一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法

2024-04-02 18:45:05

專利名稱：：一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法
技術領域：
：本發明涉及l)生物素化沙門氏菌序列特異寡核苷酸捕獲探針首先通過生物素_親和素結合作用固定到親和素包被酶標板上，再通過DNA互補雜交捕獲沙門氏菌序列特異目標單鏈核酸分子，納米金標記沙門氏菌序列特異性寡核苷酸顯示探針進一步通過與目標單鏈核酸分子雜交，在酶標板孔內形成納米金標記三明治雙鏈複合物；2)或者固定在微孔板上的沙門氏菌多克隆抗體首先捕獲目標沙門氏菌，然後納米金標記的沙門氏菌多克隆抗體再與目標菌溫育結合形成夾心結構；3)通過銀染增強，結合在酶標孔內的納米金標記信號被放大3-6個數量級，結合光密度檢測技術或溶出化學發光檢測技術，實現對沙門氏菌的超靈敏檢測。同時該方法很容易推廣應用到其它致病菌的檢測工作中。具體實驗原理如圖1、圖2所示。具體來說，本發明的主要分析步驟如下1試樣製備1.1本發明所用沙門氏菌特異性寡核苷酸探針包括Seq1:5'_SH_(CH2)6_atatccacgcaggaaataacaggactt_3，(顯不探針)；Seq2:5'-gagcgtgccttaccgacgata-(CH2)6-Biotin-3，(捕獲探針)；Seql和Seq2溶解於TE緩衝液(10,1/LTris-HCl，1,1/LEDTA，pH7.4)。本發明所用抗體為鼠抗沙門氏菌多克隆抗體。1.2納米金的製備在圓底燒瓶中加入95.8mL超純水，再加入4.2mL1%的氯金酸溶液，磁力加熱攪拌，持續煮沸10min;加入10mL1%的檸檬酸三鈉溶液(迅速)，溶液開始有些藍色，然後變淺藍色，再加熱出現紅色；等到出現透明的橙紅色，停止加熱，將熱源除去，繼續攪拌15min。圖3為所製備納米金顆粒的紫外_可見吸收光譜，其最大吸收波長為520nm。圖4為所製備納米金顆粒的透射電鏡(TEM)圖，可以看出納米金形貌為較均一的球狀，粒徑在12nm左右。1.3納米金標記顯示探針的製備膠體金溶液500iiL，4。C11000r/min離心13min，棄上清。加300nmol/L(pH7.4的1XTE緩衝液稀釋)巰基化沙門氏菌寡核苷酸顯示探針(seql)50i!L，混勻，置於4t:環境，反應12h。加等體積含0.2mol/L的TE緩衝液，使NaCl終濃度為0.1M，迅速混勻，置於4t:環境，反應24h。加等體積(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE緩衝液，使NaCl終濃度為0.lmol/L，迅速混勻，置於4。C環境，反應24h。取上清，4°C，11000r/min離心8分鐘，棄上清，加100i!L超純水重懸後再次離心，棄上清，以去除多餘的游離寡核苷酸鏈。加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE緩衝液混勻，置4"環境儲存備用。1.4納米金標記鼠抗沙門氏菌多克隆抗體的製備納米金標記鼠抗沙門氏菌多克隆抗體按照以下方法製備一定量的多抗與lmL納米金膠體溶液混合，室溫下孵育2h。隨後於45000g離心30min去除未結合多抗。所得沉澱物即為納米金標記多抗，將其重懸於0.01mol/LpH7.6Tris緩衝液中備用。1.5酶標板包被親和素本發明中夾心型DNA雜交產物是通過生物素化的捕獲探針與包被於酶標板上的親和素之間的特異性結合反應固定在了微孔板上。適合的親和素包被濃度是本發明成功與否的基礎。對親和素的包被濃度進行了優化，測定了不同包被濃度下目標探針濃度與銀增強後吸光度值的關係，結果顯示親和素包被濃度為10.00mg/L時，目標探針濃度與吸光度值之間具有較好的線性關係，所以選擇10.00mg/L為最佳的親和素包板濃度。