環肽ym-216391的生物合成基因簇的製作方法
2024-04-05 23:05:05
專利名稱：環肽ym-216391的生物合成基因簇的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物基因資源和基因工程領域，具體涉及具有抗腫瘤活性的環肽 YM-216391的生物合成基因簇的克隆、分析、功能研究及其應用。
背景技術：
環肽YM-216391 (1，圖 1)由高貴鏈黴菌 Mi^ptomyces nobilis JCM 4274 所產生，是2005年由日本科學家K. Sohda等在尋找新的抗癌藥物的過程中發現的新型環肽類化合物，它具有良好的抗腫瘤活性[J. Antibiot. (2005)58,27-31 ;J. Antibiot. (2005)58， 32-36]。環肽YM-216391具有獨特的化學結構，包含2，4-連接的4個噁唑環和1個噻唑環， 其兩端由D-allo-異亮氨酸殘基-L-纈氨酸殘基-甘氨酸殘基組成的三肽連接並成環，該結構與受到科學家廣泛關注的端粒酶抑制劑Telomestatin(2，圖1)以及同樣具有抗腫瘤活性的 IB-01211(3，圖 1), Urukthapelstatin A (4，圖 1)的結構非常相似。體外實驗顯示環肽YM-216391對人宮頸癌HeLa S3細胞生長具有很強的抑制活性，其細胞生長半數抑制劑量IC5tl值僅為14nM。對39種腫瘤細胞系的體外篩選實驗初步表明，YM-216391可能導致腫瘤細胞的凋亡；同時通過與其他標準抗腫瘤藥物的對比分析顯示，YM-216391與其他抗腫瘤藥物的活性譜沒有特別明顯的相關性，因而不能由此推測可能的作用靶標或機制。而其活性譜與RNA聚合酶抑制劑Actinomycin D、蒽環類抗腫瘤藥物Epirubicin以及組蛋白脫乙醯化酶抑制劑FR9012^有一定相關性，然而體外生化實驗表明即使在10 μ M的濃度下(高於IC5tl值500 1000倍)，YM-216391對組蛋白脫乙醯化酶仍然沒有任何抑制作用。此外，YM-216391與Telomestatin結構類似，Telomestatin是很強的端粒酶抑制劑(IC5tl為5nM)，然而對於很多腫瘤細胞的生長抑制活性YM-216391卻比"Telomestatin高50 250倍，因此兩者是否具有不同的機制尚不清楚[J. Antibiot. (2005)58,27-31]。關於環肽YM-216391的抗腫瘤活性的更深入的藥理學、作用機制以及構效關係研究正在進行中。含噻唑啉和噻唑環的化合物除了具有明顯的生物學活性外，進一步的研究表明它們能通過氫鍵或配位作用與小分子或者金屬離子相結合。化學合成的含噻唑啉-噻唑環結構的手性大環分子與1 2+和Cd2+具有較強的親和能力，並且在金屬離子的選擇上有高度的特異性，這在環境汙染的檢測和治理上有很大的應用潛力[Chem. Commim. (2007) 10， 3444-3446]。因此，經結構改造後的環肽YM-216391的衍生物在結合併檢測重金屬離子方面也有很大的應用價值。環肽YM-216391及其類似物的獨特的化學結構和良好的抗腫瘤活性吸引了許多有機化學家從事其化學合成研究[Chem. Commun. (2005)8,797-799 ；Org. Biomol. Chem. (2008)6，1994-2010 J.Med. Chem. (2008)51，5722-5730 ；Org. Lett. (2006)8，4165-4167 ； Org. Lett. O007)9，809-811]。化學合成方法得到的大量結構類似物可以用於構效關係的研究等，對多聚噁唑環-噻唑環類環肽藥物發展具有重要意義。然而由於這些合成路線非常複雜，產率不高，因此還不能真正應用到藥物生產中。