一種增加促胰島素分泌肽融合蛋白生物活性的方法

2024-04-01 05:26:05

專利名稱：一種增加促胰島素分泌肽融合蛋白生物活性的方法
技術領域：
本發明提供一種增加促胰島素分泌肽融合蛋白生物活性的方法，涉及治療非胰島 素依賴性糖尿病及肥胖症的長效藥物的製備，在藥學領域有良好的應用前景，屬於生物醫 藥技術領域。
背景技術：
1、糖尿病隨著現代人類勞動強度顯著下降和飲食習慣的改變，糖尿病的發病率迅速上升， 根據WHO最新統計，全世界有糖尿病患者1. 25億，其中90%以上為II型糖尿病。糖尿病通 常分為I型糖尿病和II型糖尿病兩種。I型糖尿病，約佔糖尿病病人總數的10%，常發生 於兒童和青少年，病因是患者體內胰腺產生胰島素的細胞已經徹底損壞，從而完全失去了 產生胰島素的功能。患者需依靠外源胰島素存活，一旦中止胰島素治療則威脅生命。II型 糖尿病，約佔糖尿病病人總數的90%，發病年齡多數在35歲以後。II型糖尿病即非胰島素 依賴型糖尿病的確實發生機制，目前仍無定論，但推測可能受遺傳及飲食失節、缺乏運動、 形體肥胖、化學藥物等的影響，逐漸形成的一種內分泌失衡之疾病。主要根源於胰島之3 細胞受損，致胰島素分泌不足；或是胰島受體障礙而不能正常利用胰島素。隨著我國國民經 濟的快速發展，人民生活水平不斷提高，糖尿病發病率的上升及患者的低齡化現象越來越 明顯。上世紀70年代末，國內糖尿病的患病率還不足1%，而目前已達3%以上，2007年統 計，中國糖尿病患者已有4000萬人以上；據WHO最新數據預測，到2010年中國糖尿病人將 增加4倍，且糖尿病人群的發展正趨於低齡化。因此防治糖尿病已是一項迫不及待的緊急 任務。2、肥胖症肥胖，特別是上身肥胖，是世界上營養過剩的人群當中最常見的營養紊亂。大量研 究證實，減輕體重可大大降低慢性疾病的危險，所述慢性疾病如糖尿病、高血壓、高血脂症、 冠心病和肌骨骼病。減輕體重是許多慢性疾病治療的一個具體目標。目前幫助減輕體重的 方法均不能讓人完全滿意。某些肥胖症患者可通過刻意調整行為來減輕體重，如改變飲食 和增加運動；通過這些方法無法減輕體重的患者則可能是由於某些遺傳因素，它們引起食 欲增加，導致偏好高脂食物或脂肪生成代謝的傾向。因此，急需幫助減輕體重的新方法和組 合物(如藥物)來補充舊的方法。3、促胰島素分泌肽-1促胰島素分泌肽-1，也稱類胰高血糖素樣肽-KGlucogan Like Peptide 1，簡稱 GLP-1)是一個含37個胺基酸的短肽，GLP-1的成熟肽是由7-36個胺基酸組成，具有在血 糖濃度較高情況下促進胰島素分泌的功能。因此GLP-1在調節高血糖時不會產生低血糖 副作用。又因GLP-1可以抑制食慾，減緩胃液分泌和胃排空(Nauck, 1993 ；Gutniak et al, 1992)，所以也可將其作為控制體重的藥物。但GLP-1在人體內會迅速降解，在血清中的半 衰期只有1-2分鐘，因此無法發揮其生物學功能。研究表明，一些GLP-1的衍生物和類似物具有更好的生物活性和穩定性。例如，Amylin公司的Exenatide/Exendin-4，在人體內的半 衰期為2-3小時，每天注射2次可改善血漿葡萄糖水平，同時在24周後體重也得到明顯降 低。但是Exenatide/Exendin-4也需要每天注射兩次，仍然很不方便。N Nordisk公司的 NN2211(Liraglutide)是GLP-1並連16-碳脂肪酸鏈，這個NN2211在體內和血漿白蛋白結 合，致使血漿半衰期超過10小時，可以實現每天注射1次。4、長效促胰島素分泌肽融合蛋白質藥物 通過將促胰島素分泌肽與人血清白蛋白(HSA)或免疫球蛋白Fc的融合，可以產 生長效促胰島素分泌肽融合蛋白質藥物。人血清白蛋白在正常生理狀態下不易透過腎 小球，在血清中的半衰期達14-21天，利用基因工程技術，將人血清白蛋白與具有生物活 性的蛋白分子進行重組表達的融合蛋白，已經成為開發長效蛋白藥物的一個重要手段。 HGS公司的Albugon是GLP-I和人血清白蛋白的融合蛋白，它在猴子體內的半衰期可達3 天。