酶標板包被親和素的具體步驟親和素(lmg/mL)用碳酸鹽包被液按l:100稀釋，每孔包被100iiL，置於4。C環境，12h。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0)每孔250iiL洗滌3次，5min/次，拍幹。用3%牛血清白蛋白(BSA)封閉孔板，防止後面的過程發生非特異性吸附。1.6酶標板包被鼠抗沙門氏菌多克隆抗體酶標板微孔每孔加100L鼠抗沙門氏菌多克隆抗體(10g/mL配置於0.05M碳酸緩衝液，pH9.6)4。C孵育過夜，未結合抗體用0.01mol/LPBS-Tween20(PBST)溶液洗掉。隨後每孔用含1%BSA的0.Olmol/LPBS在37。C封閉lh。接著用PBST溶液洗滌三次。2分析檢測2.1酶標板孔納米金組裝A.DNA雜交法基於夾心型DNA雜交的組裝過程如圖1所示。選用國標法(GBT4789.4-2008)對樣品中沙門氏菌進行選擇性增菌培養，採用商品化試劑盒提取細菌基因組，製備單鏈目標DNA樣品。取20iiL1Onmol/L生物素標記探針(seq2)，與用0.lmol/LPBS(pH7.O，含0.2mol/LNaCl)配製的10yL單鏈目標DNA，混勻，25。C反應10min。加納米金標記顯示探針(含0.1%BSA)8nmol/L，10yL，混勻，在25°C，反應10min。將該40yL體系雜交產物轉移到各酶標板孔，37t:保溫20min，傾倒乾淨。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗滌1次，拍幹，2XPBN(0.3mol/LNaN03和lOmmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗滌2次，拍幹。B.免疫親和法基於夾心型免疫反應的組裝過程如圖2所示。在包被好鼠抗沙門氏菌多克隆抗體的酶標板孔內加入100L目標菌，37t:孵育20min，隨後用PBST劇烈震蕩洗滌3次去除未結合的菌。接著每孔加入100i!L鼠抗沙門氏菌多克隆抗體-納米金複合物，室溫下孵育20min，隨後用PBST劇烈震蕩洗滌3次，去除未結合的抗體_納米金複合物。2.2銀增強信號放大及吸光度檢測取銀增強液迅速混勻立即加入各酶標板孔內，每孔lOOiiL，置於恆溫箱裡反應，反應一定時間後，每孔加超純水洗滌終止反應。然後將銀增強後的微孔板放入酶標儀中，在630nm處檢測其吸光度值。銀增強反應在暗處避光進行，以減少銀自身成核反應，增強特異性。在銀增強過程中，隨著時間的推移，增強液的灰度會不斷增加，尤其是通過雜交或免疫親和錨定於酶標板上的納米金顆粒可顯著加速銀顆粒的聚集，即納米金銀增強信號的吸光度值變化是劑量時間依賴性的(圖5)。在一定的時間控制下，銀增強的灰度值變化與不同濃度目標核酸序列(Seq2)雜交系中固定於酶標孔內的納米金顆粒的量(或通過與目標沙門氏菌免疫親和固定於酶標孔內的納米金顆粒的量)呈正相關。通過一系列實驗優化，選擇出最合適的時間段60-80s終止銀增強反應，得出(DNA雜交分析法)銀增強吸光度值與目標核酸序列的濃度對數值lg[c(target)mol/L]在-13-9範圍內呈良好的線性關係(y=0.0652x+0.8694，R2=0.9948)，檢測範圍為0.l-1000pmol/L，檢測限為33fmol/L;(免疫親和分析法)銀增強吸光度值與目標沙門氏菌的濃度在50-2000cfu/mL範圍內呈良好的線性關係(y=0.0328x+0.4056，R2=0.9932)，檢出限為50cfu/mL。所述銀增強液的製備0.85g氫醌溶於15mL超純水中；1.175g擰檬酸三鈉/1.275g檸檬酸溶於5mL超純水中；0.5g硝酸銀溶於2mL超純水中，溶液均需新鮮配製，確保無結晶體析出且無色，氫醌和檸檬酸混合液應在銀增強前30min左右保持37t:溫育。2.3銀的化學溶出與化學發光檢測6採用l:3HN03(v/v)來溶解納米金表面沉積的銀。