一種生物脫氮劑及其應用的製作方法

2024-04-01 05:21:05 1

專利名稱：一種生物脫氮劑及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，具體涉及一種具有脫氮生物學活性的細菌、培養該細菌 的方法，以該菌為主要組成成分的生物脫氮劑的製備，及其在降解水體氮素中的應用。
背景技術：
氮素循環是自然界中最為重要的生態系統物質循環的組成之一。然而，氮肥的使 用及高密度水產養殖的發展，在帶來巨大經濟效益的同時也造成了嚴重的環境問題。在水 產養殖中，因氮磷元素含量過高而造成的富營養化情況頻繁出現，除使水質惡化及破壞其 中的生物平衡外，其中的氨氮和亞硝態氮對養殖動物具有較強毒性，特別是氨氮(MV-N)， 它能直接或間接影響著魚類的生長和繁殖乃至死亡。一方面它能被植物直接吸收利用， 構成它們生命的蛋白質，增加浮遊生物量，為魚類提供更豐富的營養餌料。另一方面它對 魚類及其他水生動物有毒性，它能破壞鰓組織，並滲進血液中，降低血液載氧能力，使呼吸 機能下降。水中氨氮的來源，除了人工施肥外，主要是蛋白質分解的最終產物，由其造成 的水產養殖動物病害甚至死亡現象已多見報導[ANTONIO T，CARLOS M，MANUEL P M，et al.Environmental impactsof intensive aquaculture in marine water[J]. Wat Res, 2000,34(1) =334-342] 0如在對蝦養殖中，蝦池中氨氮含量超過0. 10mg/L時，對蝦就會中 毒，且不易搶救。傳統上。為減少氨氮汙染帶來的危害，人們開始研究採用生物處理法，如活 性汙泥法、生物膜法和穩定塘法，但這些傳統方法存在或伴有汙泥產生、反應啟動慢、出水 水質不穩定等問題，後又採用固定化光合細菌來進行脫氮處理。人們曾利用硝化菌群除氮， 但是硝化作用的終產物是硝酸鹽，會破壞生物圈氮素的平衡且該產物能誘發人類的高鐵血 紅蛋白症。經典脫氮工藝主要由氨化、硝化反應器和反硝化反應器組成，但由於在魚蝦養殖 過程中必須充氧來保證水中的溶解氧量，那麼厭氧反硝化細菌的脫氮作用也不能得到充分 發揮，效果不理想。與傳統的生物脫氮工藝相比，脫氨枯草芽孢桿菌菌株的出現可以使生物脫氮在同 一反應器中完成，實現真正意義上對氨氮的降解。目前，關於利用枯草芽孢桿菌實現的生物 脫氮已經有成功應用的報導。Gupta 等[Gupta AB, Gupta SK. Simultaneous Carbon and NitrogenRemoval in a Mixed Culture Aerobic RBC Biofilm[J]. Wat Res,1999,33(2) 555-561. ]Thiosphaera pantotropha (ijJlM^ % Paracoccus denitrif icans)的 t 物轉盤處理不同濃度的生活汙水。利用枯草芽孢桿菌發展脫氨氮技術具有以下優點第一、 對氨氮的降解不需要經過硝化反硝化過程，可以大大降低對水體的二次汙染；第二、枯草芽 孢桿菌菌種單一，對動植物無害，生產成本低廉，產品質量穩定；第三、枯草芽孢桿菌對環境 中亞硝態氮也有一定的降解能力；第四、枯草芽孢桿菌為好氧菌，方便在養殖水體中應用。枯草芽孢桿菌除了對氨氮有較好的脫除能力外，還能產生大量的胞外酶類，從而 大量消耗池塘中的殘餌和動物排洩物等大分子有機質。