而通過基因工程改造，利用微生物發酵的方法在提高環肽YM-216391的產量以及獲得新的候選化合物方面都具有獨特作用。我們以鏈黴菌來源的環肽YM-216391為目標分子，從克隆其在Mi^ptomyces nobilis JCM 4274(購自日本RIKEN生物資源中心)中的生物合成基因簇出發，採用微生物學、分子生物學、生物化學及有機化學相結合的方法研究其生物合成，通過體內基因操作，異源表達、體外蛋白活性測定等方法，提高其發酵產量，研究其生物合成機理，併合理修飾YM-216391的生物合成途徑，探索結構穩定、活性更好、並能通過微生物大量發酵的新型 YM-216391結構類似化合物。
發明內容
本發明涉及一種由高貴鏈黴菌Mi^ptomyces nobilis JCM 4274產生的具有抗腫瘤活性的環肽YM-216391的生物合成基因簇的克隆、測序、分析、功能研究及其應用。本發明中整個基因簇共包含10個基因的核苷酸序列或互補序列(序列1)，其中基因ymB編碼環肽YM-216391的前體肽，該前體肽包含信號肽和結構肽兩個部分；4個基因 (ymC, ymE, ymF, ymH)編碼的蛋白負責催化形成噻唑環和噁唑環；基因ymA編碼的蛋白負責催化異亮氨酸殘基的異構化；基因ymD編碼的蛋白負責催化苯丙氨酸殘基的β-羥化；基因ymG編碼的蛋白負責信號肽的切除與結構肽的環化；還包括2個調節基因(yml，ymj)。本發明還提供了一個編碼環肽YM-216391的前體肽的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列2中，命名為YmB，其基因的核苷酸序列位於序列1中第5652-5762個鹼基處。本發明還提供了一個編碼催化環肽YM-216391的噻唑環和噁唑環形成的雜環化酶的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列3中，命名為YmC，其基因的核苷酸序列位於序列1中第58M-7284個鹼基處。本發明還提供了一個編碼催化環肽YM-216391的噻唑環和噁唑環形成的雜環化酶的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列4中，命名為YmE，其基因的核苷酸序列位於序列1中第8809-9594個鹼基處。本發明還提供了一個編碼催化環肽YM-216391的噻唑環和噁唑環形成的FAD依賴的氧化還原酶的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列5中，命名為YmF，其基因的核苷酸序列位於序列1中第9591-10547個鹼基處。本發明還提供了一個編碼催化環肽YM-216391的噻唑環和噁唑環形成的NADH脫氫酶的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列6中，命名為YmH，其基因的核苷酸序列位於序列1中第11697-13175個鹼基處。本發明還提供了一個編碼異構酶的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列7 中，命名為YmA，其基因的核苷酸序列位於序列1中第4640-5662個鹼基處。本發明還提供了一個編碼細胞色素P450氧化酶的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列8中，命名為YmD，其基因的核苷酸序列位於序列1中第7310-8812個鹼基處。本發明還提供了一個編碼蛋白酶的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列9 中，命名為YmG，其基因的核苷酸序列位於序列1中第10555-11700個鹼基處。本發明還提供了一個編碼轉錄調節因子的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列10中，命名為YmI，其基因的核苷酸序列位於序列1中第13166-13885個鹼基處。