以超純水取代化學溶出的銀離子溶液做空白對照，結果用溶銀測出的化學發光值與空白對照化學發光值差值即相對化學發光值表示。結果表明，銀在l:3HN03(v/v)中易於溶解，10min即可溶解完全，為保證其完全溶解，本方法中溶解時間都採用15min。溶出的銀離子催化MnS04-K2S208-H3P04體系生成KMn04，進而氧化luminol化學發光，通過Ag+濃度與化學發光信號之間良好的線性關係完成對目標物質的檢測。本發明選定上述試劑濃度和用量為K2S208濃度為0.02g/mL(200yL)，MnS04濃度6X10_3mol/L(40iiL)，l:1(v/v)H3P04(36iiL)，1Pmol/Lluminol溶液(200iiL)。用l:3(v/v)H冊3來溶解銀增強後各酶標板孔內的銀(100iiL/孔)，溶解所得的銀離子溶液中均加入60L5mol/L的NaOH來調節其酸度。然後該溶液轉移至含有200iiL2%(m/V)K2S208，40iiL6X10—3mol/LMnS04禾P36iiL1:1(v/v)H3P04的離心管中，混合均勻後馬上放入9(TC水浴中加熱7分鐘。流水冷卻中止該催化反應並用5mol/LNaOH調節溶液的pH值至10。取該溶液50iiL轉移至石英發光管中，然後注射入200yLluminol(1iimol/L，pH13.5)同時在發光分析儀上記錄發光信號。本發明中銀離子的化學發光強度和目標沙門氏菌特異DNA或沙門氏菌的濃度成正比，可以得出化學發光信號和待測沙門氏菌的關係。採用DNA雜交分析方法時，得方法線性範圍為l-1000fmol/L，校正曲線方程為AI=1672.42C(fmol/L)+26477(R2=0.9932)。相對標準偏差(RSD)為5.3%(20fmol/L，n=11)，檢測限為0.3fmol/L(3o)。至少5cfu/mL目標菌可以用本發明方法檢出。採用免疫親和分析方法時，化學發光強度與目標菌數量線性範圍為5-1038cfu/mL。回歸方程為AI=7.12C(cfu/mL)+857.78(R2=0.9935)，相對標準偏差(RSD)為4.7%(50-100cfu/mL，n=11)，檢測限為5cfu/mL。3分析性能本發明創新性的利用了沙門氏菌序列特異性寡核苷酸捕獲探針、金標沙門氏菌顯示探針與目標核酸序列之間的DNA雜交，形成三明治複合體；或者鼠抗沙門氏菌多克隆抗體直接捕獲目標食源性致病菌，再與納米金標記鼠抗沙門氏菌多克隆抗體結合形成夾心型複合體；利用納米金銀增強原理，結合光密度檢測技術或化學發光檢測技術，建立了沙門氏菌新型超靈敏檢測方法，不僅發揮了納米金標記的優勢，更利用了銀增強技術將信號有效放大，建立了比傳統方法更靈敏高效的檢測手段。該方法也極易通過改變寡核苷酸探針或多克隆抗體類別應用於其它致病菌的檢測，有可能為其他致病菌的超靈敏分析開闢一條新的途徑。圖1基於納米金標銀增強技術的沙門氏菌檢測示意圖(DNA雜交分析法)圖2基於納米金標銀增強技術的沙門氏菌檢測示意圖(免疫親和分析法)圖3納米金的紫外_可見吸收圖譜圖4所製備納米金的TEM形貌圖5不同濃度目標探針的銀增強時間與吸光度值的關係曲線圖6本發明方法對沙門氏菌序列特異寡核苷酸序列響應情況比較(a，完全互補目7標寡核苷酸序列；b，單鹼基錯配寡核苷酸序列；c，五鹼基錯配寡核苷酸序列；d，隨機對照鏈圖7)目標沙門氏菌濃度與化學發光強度校正曲線具體實施例方式下面的實例將具體說明本發明的操作方法，但不能作為對本發明的限定。實例11材料1.1儀器MultiskanMK3酶標儀(美國Thermo公司)，DF-101S型集熱式磁力加熱攪拌器(河南鞏義市予華儀器廠)，TU-1900紫外可見光分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)，TecnaiG220透射電鏡(TEM)(美國FEI公司)，LH586-2型恆溫水槽(上海精科實業有限公司)，5804R高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器廠)，96酶標板(加拿大BBI公司)。