大分子有機質被分解為小分子有機 酸、胺基酸等物質，能為水體中光合細菌、藻類以及其它浮遊生物提供營養，客觀上促進了 微生態環境的穩定；枯草芽孢桿菌還可使水生動物的腸道pH降低，產生較強活性的蛋白酶和澱粉酶，促進水生動物的消化；此外，枯草芽孢桿菌定植在目標動物腸道中，經生物奪氧 作用，能抑制病原菌的滋生以及提高動物的免疫力，最終預防疾病的發生，達到促進目標動 物生長和提高飼料轉化率、防病和促進生長起重要作用。環境汙染是當今人類面臨最大的危害之一，特別是工業生產的發展，排出大量的 汙水，這些汙水如直接排放或處理不當，將影響水體的自淨，因而使水質惡化。人們日益意 識到環境汙染帶來的危害，現在汙水必須通過處理才能排放已經成為人們的共識。在汙水 中，N是主要的汙染物之一，在汙水中氮源主要以有機氮化合物的形式存在，包括蛋白質以 及胺基酸等，在枯草芽孢桿菌的作用下，一部分有機含氮物在菌體自身生長繁殖中被利用， 另一部分在胞外酶的作用下脫氨基產生氨，以NH4+的形式被菌體吸收利用。此外，在汙水中 同樣含有大量的C源，包括造紙、制麻廢水中含有的果膠質，在好氧條件下，枯草芽孢桿菌 可以分解果膠質，產生二氧化碳和水；澱粉廠、酒廠、印染廢水和生活汙水的含有的澱粉，好 氧條件下，枯草芽孢桿菌首先將澱粉轉化為葡萄糖，提供菌體生命活動所需要的能量，另一 部分用於細胞合成。枯草芽孢桿菌除了可以對汙水有明顯的淨化作用外，菌體的大量繁殖 對於環境中存在的致病微生物也存在著明顯的拮抗作用。若與好氧反硝化細菌聯合應用， 可將環境以及汙水中存在的氮素高效脫除。枯草芽孢桿菌脫氮技術的關鍵在於，在一定的條件下(如溫度，pH，C/N比)，該菌 本身具有高效的氨氮的脫除能力，同時具有較好的外界環境耐受性，如對鹽度，重金屬離子 的耐受性等。因此，篩選同時具有這兩方面能力的枯草芽孢桿菌對於這項技術的應用具有 很重要的意義。目前已報導的枯草芽孢桿菌大多存在氨氮的脫除能力不強，缺乏對高濃度 的銨鹽的耐受性，處理時間過長，效率不高等問題。賈燕等[賈燕，江棟，周偉堅，等.2009. 高效脫硫脫氨氮菌株的分離、鑑定及特性研究[J].中國給水排水，25(23) 114-116]報導 了一株枯草芽孢桿菌能在12_32h，將初始濃度88!^/1的氨氮降解96.6%以上，其中，當氨 氮初始濃度> 66mg/L時，對氨氮的去除能力陡降。可見，對初始銨鹽的耐受性也是限制其 應用的重要因素之一。

發明內容
本發明的一個目的是提供一種新的具有脫氮生物學活性的細菌，該細菌具有脫除 水體氮素的能力。本發明的另一個目的是提供一種組合培養條件，使該細菌能體現更強的氮素脫除 能力。本發明的再一個目的是提供了一種發酵罐培養條件，使該細菌實現大規模高密度 的培養。本發明的再一個目的是提供一種生物脫氮劑的劑型組成方式，使其在處理水體氮 素汙染時更具實用性和可操作性。本發明的再一個目的是提供新的細菌在水體生物脫氮中的應用。單獨使用該生物 脫氮劑即可有效脫除水體中的氮素。本發明公開了一株具有脫氮生物活性的細菌，該細菌具有較高的氨氮脫除能力。 在生物脫氮中能有效地將NH4+-N直接轉化成菌體的自身組成物質。更具體地，該細菌是 本實驗室篩選出的具有高氨氮脫除能力的一株枯草芽孢桿菌枯，命名為枯草芽孢桿菌CPUBS-1，英文名為 Bacillus subtilis CPU BS-1，簡稱 CPU BS-1。保藏號為 CGMCC No. 3668， 保藏時間2010年3月17日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。 平皿菌落圖見附圖1。本發明的菌株CPU BS-1的篩選方法包括以下步驟a.出發菌株復甦以枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis, CGMCC NO. 0050)作為出發菌株，將其菌種 接種至種子培養基斜面，培養48h。