又如Lilly公司採用基因工程方法將GLP-I與免疫球蛋白(IgG)的Fc融合；加拿大 ConjuChem公司開發研製的Exendin-4與人血清白蛋白(Recombumin )在體外結合產 生Exendin-4-HSA(CJC-1134-PC)。這些融合蛋白雖然能具備促進胰島素分泌肽的藥理特 性，並延長其在體內的半衰期，但這些融合蛋白的生物活性僅為非融合的單體Exendin-4 或GLP-I的1/10—1/40(等摩爾數相比)。本發明中採用基因重組技術，將Exendin-4和 GLP-I串聯組合後與人血清白蛋白或免疫球蛋白(IgG)的Fc進行融合，在保持Exendin-4 的藥理特性的基礎上延長其在體內的半衰期，同時具有比單個Exendin-4或GLP-I與 人血清白蛋白或免疫球蛋白(IgG)的Fc的融合蛋白(如Exendin-4-HSA，GLP-I-HSA, Exendin-4-Fc, GLP-I-Fc)具有更高的生物活性，在藥學領域包括II型糖尿病及肥胖症治 療將有良好的應用前景。

發明內容
本發明的目的在於開發一類具有高活性的促胰島素分泌肽融合蛋白，使之成為新 一代治療糖尿病和肥胖症的藥物。為實現上述目的，本發明提供了一種促胰島素分泌肽融 合蛋白及其製備方法，增加該融合蛋白的生物活性。本發明的技術方案一種促胰島素分泌肽融合蛋白，採用Exendin-4和GLP-I 串聯後與HSA或人免疫球蛋白Fc連接形成融合蛋白，以增加促胰島素分泌肽融合蛋白 的生物活性；該融合蛋白含有2個多肽區，其中第一多肽區序列由Exendin-4-GLP-l或 GLP-l-Exendin-4串聯序列組成，串聯方式為Exendin-4的C-末端與GLP-I的N-末端或 GLP-I的C-末端與Exendin-4的N-末端連接，上述串聯序列可以以同一方向依次重複η 次，重複數η為1-5;優先重複數為1。上述的(Exendin-4-GLP-l)串聯序列胺基酸具有SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列 或與該序列有90%以上同源性；所述的(GLP-l-Exendin-4)串聯序列胺基酸具有SEQ ID NO 2所示的胺基酸序列或與該序列有90%以上同源性。第二多肽區選自a)人血清白蛋白HSA，具有SEQ ID NO :3所示的胺基酸序列或與該序列有90%以 上同源性；或b)人免疫球蛋白Fe，具有SEQ ID NO 4所示的胺基酸序列或與該序列有90%以上同源性。第一多肽區通過其C-末端與第二多肽區的N-末端，或者第二多肽區的C-末端和 第一多肽區的N-末端連接；該融合蛋白表示為(Exendin-4-GLP-l)n-HSA,(GLP-l-Exendin-4)n-HSA, (Exendin-4-GLP-l)n-Fc, (GLP-l-Exendin-4) n_Fc，上述串聯序列中的n代表該串聯序列 以同一方向依次排列的重複數，重複數n為1-5，優先為1。例如，一項具體的與HSA連接的融合蛋白製備步驟可以概括描述如下製備步驟為(1)人血清白蛋白HSA基因克隆，獲得HSA基因； (2) Exendin-4-GLP-l 基因或 GLP-l-Exendin-4 基因合成；(3)Exendin-4-GLP-l 與 HSA 基因融合或 GLP-l-Exendin-4 與 HSA 基因融合；(4)構建 Exendin-4-GLP-l/HSA 的表達載體或 GLP-l-Exendin-4/HSA 的表達載 體；(5)含 Exendin-4-GLP-l/HSA 融合蛋白或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白表達工 程菌的構建；(6) Exendin-4-GLP-l/HSA 或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白的表達和純化；(7) Exendin-4-GLP-l/HSA 或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白的活性測定。上述步驟(1)至(7)僅描述了一種具體的該融合蛋白的製備方法，不能理解為限 制本發明的範圍。