1.2試劑和樣品牛血清白蛋白(BSA)(北京鼎國生物工程有限公司)，氯金酸(HAuCl4)(上海久嶽化工有限責任公司)，氫醌、硝酸銀、磷酸(中國醫藥上海化學試劑公司)，親和素(美國Amresco公司產品)，超純水由Milli-Qsystem製取。寡核苷酸序列購於上海生工生物工程技術服務有限公司。Seq1:5'-SH-(CH2)6_atetccacgcaggaaateacaggactt-3，(顯不探針)；Seq2:5'-gagcgtgccttaccgacgata-(CH2)6-Biotin-3'(捕捉探針)；Seq3:3'-tataggtgcctcctttattgtcctgaaattgctgttaatcttctttacgctctcgcacggaatggctgctat-5'(目標序列)；Seq4:5'-tatcgtcggtaaggcacgctcaattgtcgttaaagtcctgttatttcctgggtggatat-3'(單減基錯配鏈)；Seq5:5'-tatcgtcagtaaggcacactcaattgtcgttaaagtcgtgttattacctgcgaggatat-3'(五減基錯配鏈)；S印6:5'-acatctgcatttccgttaaagtcccgttcgtaaatgctgttgcggcttgcttttccgcg-3'(對照序列_隨機鏈)。Seq1和Seq2溶解於TE緩衝液(10mmol/LTris-HCl，lmmol/LEDTA，pH7.4)，Seq3_6直接溶於超純水中。2方法2.1操作步驟取20iiL10nmol/L生物素標記探針(seq2)，與用0.lmol/LPBS(pH7.0，含0.2mol/LNaCl)配製的10yL單鏈目標DNA，混勻，25。C反應10min。加納米金標記顯示探針(含O.1%BSA)8nmol/L，10iiL，混勻，在25。C，反應10min。將該40yL體系雜交產物轉移到各酶標板孔，37"C保溫20min，傾倒乾淨。含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗滌1次，拍幹，2XPBN(0.3mol/LNaN03和10mmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗滌2次，拍幹。取銀增強液迅速混勻立即加入各酶標板孔內，每孔100iiL，置於恆溫箱裡反應，反應60-80s後，每孔加超純水洗滌終止反應。採用1:3HN03(v/v)來溶解納米金表面沉積的銀，時間15min。以超純水取代化學溶出的八8+溶液做空白對照，結果用溶銀測出的化學發光值與空白對照差值即相對化學發光值表示。溶出的銀離子催化MnS04-K2S208-H3P04體系生成KMn04，進而氧化luminol化學發光，通過Ag+濃度與化學發光信號之間良好的線性關係完成對目標物質的檢測。2.2製作標準曲線、確定靈敏度在實驗選定最佳條件下，測定了不同濃度沙門氏菌序列特異目標DNA(Seq3)的化學發光響應情況。得方法線性範圍為l-1000fmol/L，校正曲線方程為AI=1672.42C(fmol/L)+26477(R2=0.9932)。相對標準偏差(RSD)為5.3%(20fmol/L，n=ll)，檢測限為O.3fmol/L(3o)。同時，測定了本發明方法對沙門氏菌(以Salmonellatyphimurium為例)檢測的靈敏度，結果顯示(表l)，至少5cfu/mLSalmonellatyphimurium可以用本發明方法檢出。表1平板計數方法和本發明方法測定標準沙門氏菌結果稀釋梯度a平板計數結果b(cfu/mL)本發明方法測定結果No.l00+No.200+No.300+No.430500+No.53540+No.6452+No.738+No.8+No.92—a，每個稀釋梯度稀釋倍數為10;b，為兩次平板計數結果平均值。