本發明還提供了一個編碼轉錄調節因子的核苷酸序列，其編碼的胺基酸序列位於序列11中，命名為YmJ，其基因的核苷酸序列位於序列1中第13899-14399個鹼基處。序列1的互補序列可根據DNA鹼基互補原則得到。序列1的核苷酸序列或部分核苷酸序列可以通過聚合酶鏈式反應(PCR)或用合適的限制性內切酶酶切相應的DNA或使用其他合適的技術得到。本發明提供了得到至少包含部分序列1中DNA序列的重組DNA質粒的途徑。本發明所提供的核苷酸序列或部分核苷酸序列，可利用聚合酶鏈式反應(PCR)的方法或包含本發明序列的DNA作為探針以Southern雜交等方法從其他生物體中得到與環肽YM-216391生物合成基因相似的基因。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆DNA可用於從高貴鏈黴菌Mi^ptomyces nobilis JCM 4274基因組文庫中定位更多的文庫質粒。這些文庫質粒至少包含本發明中的部分序列，也包含有Mi^ptomyces nobilis JCM4274基因組中以前鄰近區域未克隆的DNA。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列可以被修飾或突變。這些途徑包括插入、置換或缺失，聚合酶鏈式反應，錯誤介導聚合酶鏈式反應，位點特異性突變，不同序列的重新連接，序列的不同部分或與其他來源的同源序列進行定向進化(DNA shuffling)，或通過紫外線或化學試劑誘變等。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的克隆基因可以通過合適的表達體系在外源宿主中表達以得到相應的酶或得到其他致力於得到的產物。這些外源宿主包括鏈黴菌、小單孢菌、糖多飽菌、假單孢菌、大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母、植物和動物寸。本發明所提供的胺基酸序列可以用來分離所需要的蛋白並可用於抗體的製備。包含本發明所提供的胺基酸序列或至少部分序列的多肽可能在去除或替代某些胺基酸之後仍有生物活性甚至有新的生物學活性，或者提高了產量或優化了蛋白動力學特徵或其他致力於得到的性質。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以在異源宿主中表達並通過DNA晶片技術了解它們在宿主代謝鏈中的功能。包含本發明所提供的核苷酸序列或至少部分核苷酸序列的基因或基因簇可以通過遺傳重組來構建重組質粒以獲得新型生物合成途徑，也可以通過插入、置換、缺失或失活進而獲得新型生物合成途徑。本發明所提供的核苷酸序列編碼的環肽YM-216391的前體肽可以通過插入、置換或缺失，聚合酶鏈式反應，錯誤介導聚合酶鏈式反應，位點特異性突變，不同序列的重新連接等方法來產生新的環肽類化合物。包含本發明所提供的核苷酸序列編碼的蛋白可以催化合成噻唑環、噁唑環、 D-allo-異亮氨酸、L- β -羥基苯丙氨酸等結構單元，並可以通過與其他天然產物的生物合成途徑或部分生物合成途徑重組，來獲得包含有這些結構單元的化合物。包含本發明所提供的核苷酸序列編碼的蛋白可以催化合成環肽YM-216391的大環骨架和其結構類似物。本發明所提供的環肽YM-216391骨架的後修飾基因可用於通過遺傳修飾得到環肽YM-216391類似物。總之，本發明所提供的包含環肽YM-216391生物合成相關的所有基因和蛋白信息可以幫助人們理解環肽YM-216391的生物合成機制，為進一步遺傳改造提供材料和知識。 本發明所提供的基因及其蛋白質也可以用來尋找和發現可用於醫藥、工業或農業的化合物或基因、蛋白。