有一點對於本領域技術人員來說是明顯的，即在不脫離本發明的精神和 範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。上述Exendin-4-GLP-l串聯序列胺基酸具有SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列或與 該序列有90%以上同源性。上述GLP-l-Exendin-4串聯序列胺基酸具有SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列或與 該序列有90%以上同源性。所述的融合蛋白的核苷酸序列為融合蛋白的胺基酸序列對應的核苷酸序列或其 互補核苷酸序列。本發明還提供了一種載體，它含有上面所述核苷酸序列，一個具體的表達載體為 Exendin-4-GLP-1 /HSA-pPIC9K 表達載體或 GLP-l-Exendin_4/HSA-pPIC9K 表達載體。本發明還提供了一種宿主細胞，它包含上述載體。在本發明中的術語及相關方法術語「蛋白質」、「肽」或「多肽」可互換使用。它們指通過肽鍵或醯胺鍵連接在一 起的兩個或多個胺基酸的鏈，無論是否經過翻譯後修飾(例如，糖基化或磷酸化)。術語「第一多肽區的C-末端或與第二多肽區的N-末端連接」是指這兩種多肽/蛋 白質分子間的連接無任何連接多肽，這避免了因不必要的連接肽可能導致的免疫原性。連 接方式可以是以第一多肽區的C-末端直接連接在第二多肽區的N-末端上，也可以是第一 多肽區的N-末端直接連接在第二多肽區的C-末端上。優選連接方式是第一多肽區的C-末 端直接連接在第二多肽區的N-末端。術語「單個Exendin-4或GLP-1 」。是相對於「串聯序列」而言，其指單個Exendin-4 或GLP-1多肽。術語「串聯序列」指每個Exendin-4單體C-末端與GLP-1單體的N-末端直接連接，或者是每一個GLP-I單體的C-末端與Exendin-4單體的N-末端直接連接，串聯 序列可以以同一方向依次重複，重複數為1-5，優先重複數為1。在本發明的一個較佳實施例中，本發明的所述融合蛋白具有選自胺基酸序列SEQ ID NO 5所示的胺基酸序列；
本發明另一方面提供了核酸序列，它具有編碼上述融合蛋白的核酸序列或其互補 序列。另外，本發明的核酸序列的範圍內還涵蓋了與相同或基本上相同的核酸序列，如有至 少90 %、甚至95 %以上的同源性或相同性的核酸序列。本發明的核酸序列通常可以用PCR擴增法、重組法或人工合成的方法獲得。並用 商品化的cDNA庫或按本領域技術人員已知的常規方法所製備的cDNA作為模板，擴增而得 到有關序列，然後再將各次擴增出的片段按正確次序拼接在一起，將其克隆入載體，再轉入 細胞，然後通過常規方法從增殖後的宿主細胞中分離得到有關序列。本發明的融合蛋白用重組方法來製備。具體地說，將編碼Exendin-4-GLP-l串 聯序列與HSA多肽的核酸序列直接連接，形成Exendin-4-GLP-l-HSA重組融合基因，將編 碼GLP-l-Exendin-4串聯序列與HSA多肽的核酸序列直接連接，構成(GLP-1-Exendin_4) n-HSA重組融合基因；採用類似方法，將編碼Exendin-4-GLP-l串聯序列與人免疫球 蛋白Fc多肽的核酸序列直接連接，構成(Exendin-4-GLP-l)n-FC重組融合基因，或將 編碼GLP-l-Exendin-4串聯序列與人免疫球蛋白Fc多肽的核酸序列直接連接，構成 (GLP-l-Exendin-4)n-Fc重組融合基因。上述串聯序列中的η代表該串聯序列以同一方向 依次排列的重複數，重複數η為1-5，優先重複數為1。然後，上述重組核酸序列被克隆到表達載體質粒中，選用的表達質粒載 體包括適合在不同細胞宿主中表達融合蛋白的各種質粒，例如採用表達載體質粒 pPIC9K (Invitrogen)，可以在市場上獲得。然後，將上述表達質粒轉化到重組工程細胞宿主內，從而構建表達本發明融合蛋 白的重組工程細胞宿主。這些重組工程細胞可以是來源於動物，植物，昆蟲，真菌，酵母，細 菌等。