b.菌懸液的製備從斜面取一環菌體接種至種子培養基，培養16_17h後，以10%接種量轉接至新鮮 種子培養基培養6h，使菌體達到同步生長。取菌液lmL，5000rpm離心8min，棄上清，菌體沉 澱以無菌生理鹽水洗滌2次後，轉入帶有玻璃珠的搖瓶中用手搖動打散，並用無菌的定性 濾紙過濾，得到單細胞菌懸液，稀釋至108CFU/ml，即為待處理菌懸液。c.誘變處理以CGMCC NO. 0050為出發菌株進行NTG誘變，用少許丙酮溶解NTG，然後用pH 7.0的磷酸緩衝液配製NTG母液，使母液的濃度為 lmg/mL。將菌懸液和NTG母液進行混合，使混合液中NTG終濃度為0. 5mg/mL。接著將混合 液放在搖床上37°C，lOOrpm避光處理15min、30min、45min。處理完後立即稀釋1000倍停止 誘變，塗布平板。每個處理塗三個平板，然後置37°C培養。 將上述處理後的菌株接種到新鮮種子培養基中，37°C，200rpm避光培養4h後塗布 篩選平板。此後培養可以消除生理延遲現象(即稀釋了細胞內原有酶量)，可以使誘變中獲 得的突變性狀得以表現出來，從而獲得純的變異細胞。d.高效氨氮降解菌的篩選在種子培養基的平板中塗布經誘變處理過的菌液，於37°C恆溫箱中培養24h，挑 取長出的單菌落，將菌株接種於種子培養液中200rpm 37°C振蕩培養18h，取此種子液2mL 接種於25mL/250mL發酵培養基中200rpm 37°C振蕩培養72h，吸取10ml活化菌液，轉入離 心管中，3000r/min離心lOmin，去除上清液；再用10ml生理鹽水洗滌沉澱，混勻，再次離心； 如此重複3次，以除去菌種活化過程中產生的氨氮。最後用10ml生理鹽水洗下沉澱，接入 裝有100ml篩選培養基的三角瓶中，37°C搖床培養24h。用靛酚藍分光光度法測定培養液中 氨氮含量，同時測定未接菌的培養基中的初始氨氮含量，計算各個氨氮降解菌的降解率。最 終得到氨氮降解率最高的CPU BS-1。上述篩選方法中，其中種子培養基優選麥芽糖20g，蛋白腖10g，牛肉膏10g，NaCl 5g，酵母膏3g，蒸餾水定容至lL，pH7. 2。上述d步驟中發酵培養基優選葡萄糖160g，玉米漿40g，黃豆餅粉5g，尿素20g， 碳酸鈣5g，蒸餾水定容至1L，pH7. 2。上述d步驟中篩選培養基優選葡萄糖5. 0g，(NH4)2S04 0. 5g，NaCl 1. 0g，K2HP04 0. 5g，MgS04 7H20 0. 25g，蒸餾水定容至1L，pH 7. 2 7. 4，其中氨氮含量約為100mg/L。上述篩選培養基，種子培養基滅菌條件優選1 X 105Pa滅菌20min，葡萄糖單獨 lX105Pa滅菌20min後加入無菌培養基中。固體培養基中需加入1. 5%瓊脂粉。本發明的枯草芽孢桿菌CPU BS-1可以用以下方法培養溫度20 40°C;溶氧搖瓶轉速150 230rpm ；pH5. 0 10. 0 ；麥芽糖18 25g，蛋白腖8 12g，牛肉膏8 10g， NaCl 3 8g，酵母膏2 4g，蒸餾水定容至1L ；初始(NH4) 2S04濃度0. 5 5. Og/L。優選的培養條件是溫度25 37°C ；溶氧搖瓶轉速160 200rpm ；pH7. 0 10.0 ；麥芽糖20g，蛋白腖10g，牛肉膏10g，NaCl 5g，酵母膏3g，蒸餾水定容至1L ；初始 (NH4)2S04 濃度 0.5 4. Og/L。更優選的培養條件是溫度37°C ；溶氧搖瓶轉速200rpm ；pH 7. 5 ；麥芽糖20g， 蛋白腖10g，牛肉膏10g, NaCl 5g，酵母膏3g，蒸餾水定容至1L ；初始(NH4)2S04濃度2. 