2.3選擇性分析比較了完全互補目標DNA序列(lOfmol/L)與單鹼基錯配、五鹼基錯配、隨機對照序列(100fmol/L)的響應情況。結果顯示，其它序列響應值顯著小於完全互補DNA序列響應值(圖6)，如完全互補DNA序列響應值為100，則隨機對照序列響應值為0.9。表明本發明方法具有良好的選擇性。同時考察了本發明方法對目標菌和其它不同種類菌(均約lOOcfu/mL)的實際響應情況。結果表明(表2)，相對於沙門氏菌其它菌基本沒有響應，進一步證實了本發明方法對沙門氏菌測定的特異性。表2本發明方法對不同種類菌株的測定結果tableseeoriginaldocumentpage102.4樣品測定按照國標法(GBT4789.4-2008)對30個取自不同場所的食品樣品進行處理，採用商品化試劑盒提取細菌基因組，製備單鏈目標DNA樣品。採用本發明方法檢測目標菌數量，同時採用國標法(GB/T4789.30-2008)進行對照驗證實驗。結果顯示(表3)，本發明方法對於實際樣品中目標菌的測定結果與國標法(GB/T4789.30-2008)—致，準確性良好。表3國標法和本發明方法測定食品樣品中目標菌的結果tableseeoriginaldocumentpage103結果分析由上述分析測定結果可知，本發明所提供的方法可通過DNA雜交的方式，結合納米金標記_銀增強信號放大_化學發光檢測(或光密度檢測)，實現對目標沙門氏菌的超靈敏檢測。方法特異性、準確度良好。實例21試劑與材料鼠抗沙門氏菌多克隆抗體購自上海生工。納米金和鼠抗沙門氏菌多克隆抗體-納米金複合物在本實驗室製備合成。所用沙門氏菌菌株和其它涉及到的菌株為本實驗室保藏。所測定食品樣品購自當地6個不同農貿市場。所用其它試劑材料、儀器設備與實例1相同。2方法2.1操作步驟在包被好鼠抗沙門氏菌多克隆抗體的酶標板孔內加入100i!L目標菌，37t:孵育20min，隨後用PBST劇烈震蕩洗滌3次去除未結合的菌。接著每孔加入100yL鼠抗沙門氏菌多克隆抗體_納米金複合物，室溫下孵育20min，隨後用PBST劇烈震蕩洗滌3次，去除未結合的抗體-納米金複合物。取銀增強液迅速混勻立即加入各酶標板孔內，每孔100iiL，置於恆溫箱裡反應，反應一定時間後，每孔加超純水洗滌終止反應。採用1:3HN03(v/v)來溶解納米金表面沉積的銀，溶解15min。以超純水取代化學溶出的八8+溶液做空白對照，結果用溶銀測出的化學發光值與空白對照差值即相對化學發光值表示。溶出的銀離子催化MnS04-K2S208-H3P04體系生成KMn04，進而氧化luminol化學發光，通過Ag+濃度與化學發光信號之間良好的線性關係完成對目標物質的檢測。2.2製作標準曲線、確定靈敏度在實驗優化條件下，採用本發明方法測定目標沙門氏菌，其實際數量通過平板計數法加以對照和驗證。結果顯示(圖7):化學發光強度與目標菌數量線性範圍為5-1038cfu/mL，回歸方程為AI=7.12C(cfu/mL)+857.78(R2=0.9935)，相對標準偏差(RSD)為4.7%(50-100cfu/mL，n=11)，檢出限為5cfu/mL。2.3選擇性分析通過測定目標沙門氏菌和其它不同類型菌株(大約100cfu/mL)，對本發明方法的選擇性進行驗證。結果顯示(表4)，目標沙門氏菌具有正常化學發光響應，其它類型菌株產生的化學發光強度則顯著小於目標菌的化學發光強度，表明本發明方法具有良好的選擇性。表4本發明方法測定不同類型菌株的結果菌株類型相對化學發光強度5W/腳"e〃a妙/z/mwh鵬1420^&c/zm'c/H'aco//25丄/他r/amowocytogene51272.4樣品測定按照國標法(GB/T4789.30-2008)對取樣得到的50個樣品進行沙門氏菌選擇性增菌培養，隨後採用本發明方法進行沙門氏菌數量測定，同時採用國標法(GB/T4789.30-2008)進行對照驗證。結果顯示(表5)，本發明方法與國標法(GB/T4789.30-2008)檢測結果一致，表明本發明方法準確性良好。