圖1 環肽YM-216391以及幾個結構相似化合物的的化學結構。圖2 環肽YM-216391生物合成基因簇的基因結構㈧和YM-216391的生物合成途徑⑶。圖3 包含環肽YM-216391生物合成基因簇的粘粒的限制性內切酶酶切電泳圖。圖4 環肽YM-216391生物合成基因簇在鏈黴菌S. Iividans 1326中異源表達的發酵產物的LC-MS分析。(A) Streptomyces nobilis JCM 4274 野生型菌株；(B) S. Iividans 1326，導入整合型粘粒CJXH-4C8 ； (B)質譜鑑定圖符號說明圖 1YM-216391 環肽 YM-216391 ；Telomestatin 環肽 Telomestatin ；IB-01211 環肽 IB-01211 ；Urukthapelstatin A 環肽 Urukthapelstatin A0圖 2無。圖 3DL15000 DNAmarker，條帶從上到下為 15kb、10kb、7. 5kb、5kb、2. 5kb、lkb、 0. 25kb ；DL10000 :DNA marker,條帶從上到下為 10kb、8kb、6kb、5kb、4kb、3kb、2kb、1. 5kb、 lkb、0. 5kb ；lG7BamHI/BglII 粘粒 cJXH_lG7 經 BamHI/Bglll 雙酶切；4C8BamHI/BglII 粘粒 cJXH-4C8 經 BamHI/Bglll 雙酶切；7A5BamHI/BglII 粘粒 cJXH_7A5 經 BamHI/Bglll 雙酶切；lG7XhoI 粘粒 CJXH-1G7 經 XhoI 雙酶切；4C8XhoI 粘粒 cJXH_4C8 經 XhoI 雙酶切； 7A5XhoI 粘粒 CJXH-7A5 經 XhoI 雙酶切。圖 4S. nobilis JCM 4274WT 環肽 YM-216391 產生菌 S. nobilis JCM 4274 野生型； S. Iividans 1326，+4C8 導入整合型粘粒 cJXH_4C8 的 S. Iividans 13 菌株。
具體實施例方式以下結合圖1-圖4對本發明進一步詳細說明。1.環肽YM-216391基因簇的克隆環肽類天然產物的生物合成途徑，從胺基酸聚合機制上可分為核糖體機制合成與非核糖體機制合成兩大類。環肽YM-216391中包含4個噁唑環和1個噻唑環，它們通過異亮氨酸-纈氨酸-甘氨酸形成的3肽連接並成環[J.Antibiot. (2005)58,27-31 ； J. Antibiot. (2005) 58, 32-36] 0在核糖體機制和非核糖體機制合成途徑中，噁唑環或噻唑環都是由相同的胺基酸經過雜環化得到，噁唑環一般都來源於絲氨酸、蘇氨酸，以及其它β-羥基胺基酸等，噻唑環一般來源於半胱氨酸等[Biochemistry 2001，40，5313-5321 ； Chem. Biol. (2004) 11，261—271 ；Proc. Natl. Acad. Sci. USA. (2005) 102, 7315-7320 ；Chem. Biol. (2009) 16,141-147] 0而在上述兩種不同途徑中，負責催化雜環形成的酶在胺基酸序列上有很大差異。我們針對這兩種不同途徑，基於已有的核糖體機制中的環化脫水酶和非核糖體機制中的NRPS環化結構域的保守區域，分別設計了兼併性引物，以來源於鏈黴菌 Streptomyces nobilis JCM 4274的基因組DNA為模板，進行聚合酶鏈式反應(PCR)擴增。 PCR產物經克隆、DNA測序分析表明，與已知的雜環化酶基因有很高的同源性。進一步的基因中斷實驗發現，得到的所有基因的中斷突變菌株不能阻斷YM-216391的生物合成。