質粒PPIC9K適合在酵母工程菌中表達融合蛋白，因此優選的重組工程細胞宿主為酵 母工程菌，例如採用畢赤酵母工程菌ΚΜ71。本文所用的術語「轉化」是指用本領域技術人員熟知的方法將含有感興趣核酸的 表達載體直接導入宿主細胞內。轉化方法因宿主細胞類型而異，通常包括電轉化；採用氯 化鈣、DEAE-葡聚糖或其它物質的轉染；微粒轟擊；脂轉染；感染和其它方法(見Sambrook 等人的《分子克隆實驗指南》第2版，1989年)。較佳的方法是電轉化方法。隨後，在適合本發明融合蛋白表達的條件下，培養轉化所得的宿主細胞。本領域技 術人員根據常規試驗就能選擇和確定培養基、培養溫度、時間等條件。採用本領域常規檢測 手段，如SDS-PAGE，Western印跡等，可以檢測出本發明融合蛋白的表達。最後，可用常規的 蛋白分離純化技術，進行融合蛋白的純化，其包括離心，沉澱，過濾，層析等手段。具體地，層 析方法又包括親和法，凝膠過濾，離子交換，疏水層析，以及反向層析等。本發明提供的本發 明的融合蛋白的分離純化方法也包括上述各種方法的適當組合。本發明也提供了一種鑑定促胰島素分泌肽融合蛋白的生物活性的方法。具體而 言，採用子HEK-293/GLP-1R細胞，GLP-I及激動劑可誘導該細胞系產生cAMP，cAMP產生量與 活性呈正相關。該方法是測定融合蛋白激活GLP-I受體的能力，並與Exendin-4激活GLP-I受體的能力進行比較，從而計算出融合蛋白生物活性。本發明的有益效果本發明提供了一種產生本發明所述融合蛋白的方法，該方法 包括提供一種宿主細胞，該宿主細胞包含表達載體，在適合蛋白表達的條件下由宿主細胞 產生並經分離獲得融合蛋白，該融合蛋白不僅具備促胰島素分泌肽的藥理特性、延長其在 體內的半衰期，同時具有比 Exendin-4-HSA，GLP-1-HSA，Exendin-4-Fc，GLP-1-Fc 融合蛋白 具有更高的生物活性，在藥學領域包括II型糖尿病及肥胖症治療將有良好的應用前景。


圖lExendin-4-GLP-l-HSA融合蛋白表達質粒構建策略圖。圖2Exendin-4-GLP-l_HSA融合蛋白表達的SDS-PAGE電泳結果。1、蛋白質分子量 標誌物，2、3、4為Exendin-4-GLP-l-HSA融合蛋白表達上清液。圖3Exendin-4-GLP-l_HSA融合蛋白表達的Western印跡結果。1、蛋白質 分子量標誌物，2、與抗Exendin-4抗體的Western-blotting，3、與抗GLP-1抗體的 Western-blotting, 4、與抗 HSA 抗體的 Western-blotting。圖 4HEK-293/GLP-1R 細胞經 Exendin-4-GLP-l-HSA、Exendin-4-HSA、Exendin-4, HSA刺激後生物活性測定。表明Exendin-4-GLP-l-HSA融合蛋白具有激活人GLP-1受體的 生物活性，顯示其生物活性高於Exendin-4-HSA。圖5小鼠糖耐量試驗。顯示Exendin-4-GLP-l-HSA生物活性高於Exendin-4-HSA。
具體實施例方式下面以Exendin-4-GLP-l/HSA為例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用 於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。除非另有描述，本發明的實施將採用分子生物 學、微生物學、重組DNA和免疫學的常規技術，這些均是本領域技術人員所知的。這些技術 在下列文獻或其它已經公開發表的文獻中有完整的描述例如，Sambrook《分子克隆實驗指 南》第2版(1989)；《蛋白質純化原理和實踐》第2版(Springer-Verlag,N. Y.)，以及《實 驗免疫學手冊》I-IV卷(D. C. Weir和C. C. Blackwell編輯1986)。或者，可按照試劑生產商 所提供的說明書進行。實施例1 人血清白蛋白HSA基因克隆，獲得HSA基因人血清白蛋白HSA基因可以通過RT-PCR獲得。通過以人胚胎cDNA為模板，用PCR 方法擴增HSA基因。