以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方法
2024-04-06 03:04:05
以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方法
【專利摘要】本發明公開了一種以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方法，所述方法包括如下步驟：步驟一，獲得樣品的元基因組序列；步驟二，根據群落結構信息確定優勢細菌的分類地位；步驟三，依據優勢細菌的相似菌的參考基因組序列，從元基因組序列中挑出相似序列；步驟四，對相似序列進行拼接，添加人工接頭序列，獲得細菌的基因組草圖。本發明通過從反應器汙泥微生物元基因組序列中拼接細菌基因組，能夠不經過分離細菌獲得培養物就可獲得細菌的基因組，從而可以實現對難以分離培養的細菌的基因組進行研究，進而獲得該細菌的代謝功能特性的方法。
【專利說明】以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於微生物【技術領域】，涉及一種以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接 細菌基因組的方法。
【背景技術】
[0002] 近年來對喹啉的降解進行了較多研究。反硝化條件下降解喹啉及其代謝途徑已 有報導。但反硝化降解喹啉過程中起關鍵作用的微生物及其發揮作用的機制卻缺乏深入 研究。前期研究發現，在一個運行狀態穩定的實驗室反硝化喹啉降解生物反應器中，變形 菌綱β亞綱的微生物成為主要的類群，其中陶厄氏屬（Thauera)和固氮弧菌屬（Azoacus) 的微生物具有明顯的優勢。我們試圖從該反應器中分離優勢的陶厄氏屬（Thauera)細菌， 但是該菌株難以分離培養，為此，我們借鑑近年來新興的元基因組學技術，對反應器的樣本 進行了元基因組測序，分析了該群落樣本的功能潛勢。為了進一步了解該反應器中優勢 的陶厄氏屬（Thauera)細菌的功能特性，我們從元基因組序列中拼接出了一個陶厄氏屬 (Thauera)細菌的基因組，並對其進行了功能的注釋，為了解該細菌的功能奠定了基礎。
【發明內容】
[0003] 針對現有技術中的缺陷，本發明的目的是提供一種以廢水處理樣品微生物元基因 組序列拼接細菌基因組的方法。
[0004] 本發明是通過以下技術方案實現的：
[0005] 本發明涉及一種以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方法，所 述方法包括如下步驟：
[0006] 步驟一，獲得樣品的元基因組序列；
[0007] 步驟二，根據群落結構信息確定優勢細菌的分類地位；
[0008] 步驟三，依據優勢細菌的相似菌的參考基因組序列，從元基因組序列中挑出相似 序列；
[0009] 步驟四，對相似序列進行拼接，獲得細菌的基因組。
[0010] 優選地，步驟一中，所述獲得樣品的元基因組序列具體為：利用高通量測序平臺獲 得樣品的元基因組序列，或者是利用454焦磷酸測序獲得樣品的元基因組序列。
[0011] 優選地，步驟一中，所述元基因組序列為反應器汙泥微生物元基因組序列。
[0012] 優選地，步驟一中，所述元基因組序列具體為平均長度大於400bp的微生物基因 組序列。
[0013] 優選地，步驟一中，所述獲得樣品的元基因組序列包括對測序得到的原始序列進 行質量控制的步驟。
[0014] 優選地，步驟四中，拼接時，添加不影響蛋白編碼序列的短連接序列。
[0015] 更優選地，所述短連接序列如SEQIDNO. 1所示。
[0016] 優選地，步驟四中，所述細菌為樣品中含有群落細菌中的優勢細菌。
[0017] 優選地，步驟四中，所述細菌的基因組為陶厄氏屬（Thauera)細菌基因組。
[0018] 與現有技術相比，本發明具有如下的有益效果：
[0019] 本發明通過從反應器汙泥微生物元基因組序列中拼接細菌基因組，能夠不經過分 離細菌獲得培養物就可獲得細菌的基因組，從而可以實現對難以分離培養的細菌的基因組 進行研究，進而獲得該細菌的代謝功能特性的方法，為分析群落中難以分離培養的細菌的 功能提供方法。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 通過閱讀參照以下附圖對非限制性實施例所作的詳細描述，本發明的其它特徵、 目的和優點將會變得更明顯：
[0021] 圖1為反應器兀基因組序列對已知陶厄氏囷（Thauera)基因組覆蓋度；
[0022] 其中圖中符號代表的細菌的拉丁文名稱分別為：sp.MZIT:Thauerasp.MZIT; AMXA：Thauerasp.28；AMXB：Thauerasp.27；AMXC：Thauerasp. 63；AMXD：Thauera aminoaromaticaS2 ;AMXE:Thaueralinaloolentis47Lol(DSM12138)