上述實驗結果說明了在鏈黴菌Mi^ptomyces nobilis JCM 4274中，YM-216391中噁唑環或噻唑環的催化形成不是由上述克隆得到的雜環化酶所負責，而是由其他未知的蛋白所催化的。 由於沒有更有依據的其他推測途徑可以用於YM-216391基因簇的克隆，我們考慮從鏈黴菌 Streptomyces nobilis JCM 4274的基因組測序出發，尋找並克隆其生物合成基因簇。在鏈黴菌Mi^ptomyces nobilis JCM 4274的基因組序列中，本發明人通過基因組搜索以及BLAST比對、功能分析的方法，尋找到了負責YM-216391生物合成的基因簇。 然後採用PCR篩選基因組文庫的方法，得到了包含YM-216391生物合成基因的3個粘粒 CJXH-1G7，cJXH-4C8，cJXH_7A5。將篩選得到的粘粒用BamHI+Bglll酶切分組並對其相對位置進行關聯，3個粘粒共涵蓋了染色體約501Λ的區域。通過與全測序得到的基因簇序列的BamHI+Bglll酶切圖譜進行比較，證實上述3個粘粒包括預期的基因簇。分別用針對基因簇中的每個基因的特異性引物對這3個粘粒進行PCR檢測，都擴增得到了特異性條帶，進一步證實該3個粘粒都包含有全部的YM-216391生物合成的基因。2.環肽YM-216391的生物合成基因簇的序列分析及功能分析本發明人分析了基因組中包含YM-216391生物合成基因簇的21，OOObp連續核苷酸序列，其GC含量為70. 53%，共包含了 17個開放式讀碼框(open reading frame, 0RF)， 其中與環肽YM-216391生物合成相關的有10個。各個基因功能的分析結果見表1。表1環肽YM-216391生物合成基因簇中各基因編碼蛋白的功能分析基因胺基酸相似蛋白推測功能同一性/數目相似性ymA340假定蛋白異構酶34/50(Hypothetical protein) (CAE81053)ymB36無前體肽無ymC476雜環化蛋白(TpdO) (ACS83760)雜環化蛋白29/38ymD500細胞色素P450家族蛋白P-450羥化酶34-50(Cytochrome P450 family protein)(EDM74971)ymE261雜環化蛋白(OsJ_21831) (EAZ37497)雜環化蛋白34/41ymF318亞硝酸還原酶大亞基(Nitrite reductaseFAD依賴的氧化還原酶27/41large subunit) (CAM04176)ymG381預測蛋白蛋白酶37/51(Predicted protein) (AC063355)ymH492硝基還原酶NADH脫氫酶41/55(Nitroreductase) (ABQ92956)yml239AraC家族調節因子(AraC family轉錄調節因子54/71regulator) (ZP_05504212)ymJ166Mar 家族調節因子(Mar family regulator)轉錄調節因子70/86(ACZ86477)3.環肽YM-216391的生物合成基因簇邊界的確定根據對生物合成基因簇以及兩側的基因編碼的蛋白的功能分析，我們初步判定環肽YM-216391的生物合成基因簇從基因pnA到pnj(圖幻，共10個開放式讀碼框，涵蓋染色體9. 76kb的區域。其中1個基因(ymB)用於編碼環肽YM-216391的前體肽；4個基因 (ymC, ymE, ymF, ymH)用於編碼噁唑環或噻唑環合成酶；1個基因(ymA)用於編碼異構酶；1 個基因(ymD)用於編碼P-450氧化酶；1個基因(ymG)用於編碼蛋白酶；還包括2個調節基因(yml, ymj)。4.環肽YM-216391中前體肽的生物合成基因簇中的基因ymB負責編碼YM-216391的前體肽，該前體肽由兩端的信號肽和中間結構肽部分組成。