根據HSA基因序列SEQ ID NO 5設計PCR擴增引物HSA引物1和HSA 引物2。其序列如下HSA 引物 1 :5』 -GATGCACACAAGAGTGAGGTTGCT-3』HSA 引物 2 5，-GCGGCCGCTTATAAGCCTAAGGCAGCTT-3，。劃線部分為NotI酶切點。PCR 反應體系為人胚胎 cDNA :liiL ;HSA 引物 1 :50 y M、1 y L ;HSA 引物 2 :50 y M、 1 u L ；lOXpfu 聚合酶緩衝液 5ii L ；MgCl2 :25mM、5ii L ；dNTP :2mM、4ii L ；pfu 聚合酶 1 u L ； ddH20 補足到總的反應體系為50 ii L。PCR 反應條件為94°C、2min ；然後，94°C、30sec ；55°C、30sec ；72°C、90sec，共進行 30個循環。用的瓊脂糖膠對PCR產物進行凝膠電泳，在紫外燈下切下1800bp左右的目的DNA條帶，再用PR0MEGA公司的PCR產物膠回收試劑盒回收HSA基因片段。採用紫外分 光光度法測定回收產物的濃度後，-20°C保存。實施例2 :Exendin-4-GLP-l 基因合成按照SEQ ID NO 6的要求，由上海英俊生物技術有限公司合成Exendin-4-GLP-l 的基因序列，並使其3'端帶上一段HSA基因的5'端序列。實施例3 :Exendin-4-GLP-l 與 HSA 基因融合本實施例以Exendin-4-GLP-l基因和HSA基因融合形成Exendin-4-GLP-l/HSA融 合基因為例，說明融合基因的克隆方法。本方法也適合HSA基因與其它基因形成融合基因 的克隆。根據SEQ ID NO :6，設計合成一條引物EXT 1 5' -TTTACGTACACGGTGA AGGTACTTTCACT-3『劃線部分為SnaBl酶切點。融合蛋白基因的製備使用Overlap PCR的反應方法獲得。具體如下。Overlap PCR的反應體系為Exendin-4_GLP-lDNA :2u L ；HSA DNA :2u L ；lOXpfu 聚合酶緩衝液5u L ； 25mM的MgCl25 y L ;2mM的dNTP 4u L ；pfu聚合酶1 u L ； ddH20補足到 總的反應體系為50iiL。PCR 條件為開始，94°C、2min ；然後，94°C、30sec ；55°C、30sec ；72°C、2min ；—共 5個循環。然後，加入50iiM引物EXT1 :2u L^P 50uM HSA引物2:2yL。進入下個程序 94°C、30sec ；55°C、30sec ；72°C、2min ；—共 30 個循環。然後用常用的分子生物學方法，分離獲得融合基因克隆。採用的瓊脂糖凝膠 對PCR產物進行電泳，從電泳膠上切下分子量在1900bp左右的DNA條帶，再用PR0MEGA公 司的PCR產物膠回收試劑盒回收Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因片段。實施例4 :Exendin-4-GLP-l/HSA 融合蛋白表達載體 Exendin-4-GLP_l/ HSA-pPIC9K 的構建以下以Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因為例，說明表達載體的構建。本實驗採用pPIC9K為表達質粒，其構建方法為常用分子生物學方法。即，通過培 養含有表達載體的菌種，提取獲得該質粒。製備好的質粒-20°C保存待用。為了將Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因連接到pPIC9K表達質粒中，先用SnaBl和 Notl限制性內切酶對表達質粒PPIC9K和Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因進行雙酶切。具 體條件如下。37°C恆溫水浴鍋內反應3小時，酶切體系如下Exendin-4-GLP-l/HSA 融合基因的酶切體系Exendin-4_GLP-l/HSA DNA :10u L ； SnaBl 1 u L ；Notl 1 u L ； NEBuffer2 :5u L ； ddH20 補足到總反應體積 50 u L。