0g/ L0本發明公開了一種大規模高密度培養枯草芽孢桿菌CPU BS-1的方法，包括在 20 40°C，攪拌轉速120 200rpm，通氣量0. 05 0. 08vvm，接菌量3 6%，初始pH 7. 5 的條件下發酵罐培養細菌。優選的方法包括在37°C、攪拌轉速180rpm、通氣量0. 07vvm、接 菌量5%，初始pH 7. 5的條件下發酵罐培養細菌。本發明的枯草芽孢桿菌CPU BS-1是具有較高的氨氮脫除能力的細菌。在常規的 生長條件下就可表現出氨氮脫除活性。本發明枯草芽孢桿菌CPU BS-1可在含有較高濃度氨氮水體中生長繁殖，通過細菌 體內的生物反應過程，能快速地將一部分氨氮轉化成菌體自身物質，使得水體中的殘餘氨 氮維持在較低的水平，經枯草芽孢桿菌CPU BS-1生物處理的養殖水體可達到對淡水魚蝦類 相對安全的水平。本發明提供了枯草芽孢桿菌CPU BS-1在水體生物脫氮的應用。在本發 明的具體實施例中，枯草芽孢桿菌CPU BS-1,CGMCC No. 3668應用於水體中氮素汙染物的脫 除。本發明公開的具有脫氮生物活性的枯草芽孢桿菌CPU BS-1，在含氨氮的水體中， 能將氨氮快速的轉化為菌體自身的組成物質。這種作用發生的環境是在好氧條件之下。本發明公開了一種對水體進行生物脫氮的方法，包括對本發明枯草芽孢桿菌CPU BS-1進行大規模高密度培養後，通過12，000g，4°C離心15min收穫菌體，重懸於10 20% 的脫脂牛奶，凍幹處理。菌體凍乾粉O.OXKTcfu/g)直接投入淡水養殖水體，使其用量為 200 300g每畝。本發明公開了一種對含氨氮廢水進行生物脫氮的方法，本發明中具有氨氮脫除能 力的枯草芽孢桿菌CPU BS-1可加入到含氨氮廢水中，在自然環境20-27°C靜止或攪拌狀態 下，15-30天後，可脫除水體氨氮的80-95%。更優選的時間是22天。本發明的方法節能高效，操作可在同一反應器中一步進行，無需特殊的設備和額 外的處理條件，氨氮濃度高於2. 2g/L的廢水並不能抑制菌體的生長，並且氨氮脫除率在 80%以上，脫氮效果很好。本發明的枯草芽孢桿菌CPU BS-1是一株好氧異養微生物，它能對富營養化水體， 特別是含較高濃度氨氮的水體進行氮素無害化生物處理，經枯草芽孢桿菌CPU BS-1生物處 理的淡水養殖水體達到對淡水魚蝦類相對安全的水平。枯草芽孢桿菌CPU BS-1的水體無 害化處理是在有氧條件下進行的，不需要特殊的設備和額外的處理條件，氨氮被大量轉化 為菌體自身的組成物質，細菌可以作為魚類的食物從而循環進入食物鏈，從而在實現環境 保護的同時，真正做到了能源和物質的無害、合理再循環。


附圖1是枯草芽孢桿菌CPU BS-1的菌落形態圖附圖2是枯草芽孢桿菌CPU BS-1菌株生長曲線附圖3是枯草芽孢桿菌CPU BS-1對模擬含銨廢水的氨氮脫除曲線附圖4是枯草芽孢桿菌CPU BS-1實際汙染養殖水體中的氨氮脫除曲線
具體實施例方式實施例1CPU BS-1對模擬含銨廢水的氨氮脫除能力1.靛酚藍法測定培養基中氨氮1. 1銨標準溶液配製精密測量0. 2358g 105 °C乾燥至恆重的硫酸銨溶於適量雙蒸水中，轉移至100mL 容量瓶中，然後定容至刻度。即為含銨500i!g/mL的母液。臨用時準確稀釋10倍。1. 2 試劑 A 精密稱取5. OOOOg苯酚和0. 0290g亞鐵基鐵氰化鈉(二水)溶於雙蒸水中，定容 至500mL，棕色瓶4°C保存。1. 3 試劑 B 稱取2. 50g氫氧化鈉、2. 0g檸檬酸三鈉和3. 5mL次氯酸鈉溶於雙蒸水中，定容至 500mL，棕色瓶4°C保存。1.4標準曲線繪製按下表加入各種溶液後，搖勻，37°C水浴反應20min，迅速移至冰浴，測定A637。 靛藍法-分光光度法是一種靈敏度高，重現性好的氨氮檢測方法。氨在高pH條件 下和酚以及次氯酸鹽發生反應而生產出一種靛酚藍的藍色化合物，顏色的深淺與NH4+的濃 度具有很好的相關性，可以利用分光光度法來檢測氨氮的含量。2.種子培養基