表5本發明方法與國標法測定實際樣品中沙門氏菌的結果比較食品樣品樣本數陽性數(陽性率°/。)GB/T4789.30-2008本發明方法禽肉161(6.25%)1(6.25%)豬肉151(6.67%)1C6.670/0)即食食品192(10.53%)2(10.53%)總計504(8，/(04(8.00%)3結果分析由上述分析測定結果可知，本發明所提供的方法可通過鼠抗沙門氏菌多克隆抗體與目標沙門氏菌免疫親和的方式，結合納米金標記_銀增強信號放大_化學發光檢測(或光密度檢測)，實現對目標沙門氏菌的超靈敏檢測。方法特異性、準確度良好。1權利要求一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法，其特徵在於(1)沙門氏菌序列特異性寡核苷酸捕獲探針、納米金標記沙門氏菌序列特異性寡核苷酸顯示探針與目標菌目標核酸序列之間的DNA雜交，形成三明治複合體；(2)鼠抗沙門氏菌多克隆抗體、納米金標記鼠抗沙門氏菌多克隆抗體與目標菌直接免疫親和，形成三明治複合體；(3)加入銀增強溶液，組裝錨定在酶標孔上的納米金顆粒加速銀顆粒的沉積，通過檢測吸光度可對沙門氏菌定量檢測；(4)進一步將沉積的銀化學溶出，採用luminol化學發光檢測，可提高靈敏度10倍以上。2.如權利要求1所述一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法，其特徵在於納米金標記沙門氏菌序列特異寡核苷酸顯示探針的製備1)膠體金溶液500iiL，4。C11000r/min離心13min，棄上清。2)加300nmol/L(pH7.4的1XTE緩衝液稀釋)巰基化沙門氏菌報告寡核苷酸探針(seql)50yL，混勻，置於4"環境，反應12h。3)加等體積含0.2mol/L的TE緩衝液，使NaCl終濃度為0.1M，迅速混勻，置於4t:環境，反應24h。3)加等體積(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE緩衝液，使NaCl終濃度為0.lmol/L，迅速混勻，置於4。C環境，反應24h。4)取上清，4°C，11000r/min離心8分鐘，棄上清，加100yL超純水重懸後再次離心，棄上清，以去除多餘的游離寡核苷酸鏈。5)加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE緩衝液混勻，置4"環境儲存備用。3.如權利要求1所述一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法，其特徵在於納米金標記鼠抗沙門氏菌多克隆抗體複合物的製備1)膠體金溶液500iiL，4。C11000r/min離心13min，棄上清。2)加300nmol/L(pH7.4的1XTE緩衝液稀釋)目標菌單克隆抗體(或多克隆抗體)50iiL，混勻，置於4t:環境，反應12h。3)加等體積含0.2mol/L的TE緩衝液，使NaCl終濃度為0.1M，迅速混勻，置於4t:環境，反應24h。3)加等體積(50iiL)含0.2mol/LNaCl的1XTE緩衝液，使NaCl終濃度為0.lmol/L，迅速混勻，置於4°C環境，反應24h。4)取上清，4°C，11000r/min離心8分鐘，棄上清，加100yL超純水重懸後再次離心，棄上清，以去除多餘的游離單抗。5)加100iiL含0.lmol/LNaCl的1XTE緩衝液混勻，置4"環境儲存備用。4.如權利要求1所述一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法，其特徵在於酶標板包被親和素的製備1)親和素(lmg/mL)用碳酸鹽包被液按1:100稀釋，每孔包被100yL，置於4"環境，12h。2)含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0)每孔250iiL洗滌3次，5min/次，拍幹。