pPIC9K 的酶切體系表達質粒 pPIC9K DNA :10u L ； SnaBl :luL ；Notl, 1 u L ； NEBuffer2 :5u L ； ddH20 補足到總反應體積 50 ii L。然後用常用的分子生物學方法，分離獲得經雙酶切的Exendin-4-GLP-l/HSA融 合基因以及經雙酶切的PPIC9K質粒DNA。具體是用的瓊脂糖凝膠對酶切產物進 行電泳，切下目的條帶，再用PR0MEGA公司的PCR產物膠回收試劑盒回收經雙酶切的 Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因片段，以及pPIC9K質粒DNA片段。
然後，對酶切產物進行連接，獲得Exendin-4-GLP-l/HSA融合基因表達載體 Exendin-4-GLP-1 /HSA-pPIC9K 具體如下總的連接體系為10 μ L，包括T4DNA連接酶緩 衝液1 μ L,雙酶切的Exendin-4-GLP-l/HSA基因DNA 2 μ L,雙酶切表達質粒pPIC9K DNA 2 μ L，T4DNA連接酶1 μ L，無菌水補足至10 μ L0 16°C恆溫水浴保溫過夜。連接產物轉化感受態DH5 α細胞。取一管感受態DH5 α細胞加入連接產物，輕柔混 勻後冰上放置30min，再在42°C水浴放置2min。加入500 μ L LB液體培養基在37°C 180r/ min搖4 0min。取100 μ L轉化液塗於卡那抗性的LB固體培養基，37°C倒置培養12-16小時。陽性克隆的鑑定是通過挑取單個轉化子菌落，抽提質粒，進行酶切分析和測序結 果來確定。實施例5 含Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白表達工程菌的構建本實施例利用電轉化方法和融合表達載體(Exendin-4-GLP-l/HSA-pPIC9K)為 例，構建表達Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白的工程菌。具體方法如下。首先挑選含有EXendin-4-GLP-l/HSA-pPIC9K表達載體的細菌進行克隆，提取表 達載體DNA，提取方法為常用的分子生物學方法。然後，用電轉化的方法把質粒轉入畢赤酵 母KM27。電轉化方法具體如下先進行菌體的準備。挑取畢赤酵母KM27單菌落，接種至含 有5mLYPD培養基的50mL三角瓶中，30°C、250-300r/min培養過夜。然後取100-500 μ L的 培養物接種至含有500mL新鮮YPD培養基的2L三角搖瓶中，28 30°C、250-300r/min培養 過夜，至OD6tltl達到11.5。再將細胞培養物於4°C，1500g離心5min，用500mL的冰預冷的無 菌水將菌體沉澱重懸。離心後，再用250mL的冰預冷的無菌水將菌體沉澱重懸。再離心，用 20mL的冰預冷的Imol的山梨醇溶液將菌體沉澱重懸。再離心，用ImL的冰預冷的Imol的 山梨醇溶液將菌體沉澱重懸，其終體積約為1. 5mL。然後用電擊方法進行轉化。具體如下將5 20 μ g表達質粒Exendin-4-GLP-l/ HSA-pPIC9K的DNA溶解於5 10μ L Tris緩衝液中，與80 μ L的上述步驟所得的菌體混勻， 轉至0.2cm冰預冷的電轉化杯中。將電轉化杯冰浴5min。然後根據相應的電轉化儀，採用 優化的電壓、電流、電容等參數，進行電擊。電擊完畢後，加入ImL冰預冷的山梨醇溶液將菌 體混勻，轉至1. 5mL的Eppendorf管中，將菌體懸液塗布於山梨醇平板上，每200 600 μ L 塗布一塊平板。將平板置於30°C培養，直至單個菌落出現。