7
麥芽糖20g，蛋白腖10g，牛肉膏10g，NaCl 5g，酵母膏3g，蒸餾水定容至1L，pH7. 2。 加入1. 5%瓊脂粉製成固體斜面培養基。3.模擬含銨廢水的配置無機鹽溶液:NaH2P040. 25g, KH2P04 0. 75g, MgS04 7H20 0. 03g, MnS04 H20 0. Olg, FeS04 7H20 0. Olg, (NH4)2S04 10g，蒸餾水定容至1L。葡萄糖溶液稱取36g葡萄糖溶解於 1000ml蒸餾水中形成0. 20mol/L的葡萄糖溶液。以上培養基滅菌條件均為121 °C lX105Pa滅菌20min，葡萄糖單獨115°C 1 X 105Pa 滅菌20min，使用時無機鹽溶液與葡萄糖溶液以體積9 1混合，製成模擬含銨廢水培養基。將菌種枯草芽孢桿菌CPU BS-1轉接到斜面，37°C培養24h復甦後，從斜面接一環 枯草芽孢桿菌CPU BS-1的菌苔入裝有50ml培養基的250ml錐形瓶中，在37°C，200rpm搖 床震蕩。結果培養物在培養22d後，以靛酚藍比色法測氨氮含量，氨氮去除率為89. 1%, 枯草芽孢桿菌CPU BS-1對模擬汙水的氨氮脫除能力見附圖3。實施例2凍乾粉製備以及活菌濃度測定1.凍乾粉製備枯草芽孢桿菌CPU BS-1發酵液加入15% (m/v)脫脂奶粉，凍幹機冷阱預凍 7h-8h，凍幹機真空乾燥。第一段-30°C 240min(4h)，第二段-10°C 600min(10h)，第三段 0°C 960min(16h)，第四段 4°C 360min(6h)。2.凍乾粉活菌濃度的測定凍乾粉測定活菌濃度，用澱粉稀釋至適宜濃度。菌數報告規則宜選取細菌平均菌落數在30 300之間，作為菌數報告(取兩位有 效數字)的依據。2. 1當僅有1個稀釋級的菌落數符合上述規定，以該級的平均菌落數乘以稀釋倍 數的值報告菌數。2. 2當同時有2個稀釋級的菌落數符合上述規定時，視兩者比值(比值為高稀釋級 的菌落數乘以稀釋倍數的值除以低稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數的值)而定。若比值不大 於2，以兩稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數的均值報告菌數；若比值大於2但不超過5時，以 低稀釋級的菌落乘以稀釋倍落數大於或等於低稀釋級的菌落數等異常情況時，應查明原因 再行檢查，必要時，應進行方法的重新驗證。2. 3當各稀釋級的平均菌落數均小於30，以最低稀釋級的平均菌落數乘以稀釋倍 數的值報告菌數。2. 4如各稀釋級的平板均無均落生長，或僅最低稀釋級的平板有菌落生長，但平均 菌落數小於1時，以< 1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。實驗室發酵罐菌體凍乾粉製劑活菌濃度為3. OX lO^cfu/g，中試發酵罐凍乾粉制 劑活菌濃度可達2. OX 101(lCfu/g。實施例3枯草芽孢桿菌CPU BS-1的發酵罐大規模培養從瓊脂斜面上接兩環菌苔裝入有50ml種子培養基的250ml錐形瓶中，在37°C， 200rpm搖床培養12h。按5%接種量接種，將500ml種子培養液轉移至裝有9. 5L發酵培養基的10L發酵罐中。