[0023] 圖2是從元基因組數據拼接的陶厄氏屬（Thauera)細菌基因組；圖中外圈I代表 編碼序列，內圈2代表基因組的GC含量。
[0024] 圖3為反應器陶厄氏屬（Thauera)基因組功能類別劃分；
[0025] 圖4為反應器中陶厄氏屬（Thauera)細菌喹啉代謝途徑預測。
【具體實施方式】
[0026] 下面結合具體實施例對本發明進行詳細說明。以下實施例將有助於本領域的技術 人員進一步理解本發明，但不以任何形式限制本發明。應當指出的是，對本領域的普通技術 人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進。這些都屬於本發明 的保護範圍。
[0027] 實施例1
[0028] 本實施例首先建立一個喹啉降解反硝化反應器，種子汙泥來自焦化廠廢水處理系 統二沉池，在喹啉為唯一碳源的反硝化條件下馴化。經過半年多時間的馴化，反應器達到高 效穩定的喹啉降解和硝態氮去除功能，喹啉去除率在80%左右，硝態氮去除率超過90%。
[0029] 分析穩定狀態的細菌群落結構，Rhodocyclaceae科的反硝化菌Thauera、 Denitratisoma是優勢微生物。其中，最優勢類群Thauera的豐度在50%左右。這些類群 可能就是在反硝化條件下降解喹啉的主要的功能菌。為了 了解優勢類群Thauera細菌的特 性，我們以元基因組學焦磷酸測序的方式獲得了反應器微生物群落的元基因組序列。進而 從元基因組數據中獲得優勢的Thauera細菌的基因組。
[0030] 對喹啉降解反應器某運行穩定的時間點進行取樣，並以Roche454GS-FLX平臺進 行測序。原始序列經過fastQC統計共計120萬條左右（大小800Mb左右），平均序列長度 在600bp左右。經過CD-HIT-EST程序的序列進行聚類和454r印licatefilter軟體去除重 復的序列後，序列條數共計96萬條左右佔原始序列的78 %。再經過PRINSEQ剪切掉低質量 末端後，序列條數共計90萬條左右佔原始的73%。對序列的質量控制環節後，每一條序列 末端的低質量序列基本刪除，序列的平均長度在600左右。
[0031] 從元基因組中將DNA序列劃分到不同菌株，將有重複區域的序列進行組裝和 拼接，從而得到不同菌株的基因組數據。通過之前反應器16s基因的結果，我們知道在 這個反應器中Thauera屬的菌株與已知的ThaueraaminoaromaticS2菌株，參見Liu B,FrostegardA,ShapleighJP..Draftgenomesequencesoffivestrainsinthegenus thauera.GenomeAnnounc20131 (I) ·pii:e00052_12·doi:10. 1128/genomeA. 00052-12。 十分接近。進一步選取了Thauera屬已經完成基因組測序的6株菌株作為基因組比 較的參照組。這 6 株分別是Thauerasp. 28,Thauerasp. 27,Thauerasp. 63,Thauera linaloolentis47Lol=DSM1213,Thauerasp.MZlT,ThaueraaminoaromaticS2,參見 JiangK,SanseverinoJ,ChauhanA,LucasS,CopelandA,LapidusA,DelRioTG,Dalin E,TiceH,BruceD,GoodwinL,PitluckS,SimsD,BrettinT,DetterJC,HanC,Chang YJ,LarimerF,LandM,HauserL,KyrpidesNC,MikhailovaN,MoserS,JegierP,Close D,DebruynJM,WangY,LaytonAC,AllenMS,SaylerGS.Completegenomesequence ofThaueraaminoaromaticastrainMZlT.StandGenomicSci2012, 6(3):325-35. doi: 10. 4056/sigs. 2696029(反應器中匹配的reads數最多的菌株，覆蓋率為82.I% ) (圖1)。因此我們根據這株ThaueraaminoaromaticS2基因組作為參考把質控後序列中 的與該菌株基因組相似的序列用MUMMER軟體提取出來。具體是將反應器序列與Thauera aminoaromaticS2 基因組進行比對，使用程序blastn(blastall_pblastn-ele-5-m 8)找出匹配序列（比對區域400bp左右，相似性90%)，將匹配上的序列作為用於拼接和組 裝的Thauera屬基因組序列。