實施例6 :Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白的表達和純化實施例5中構建的Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白表達工程菌，可以用以下的方 法表達融合蛋白將Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白表達酵母菌種接種於500mL的BMGY培 養基(蛋白腖2%，酵母提取物1%，甘油1%，YNB 1.34%,D-biotin 4X10_5%，用0. IM的 磷酸鉀緩衝液調PH至6)中，搖床30°C、180r/min,培養48小時。然後，5升YP (蛋白腖2%， 酵母提取物1%)的發酵罐中，高壓滅菌30min，冷卻後加入除菌後的YNB 1. 34%,D-biotin 4X10_5%和甲醇配成BMMY培養基。將預培養的菌液接種至BMMY中，發酵過程控溫在 300C，溶氧始終大於20%的飽和度，pH控制在5. 5-6左右，每24h補加1 %甲醇，連續發酵5 天。利用常用的重組蛋白分離方法，獲得以上酵母所表達的融合蛋白初提物。具體地，可以 利用離心，超濾濃縮等方法。然後，可以利用層析方法，進一步純化融合蛋白。具體地，可以 採用S印harose SP XL層析柱用於融合蛋白的捕獲，再利用Butyl Sepharose FF層析柱， 以及DEAE Sepharose FF層析柱，進行更高的純化。
融合蛋白表達和純化結果通過常用的蛋白分析方法進行鑑定，包括但不限制 於SDS-PAGE，Western印跡等方法。圖2為Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白表達產物的 SDS-PAGE電泳，結果顯示71KDa左右的蛋白質條帶，Western印跡方法證明該蛋白質條帶具 有Exendin-4，GLP-1，HSA抗原性，證明表達的蛋白質為Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白，如 圖3所示。實施例7 :Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白的活性本實施例中採用HEK-293/GLP-1R細胞體外測定方法對HSA/GLP-1融合蛋白進行 活性測定，GLP-1及激動劑可誘導該細胞系產生cAMP，cAMP產生量與活性呈正相關。具體 是測定Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白激活GLP-1受體的能力，並與Exendin-4-HSA激活 GLP-1受體的能力進行比較。具體方法如下按20，000至40，000細胞/孔(96孔黑亮底 平板)的量，接種HEK-293/GLP-1R細胞，培養1天後換用無血漿培養15-20小時後分別加 人不同濃度的Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白，Exendin-4或HSA，培育2h後測定每孔細胞 的 cAMP 含量(AB 公司 cAMP-Screen system, ELISA Kit)，結果表明 Exendin-4-GLP-l/HSA 融合蛋白比Exendin-4-HSA融合蛋白具有更高的生物活性，結果見圖4。 實施例8 小鼠耐糖試驗C57BL/6J小鼠禁食過夜(15小時)後按每公斤小鼠體重腹腔內分別注射 Exendin-4-GLP-l/HSA 融合蛋白 0. 2mg，或 Exendin-4-HSA 融合蛋白 0. 2mg。lh 後再在小鼠 腹腔內按每公斤小鼠體重注射葡萄糖2mg/kg小鼠體重，在不同的時間段取血樣測定其葡 萄糖含量，結果顯示Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白比Exendin-4-HSA融合蛋白具有更明 顯降低小鼠血糖的效果，如圖5所示。儘管本發明描述了具體的例子，但是有一點對於本領域技術人員來說是明顯的， 即在不脫離本發明的精神和範圍的前提下可對本發明作各種變化和改動。因此，所附權利 要求覆蓋了所有這些在本發明範圍內的變動。本文引用的所有出版物、專利和專利申請均 納入本文作參考。
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權利要求