3)用3%BSA封閉孔板，防止後面的過程發生非特異性吸附。5.如權利要求1所述一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法，其特徵在於生物素標記沙門氏菌捕獲探針、金標沙門氏菌顯示探針與沙門氏菌目標核酸序列之間的DNA雜交1)生物素標記探針(seq2)10nmol/L，20iiL用含0.2mol/LNaCl的0.lmol/LPBS(pH7.0)配製的一系列濃度的目的核酸(seq3)以及對照序列(seq4)各10iiL(l翻1/L-10nmol/L)，混勻，在25。C，反應10min。2)加膠體金標記探針(含0.1%BSA)8nmol/L，10yL，混勻，在25°C，反應10min。3)將該40iiL體系雜交產物轉移到各酶標板孔，37t:保溫20min，傾倒乾淨。4)含0.2mol/LNaCl的0.02mol/LPB(pH7.0):洗滌1次，拍幹，2XPBN(0.3mol/LNaN03禾P10mmol/LNa2HP04/NaH2P04，pH7.0)洗滌2次，拍幹。6.如權利要求1所述一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法，其特徵在於納米金標記物的銀增強信號放大取銀增強液迅速混勻立即加入各組裝好納米金標記物的酶標板孔內，每孔100i!L，置於恆溫箱裡反應，反應60-80s後，每孔加超純水洗滌終止反應。然後將銀增強後的微孔板放入酶標儀中，在630nm處檢測其吸光度值。所述銀增強液的製備0.85g氫醌溶於15mL超純水中；1.175g檸檬酸三鈉/1.275g檸檬酸溶於5mL超純水中；0.5g硝酸銀溶於2mL超純水中，溶液均需新鮮配製，確保無結晶體析出且無色，氫醌和檸檬酸混合液應在銀增強前30min左右保持37t:溫育。7.如權利要求1所述一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法，其特徵在於銀增強後的光密度檢測銀增強後於酶標儀上630nm檢測吸光度值，吸光度值與目標沙門氏菌序列特異DNA或目標沙門氏菌數量成正相關。8.如權利要求1所述一種基於納米金標銀增強信號放大技術的沙門氏菌檢測方法，其特徵在於銀增強後的溶出化學發光檢測用l:3(v/v)HN03來溶解銀增強後各酶標板孔內的銀(100iiL/孔)，溶解所得的銀離子溶液中均加入60iiL5mol/L的NaOH來調節其酸度。然後該溶液轉移至含有200yL2%(m/V)K2S208，40iiL6X10—3mol/LMnS0^P36iiL1:1(v/v)H3P04的離心管中，混合均勻後馬上放入9(TC水浴中加熱7分鐘。流水冷卻中止該催化反應並用5mol/LNaOH調節溶液的pH值至10。取該溶液50iiL轉移至石英發光管中，然後注射入200iiLluminol(1ymol/L，pH13.5)同時在發光分析儀上記錄發光信號。通過Ag+濃度與化學發光信號之間良好的線性關係完成對沙門氏菌的超靈敏檢測。全文摘要本發明涉及利用沙門氏菌特異寡核苷酸捕獲探針、納米金標記特異寡核苷酸顯示探針與致病菌目標核酸序列之間的DNA雜交，或沙門氏菌多克隆抗體、納米金標記多克隆抗體與沙門氏菌直接免疫親和，形成三明治複合體；加入銀增強液，雜交或免疫親和錨定在酶標孔上的納米金顆粒加速銀顆粒的沉積，通過吸光度檢測，實現對沙門氏菌的靈敏檢測，該方法的檢出限可達到33fmol/L(DNA雜交分析)或50cfu/mL(免疫親和分析)；進一步將沉積的銀化學溶出，採用luminol化學發光檢測，可使方法的檢出限達到0.3fmol/L(DNA雜交分析)或5cfu/mL(免疫親和分析)。本發明建立的食源性致病菌檢測技術準確、靈敏、快速，對於食品安全具有重要意義。文檔編號C12Q1/06GK101776688SQ20101902605公開日2010年7月14日申請日期2010年2月8日優先權日2010年2月8日發明者李井泉,段諾,王周平申請人:江南大學