgcaauuaacuauuggcaacuccaccaucacu1020acgcaagaagcggcuaacaucauagucgguuauggugaguggccuuccuacugcucggau1080ueugacgcuacagcaguggauaaaccaacgcgcccggauguuucagugaauagguuuuac1140acauuggacacuaaauugugggagaaaucguccaagaguugguacuggaaguucccggau1200gugcuaacugaaacugggguuuuugggcaaaaugcacaauuucacuaccucuaccgauca1260ggguuuuguauucacgugcagugcaaugcuaguaaauuccaccaaggagcacucuuaguu1320gcuguccuaccagaguacgucauugggacaguggcaggcgguacagggacggaagacagu1380caccccccuuacaagcagacucaaccuggugccgauggcuucgaguugcaacacccguac1440guacuugaugccggcaucccaauaucacaguuaacagugugcccacaccaauggauuaau1500uugagaaccaacaacugcgcuacaauaauaguaccauacaucaaugcacugccuuuugau1560ucugcc皿gaaccauugcaacuuuggccuauuaguugugccuauuagcccacuagauuac1620gaccaaggagcgacgccaguaaucccuauaacuaucacauuggccccaaugugcucugaa1680uucgcaggucuuaggcaggcagucacgcaaggguuucccaccgagcugaaaccuggcaca1740aaucaauuucugaccacugaugauggcguuucagcaccuauucuaccaaacuuccacccc1800accccuuguauccauauaccuggugaaguuaggaacuugcuggaguuaugccagguggag1860accauucuggagguuaacaaugugcccacgaaugccacuagcuuaauggagagacugcgc1920uuuccggucucagcacaagcagggaaaggugagcugugugcaguguucagagccgacccu1980gggcgaaauggaccguggcaguccaccuugcugggucaguugugcggguacuacacccaa2040uggucaggaucauuggaagucaccuucauguuuacuggauccuucauggcuaccgguaag2100augcucauagccuauacaccgccaggaggcccuuugcccaaagaccgggcgaccgccaug216016uugggcacgcacgucaucugggauuuugggcugcaaucgucuguuacccuugugauacca2220uggaucagcaacacucacuauagagcgcacgcucgagauggaguguuugauuacuacacc2280acagggcuagucaguauaugguaucagacgaauuacgugguuccaauuggggcgcccaau2340acagccuauauaauagcacuagcggcagcccaaaagaacuucacuaugaaauugugcaag2400gaugcuagugauauccugcagacgggcaccauccagggagauaggguggcagaugu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40cgguggaccaaggaugcacgcaauacucaagaucacgugcgaucccuaugucuauuggca7200uggcauaacgguaagcaagaauaugaaaaauuugugagcucaauuagauccgucccaaua7260ggaaaagcauuggcaauucccaacuaugaaaaccugagacguaauuggcucgaauuguuu7320uagaggucgaacaaaccucaaccccaccagaaaucuggucgcgaaaaugacugguggggg7380uaaauuuguuauaaccagaauagc740權利要求1、一種腸道病毒71型全基因組序列，其特徵在於，所述序列具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列。2、權利要求1所述的序列及與所述序列同源性達50-95%的序列在製備用於預防腸道病毒71型疫苗和血清學ELISA診斷試劑中的用途。3、權利要求1所述的序列及與所述序列同源性達50-95%的序列在製備抗腸道病毒71型中和抗體中的用途。全文摘要一種腸道病毒71型全基因組序列，其具有SEQIDNO1所示的核苷酸序列，所述序列可用於製備預防腸道病毒71型疫苗和用於製備抗腸道病毒71型中和抗體。該序列為進一步獲得我國華南地區EV71型遺傳衍化特徵提供了客觀依據，為進一步研製開發針對我國不同地區發病人群的血清學酶聯免疫吸附試驗(ELISA)診斷試劑和疫苗提供了可靠的數據資料，為深入研究EV71的遺傳變異規律及手足口病的致病機制提供了寶貴資源。文檔編號C07K16/08GK101509003SQ20091010617公開日2009年8月19日申請日期2009年3月23日優先權日2009年3月23日發明者劉威龍,劉映霞,周伯平,張明霞,徐六妹,楊桂林,陳心春申請人:深圳市第三人民醫院