一種促胰島素分泌肽融合蛋白，其特徵在於採用Exendin-4和GLP-1串聯後與人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc連接形成融合蛋白，以增加促胰島素分泌肽融合蛋白的生物活性；該融合蛋白含有2個多肽區，其中第一多肽區序列由Exendin-4-GLP-1或GLP-1-Exendin-4串聯序列組成，串聯方式為Exendin-4的C-末端與GLP-1的N-末端或GLP-1的C-末端與Exendin-4的N-末端連接，上述串聯序列以同一方向依次重複n次，重複數n為1-5；第二多肽區選自人血清白蛋白HSA，或人免疫球蛋白Fc；第一多肽區通過其C-末端與第二多肽區的N-末端，或者第二多肽區的C-末端和第一多肽區的N-末端連接；該融合蛋白表示為(Exendin-4-GLP-1)n-HSA，(GLP-1-Exendin-4)n-HSA，(Exendin-4-GLP-1)n-Fc，(GLP-1-Exendin-4)n-Fc，n為1-5。
2.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於Exendin-4-GLP-l串聯序列胺基酸具 有SEQ ID NO :1所示的胺基酸序列或與該序列有90%以上同源性。
3.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於GLP-l-Exendin-4串聯序列胺基酸具 有SEQ ID NO :2所示的胺基酸序列或與該序列有90%以上同源性。
4.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於第二多肽區選自a)人血清白蛋白HSA，具有SEQ ID NO :3所示的胺基酸序列或與該序列有90%以上同 源性；或b)人免疫球蛋白Fe，具有SEQ ID NO :4所示的胺基酸序列或與該序列有90%以上 同源性。
5.根據權利要求1所述的融合蛋白，其特徵在於所述的融合蛋白的核苷酸序列為融合 蛋白的胺基酸序列對應的核苷酸序列或其互補核苷酸序列。
6.一種權利要求1所述的促胰島素分泌肽融合蛋白的製備方法，其特徵在於製備步驟為(1)人血清白蛋白HSA基因克隆，獲得HSA基因；(2)Exendin-4-GLP-l基因或 GLP-l-Exendin-4 基因合成；(3)Exendin-4-GLP-l與 HSA 基因融合或 GLP-l-Exendin-4 與 HSA 基因融合；(4)構建Exendin-4-GLP-l/HSA 的表達載體或 GLP-l-Exendin-4/HSA 的表達載體；(5)含Exendin-4-GLP-l/HSA融合蛋白或GLP-l-Exendin-4/HSA融合蛋白表達工程菌 的構建；(6)Exendin-4-GLP-l/HSA 或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白的表達和純化；(7)Exendin-4-GLP-l/HSA 或 GLP-l-Exendin-4/HSA 融合蛋白的活性測定。
全文摘要
一種增加促胰島素分泌肽融合蛋白生物活性的方法，屬於生物醫藥技術領域。本發明採用Exendin-4和GLP-1串聯後與人血清白蛋白HSA或人免疫球蛋白Fc連接形成融合蛋白，以增加促胰島素分泌肽融合蛋白的生物活性；該融合蛋白表示為(Exendin-4-GLP-1)n-HSA，(GLP-1-Exendin-4)n-HSA，(Exendin-4-GLP-1)n-Fc，(GLP-1-Exendin-4)n-Fc，n為1-5。本發明製備的融合蛋白比Exendin-4-HSA或GLP-1-HSA融合蛋白具有更高的生物活性。本發明的融合蛋白可用於製備非胰島素依賴性糖尿病及各種症狀和肥胖症的治療藥物。
文檔編號C12N1/19GK101875700SQ20101014243
公開日2010年11月3日 申請日期2010年4月9日 優先權日2010年4月9日
發明者餘傳信, 楊建良, 王斯靖, 高琪 申請人:無錫和邦生物科技有限公司;江蘇省血吸蟲病防治研究所