根據搖瓶實驗的研究結果，確定最佳發酵罐的培養條件37°C、攪拌轉 速lOOrpm、通氣量0.07vvm、接菌量5%，發酵培養基組成(g/L)葡萄糖160g，玉米漿40g， 尿素20g，黃豆餅粉5g，碳酸鈣5g，初始pH調節至7. 2，24h後菌株生長進入平臺期。培養 24h可收穫較高濃度的菌體，有利於實際應用中的大規模使用。生長曲線見附圖2。實施例4枯草芽孢桿菌CPU BS-1在實際汙染養殖水體中的氨氮脫除能力按照實施例3，將菌體凍乾粉製劑(2. OX 101(lCfU/g)直接投入汙染淡水養殖池塘， 菌體的投入量為200-300克每畝，每天以納氏試劑比色法測定池塘水體的氨氮含量。結果表明，在水溫25°C、pH8. 6的水體環境下，水中NH4+_N從菌體投放後的第2d開 始下降，到7d時已由6. 72mg/L下降至0. 29mg/L，見圖4，枯草芽孢桿菌CPU BS-1降解氨氮 的效果非常明顯，能在不採取其他方法的情況下，較快地將水體氨氮降解至對魚蝦相對安 全的水平。在整個觀察過程中，PH在8. 4-8. 9的範圍間波動，這個範圍適合枯草芽孢桿菌 CPU BS-1的生長。
權利要求
一種具有脫氮生物活性的細菌，保藏號是CGMCC No.3668。
2.一種培養權利要求1中所述細菌的方法，該方法是在下列條件下培養溫度20 40°C;溶氧搖瓶轉速150 230rpm ；pH5. 0 10. 0 ；培養基每升水中含麥芽糖18 25g， 蛋白腖8 12g，牛肉膏8 10g，NaCl 3 8g和酵母膏2 4g ；初始(NH4) 2S04濃度0. 5 5. Og/Lo
3.權利要求2的方法，該方法是在下列條件下培養溫度37°C；溶氧搖瓶轉速 200rpm ；pH 7. 5 ；培養基每升水中含麥芽糖20g，蛋白腖10g，牛肉膏10g，NaCl 5g和酵母 膏 3g ；初始(NH4)2S04 濃度 2. Og/L。
4.一種大規模培養權利要求1中所述細菌的方法，包括在20 40°C，攪拌轉速120 180rpm,通氣量0. 05 0. 08vvm,接菌量3 6%，培養基每升水中含葡萄糖160g，玉米漿 40g，黃豆餅粉5g，尿素20g，碳酸鈣5g，初始pH6. 0 9. 0的條件下發酵罐培養細菌。
5.權利要求4的方法，包括在37°C、攪拌轉速180rpm、通氣量0.07vvm、接菌量5%， 初始pH 7. 5的條件下發酵罐培養細菌。
6.權利要求1中所述的細菌在養殖水體生物脫氮中的應用。
7.一種對水體進行生物脫氮的方法包括將權利要求1的細菌培養後，懸浮於脫脂牛 奶並凍幹，將凍乾粉直接投入水體，菌體的投入量為1 X lCTcfu/m3。
8.一種汙水處理中氨氮脫除的方法，包括將權利要求1的細菌加入到汙水中，在自然 環境pH6-8，溫度20-40°C靜止或攪拌狀態下，培養15-30天後，即可脫除水體氨氮。
全文摘要
本發明涉及微生物領域，具體涉及一種生物脫氮劑及其應用，本發明的生物脫氮劑是一株枯草芽孢桿菌，命名為枯草芽孢桿菌CPU BS-1，保藏號為CGMCC No.3668，保藏時間2010年3月17日，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心。本發明還公開了該具有脫氮生物學活性的細菌的培養方法，及其在降解水體氮素中的應用。
文檔編號C12N1/20GK101851595SQ201010142220
公開日2010年10月6日 申請日期2010年4月9日 優先權日2010年4月9日
發明者周長林, 和金周, 洪秀娟, 王濤, 竇潔, 賈源賓 申請人:南京曜動節能環保科技有限公司;中國藥科大學