N端信號肽序列MTAEIEEVDIEVG，以及C端信號肽序列 SLELEEDDLDVAADE，主要作用負責後續催化蛋白對前體肽的識別和轉運等；中間結構肽序列 FIVGSSSC，與環肽YM-216391的大環骨架的胺基酸前體順序完全吻合。這也從基因水平上證實了環肽YM-216391的大環骨架是按照核糖體機制來合成的。該過程類似於細胞中蛋白質和多肽的生物合成，在核糖體中經過翻譯逐步形成環肽YM-216391的聚肽鏈前體，前體經水解釋放後，再由後續的酶催化形成各種雜環單元，以及大環骨架和其他後修飾基團。5.環肽YM-216391中噁唑環和噻唑環單元的生物合成根據基因簇中的基因ymC和ymE所編碼的蛋白的生物信息學分析，ymC和ymE負責編碼環化脫水酶或雜環化酶，它們負責催化肽鏈骨架上的絲氨酸和β -羥基苯丙氨酸殘基上的羥基或半胱氨酸殘基上的巰基進攻上遊鄰位的羰基，形成5元N雜環，接著脫去一分子水，形成噁唑啉或噻唑啉。然後由ymH編碼的NADH脫氫酶或ymF編碼的FAD依賴的氧化還原酶催化脫去一分子氫，將噁唑啉或噻唑啉分別轉變為噁唑或噻唑。由β-羥基苯丙氨酸殘基形成的噁唑單元需要在苯丙氨酸殘基的β-羥基化和肽鏈大環骨架成環以後才能催化形成，因此其在生物合成途徑中的合成時序與其他噁唑或噻唑單元不同，負責催化這兩種反應的酶在底物選擇上也有差異。具體來說，在第一步的雜環化中，基因ymC和ymE所編碼的蛋白協同作用，形成3個噁唑啉或1個噻唑啉，然後經ymH編碼的NADH脫氫酶作用形成噁唑或噻唑；在第二步雜環化中，基因ymE所編碼的環化脫水酶作用於聚肽大環環合後的底物，形成第4個噁唑啉，然後經ymF編碼FAD依賴的氧化還原酶作用形成噁唑。6.環肽YM-216391中β -羥基苯丙氨酸殘基的生物合成ΥΜ-216391生物合成基因簇中存在一個細胞色素Ρ450氧化酶基因ymD，負責環肽 YM-216391生物合成途徑中的氧化後修飾，催化YM-216391上苯丙氨酸殘基的β-位的羥化，具體催化底物可以是線性前體肽，也可以是大環環合以後的環肽。催化生成的苯丙氨酸 β -位的羥基作為親核基團，進攻鄰位的羰基形成第4個噁唑環。7.環肽YM-216391中D-allo-異亮氨酸殘基的生物合成環肽YM-216391中的異亮氨酸經過NMR分析、酸水解分析、化學全合成等方法證實了其構型為 D-allo-異亮氨酸[J.Antibiot. (2005) 58，32-36 ； Chem. Commun. (2005)8, 797-799]，而核糖體機制可以利用的天然異亮氨酸構型為L-異亮氨酸，因此在YM-216391 的生物合成途徑中必然存在一個起異構化作用的蛋白負責其構型的轉變。經過生物信息學分析，推測基因ymA編碼的蛋白負責催化L-異亮氨酸殘基的異構化，形成D-allo-異亮氨酸。8.環肽YM-216391生物合成基因簇的應用——通過對環肽YM-216391生物合成基因簇的異源表達可以在異源宿主中合成環肽YM-216391將包含全部YM-216391生物合成基因簇的粘粒cJXH_4C8，通過實施例5中屬間接合轉移的方法導入到變鉛青鏈黴菌Mi^ptomyces lividans 13 中，經阿泊拉黴素抗性篩選，得到異源表達突變株。突變株通過基因型驗證正確後，參照實施例7中的發酵和檢測方法進行表型分析，通過LC-MS檢測在突變株中新產生的環肽YM-216391化合物。結果表明， 環肽YM-216391生物合成基因簇可以在變鉛青鏈黴菌Mi^ptomyces lividans 13 中表達並催化產生環肽YM-216391化合物。以下進一步提供實施實例，這些實施實例有助於理解本發明，僅用作說明而不限制本發明的應用範圍。