共提取出96000條reads,作為拼接組裝Thauera屬菌株基 因組的序列文件（52Mb)。通過Rhoche454gsAssemble軟體對這些序列文件進行拼接組裝 (contig長度閾值為IOOObp，其它參數默認），完成組裝和拼接後的Thauera屬細菌基因組， 大小為4371269bp與參照組的一致性為80%左右，GC含量64. 85%，共計2900條contig， N50為1586bp。經過計算機在contig中添加不影響蛋白編碼序列的人工短連接序列SEQ IDNO.I(NNNNNCATTCCATTCATTAATTAATTAATGAATGAATGNNNNN)，將contig連接構成連續的虛 擬基因組，最終完成Thauera屬細菌基因組的重建（4692877bp)(圖2)。
[0032] 實施例2
[0033] 在RAST平臺完成了拼接的Thauera基因組的人工注釋。該菌基因組中代謝途 徑的分類見圖3。Thauera屬的細菌利用反硝化途徑降解一些芳香族化合物經常被報導， 在多株Thauera屬菌株的基因組中反硝化途徑中的基因也多次被發現。在我們拼接注釋 的Thauera屬菌株基因組中也確定了完整的反硝化途徑基因簇。在經過RAST注釋後的 基因組中，位於contig00018上6977到7237bp的基因為反硝化途徑還原基因簇。位於 Contig00199的95到1303bp的基因為一氧化二氮還原酶（EC1. 7. 99. 6)。作為微生物降 解芳香族化合物為C02的常見中間產物，苯甲醯輔酶A在Thauera屬細菌中也是存在的，這 條代謝通路包括了由ATP驅動的苯環2電子還原反應,該反應利用ferredoxin作為電子 供體，由苯甲醯輔酶A還原酶催化。在注釋的Thauera基因組中，contig00366的2237到 1989bp確定為 4-hydroxybenzoyl-CoAthioesterase(EC3. 1. 2. 23)。
[0034] 表格1陶厄氏菌（Thauera)基因組芳香族化合物代謝途徑中的酶
[0035]
【權利要求】
1. 以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方法，其特徵在於，所述方 法包括如下步驟： 步驟一，獲得樣品的元基因組序列； 步驟二，根據群落結構信息確定優勢細菌的分類地位； 步驟三，依據優勢細菌的相似菌的參考基因組序列，從元基因組序列中挑出相似序 列； 步驟四，對相似序列進行拼接，獲得細菌的基因組。
2. 根據權利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法，其特徵在於，步驟一中，所述獲得樣品的元基因組序列具體為：利用高通量測序平臺獲 得樣品的元基因組序列，或者是利用454焦磷酸測序獲得樣品的元基因組序列。
3. 根據權利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法，其特徵在於，步驟一中，所述元基因組序列為反應器汙泥微生物元基因組序列。
4. 根據權利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法，其特徵在於，步驟一中，所述元基因組序列具體為平均長度大於400bp的微生物基因組 序列。
5. 根據權利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法，其特徵在於，步驟一中，所述獲得樣品的元基因組序列包括對測序得到的原始序列進行 質量控制的步驟。
6. 根據權利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法，其特徵在於，步驟四中，拼接時，添加不影響蛋白編碼序列的短連接序列。
7. 根據權利要求6所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法，其特徵在於，所述短連接序列如SEQ ID NO. 1所示。
8. 根據權利要求1所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法，其特徵在於，步驟四中，所述細菌為樣品中含有群落細菌中的優勢細菌。
9. 根據權利要求8所述的以廢水處理樣品微生物元基因組序列拼接細菌基因組的方 法，其特徵在於，所述細菌的基因組為陶厄氏屬（Thauera)細菌基因組。
【文檔編號】C12R1/01GK104278091SQ201410503190
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月26日 優先權日:2014年9月26日
【發明者】張曉君, 吳國軍, 王芸, 姚翔宇, 張夢暉 申請人:上海交通大學