實施例1環肽YM-216391 產生菌鏈黴菌 Sti^ptomyces nobilis JCM 4274 總 DNA 的提取將100 μ L IxlO8 鏈黴菌 Sti^ptomyces nobilis JCM 4274 孢子懸液接種到 31^15 -2(酵母提取物0.4%，麥芽提取物1.0(%，葡萄糖0.4(%，？!1 7.2)液體培養基中， 30°C，230rpm培養約Mhr後達到對數生長期後期，取2mL接種到50mLISP_2中(含25mM 氯化鎂)，30°C，250rpm培養約23hr後達到穩定生長期前期，呈乳黃色渾濁，將菌液4°C， 3500rpm,離心15min收集菌絲，用裂解液洗滌，收集淡乳黃色菌絲0. 5mL。向ImL菌絲中加入IOmL裂解液(含溶菌酶5mg/mL)共四管，渦旋至均一，37°C水浴15min。加入0. ImL蛋白酶K(10mg/mL，用裂解液新鮮配製)，ImL 10%十二烷基硫酸鈉，混勻後迅速放入70°C水浴 15min，呈澄清。置冰上冷卻，加入2. 5mL 5M KAc，冰上冷卻15min。加入IOmL飽和酚，充分混勻，加入IOmL氯仿，混勻，12000rpm，4°C離心20min。用破口的槍頭將水相吸出置於新的離心管，加等量的氯仿-異戊醇04:1)抽提，12000rpm，4°C離心lOmin。用破口的槍頭將水相吸出置於新的離心管，加2倍的無水乙醇，混勻，有大團的DNA出現。將其鉤出置於新的離心管，加5mL70%乙醇洗滌，將液體傾出，用槍吸淨，加5mL TE溶解，加RNase A使終濃度為50 μ g/mL，37°C溫育0. 5小時。依次用等體積的飽和酚抽提兩次，氯仿-異戊醇抽提兩次，向水相中加入0. 1體積的3M醋酸鈉，2體積的無水乙醇，輕輕的混合充分，有絮狀DNA 出現。將四管DNA合併到兩管(每管中有ImL 70%乙醇用於洗滌)，將液體吸出，再加ImL 無水乙醇洗滌，吸出乙醇，超淨臺中吹乾，溶於適當體積的TE(pH 8.0)中。實施例2環肽YM-216391產生菌鏈黴菌Mi^ptomyces nobilis JCM 4274遺傳轉移系統的
建立培養含有適當質粒的E. coli ET12567至OD6qqO. 4-0. 6，20mL LB培養液中的細菌細胞離心收集，用等體積的LB洗兩次，重懸於2mL LB中，作為大腸桿菌供體細胞。取適量凍存於_80°C的Sti^ptomyces nobilis JCM 4274的20%甘油孢子懸液500 μ L，用等體積的TES (2-[(三(羥甲基)甲基)氨基]-1-乙磺酸)緩衝液(50mM TES Na, pH 8. 0)洗兩次，重懸於等體積的TES緩衝液，50°C熱激IOmin使孢子萌發。再加等體積的TSB培養基， 37°C溫育2Hir。離心重懸於0. 5-lmLLB中作為鏈黴菌受體細胞。將不同濃度的受體細胞 100 μ L與等體積的供體細胞混合直接塗布在含有IOmM氯化酶的MS平板培養基(甘露糖醇 2. 0%，黃豆粉2. 0%，瓊脂粉2. 0% )上，30°C溫浴20hr後，採用無菌水輕輕洗滌平板表面以洗去大部分大腸桿菌，在每一平板的表面覆蓋ImL含萘啶酮酸(終濃度為50ng/ μ L)和相應抗生素的無菌水。30°C培養5天以上挑取接合子。實施例3環肽YM-216391產生菌鏈黴菌Mi^ptomyces nobilis JCM 4274基因組文庫的構建EPI300-T1K菌種的復甦將試劑盒中提供的宿主菌EPI300_T1K取出，塗布或者畫線於不含任何抗生素的LB平板上，37°C過夜培養後保存於4°C冰箱中(最好不超過一個星期)。在準備包裝的前一天，從保存的平板上挑取單克隆於含IOmM硫酸鎂的50ml LB中， 37 °C過夜培養。文庫載體的製備使用含有三個cos位點的P0J446-152作為載體構建基因組文庫。製備方法如下用EcoRV單酶切，然後脫磷(防止載體自連)。插入片段的製備Cosmid DNA文庫插入片段的大小在401Λ左右，其製備可以使用注射器或者小孔的吸管(移液管)通過反覆的吸取和推出來實現，次數根據片段原始的大小來決定，一般每50次用電泳檢查一次效果，直至片段大小合乎要求(10%左右的片段在 36kb的對照DNA附近)。此步驟中，基因組總DNA的用量最少在2. 5 μ g以上。目標片段的蔗糖梯度分離及回收取進口蔗糖梯度離心管(高速離心管，體積 10ml，直徑約Icm) —只，加入6ml 40%蔗糖，然後小心在其頂部加入6mll0%蔗糖。用封口膜將管口封住(可以用繩子扎住)，在幹毛巾上緩慢地將管子傾斜成水平位置，用其本身地氣泡來調平，室溫下放置3. 5小時。緩慢將管子回復回復垂直位置，蔗糖梯度即成。拿掉封口膜，把待分離的已打碎的總DNA樣品加在12ml的蔗糖梯度上。嚴格配平，精確到小數點後三位。17°C，2，4000rpm離心16小時。結束離心，以400ul —管的體積從上到下收集，要把槍頭剪平。從每管中取出IOul用0.3%或者0.4%的膠電泳檢測。取目標管總DNA，加 1/10體積的氯化鈉，2. 5倍體積乙醇沉澱，洗滌，抽乾後溶於ddH20。電泳並定量。將大小合適的DNA片段脫磷，體系如下
權利要求
1.一種環肽YM-216391的生物合成基因簇，該基因簇核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示， 其中編碼環肽YM-216391生物合成所涉及的10個基因，包括環肽YM-216391的前體肽基因 ymB,雜環化酶基因ymC和ymE，NADH脫氫酶基因ymH，異構酶基因ymA，細胞色素P450氧化酶基因ymD，蛋白酶基因ymG，FAD依賴的氧化還原酶基因ymF，調節基因yml和ymj。
2.根據權利要求1所述的環肽YM-216391的生物合成基因簇，其特徵在於所述的該核糖體機制編碼的前體肽包含下述兩個部分信號肽部分和結構肽部分。
3.一種根據權利要求1所述的環肽YM-216391的生物合成基因簇的用途，其編碼蛋白用於催化合成環肽YM-216391及其類似物或者用於調節環肽YM-216391及其類似物的產量。
4.根據權利要求3所述的環肽YM-216391的生物合成基因簇的用途，其特徵是所述的基因簇的編碼蛋白催化合成環肽YM-216391的大環骨架。
5.根據權利要求3所述的環肽YM-216391的生物合成基因簇的用途，其特徵是所述的基因簇的編碼蛋白催化合成噻唑環。
6.根據權利要求3所述的環肽YM-216391的生物合成基因簇的用途，其特徵是所述的基因簇的編碼蛋白催化合成噁唑環。
7.根據權利要求3所述的環肽YM-216391的生物合成基因簇的用途，其特徵是所述的基因簇的編碼蛋白催化肽鏈骨架上異亮氨酸殘基的異構化。
8.根據權利要求3所述的環肽YM-216391的生物合成基因簇的用途，其特徵是所述的基因簇的編碼蛋白催化肽鏈骨架上苯丙氨酸殘基的β-羥化。
9.根據權利要求3所述的環肽YM-216391的生物合成基因簇的用途，其特徵是所述的基因簇通過在鏈黴菌中的異源表達可以產生環肽YM-216391。
全文摘要
本發明公開了一種由高貴鏈黴菌Streptomyces nobilis JCM 4274產生的具有良好抗腫瘤活性的環肽YM-216391的生物合成基因簇。整個基因簇共包含10個基因8個與環肽YM-216391大環骨架生物合成及後修飾相關的基因，2個調節基因。通過對上述生物合成基因簇的異源表達可產生環肽YM-216391。本發明所提供的基因及其蛋白可以用來尋找和發現用於醫藥、工業或農業的化合物、基因或蛋白。
文檔編號C12N15/52GK102174530SQ201010619958
公開日2011年9月7日 申請日期2010年12月28日 優先權日2010年12月28日
發明者唐功利, 潘海學, 蹇曉紅 申請人:中國科學院上海有機化學研究所