一種多級固定化酶膜反應裝置及利用其製備酪蛋白磷酸肽的方法
2024-04-02 18:52:05
專利名稱:一種多級固定化酶膜反應裝置及利用其製備酪蛋白磷酸肽的方法
技術領域:
本發明涉及酪蛋白磷酸肽的製備裝置與方法,具體涉及一種多級固定化酶膜反應
裝置及利用其製備酪蛋白磷酸肽的方法。
背景技術:
酪蛋白磷酸肽(casein phosphop印tide即CPPs)是以牛乳酪蛋白為原料經單一 或複合酶催化水解、分離、純化而製得的含有成簇磷酸絲氨酸的一種天然生物活性多肽。
酪蛋白磷酸肽可作為無機離子的載體,它在pH呈中性至微鹼性的動物小腸下端, 能與Ca2+、 Fe"和Zn2+等金屬離子結合,阻止金屬離子與磷酸根產生沉澱,使小腸內可溶性 的鈣、鐵和鋅的濃度增加,從而促進這些必需金屬離子的吸收和利用。此外,在動物和人的 實驗中,CPPs表現出抗齲齒、抗骨丟失、增強受精和胚胎發育等作用。 我國居民平均每日鈣攝入量只有405. 4mg,只佔每日推薦量的50 %左右,在有些 地區兒童佝僂病的發病率高達40%,骨質疏鬆症也是困擾老人的常見疾病之一,因此對我 國來說,全民補f丐顯得尤其重要。而補f丐時不僅要注重f丐的攝入,更要注重f丐的吸收。而 CPPs由於能夠促進鈣吸收的這一功能,其市場應用前景相當廣闊。 酪蛋白磷酸肽的核心結構為-Ser (P)-Ser (P)-Ser (P)-Glu-Glu-,這一序列也正是 CPPs的功能基因,其含量的多少與CPPs的功能特性直接相關。因此,不同分子量的CPPs展 現出不同的品質及功能特性。目前,未有一種方法能對酪蛋白磷酸肽產品分子量進行控制。
目前,酪蛋白磷酸肽的主要生產方法是酶解法,即在普通水解罐中用蛋白酶對底 物酪蛋白進行水解,水解結束後,高溫滅酶,再調節反應液pH使未水解的酪蛋白沉澱,離心 後噴霧乾燥或者使用乙醇鈣沉澱法製得。工藝過程中主要存在如下問題(l)酶不能循環 利用,酶量消耗大,生產成本高。(2)底物水解不完全,未反應的底物被離心後去除,浪費生 產原料。(3)產品純度低,一般噴霧乾燥後得到的產品純度僅在12%左右,完全滿足不了市 場要求。也有報導用反應分離耦合方法來製備酪蛋白磷酸肽,但是其蛋白酶沒有被固定化, 不能重複利用,增加了生產成本。(4)不能控制產品品質,不能對酪蛋白磷酸肽的分子量進 行控制。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種多級固定化酶膜反應裝置,利用該反應器 可同時製備出不同分子量的產品。 本發明還要解決的技術問題是提供利用上述多級固定化酶膜反應器製備酪蛋白 磷酸肽的方法,該方法可同時製備出不同分子量和不同品質純度的酪蛋白磷酸肽,極大的 提高了生產效率。 為解決上述技術問題,本發明採用的技術方案如下 —種多級固定化酶膜反應裝置,它包含N級串聯的固定化酶膜反應器和一個納濾裝置;每一級固定化酶膜反應器以聚碸多孔材料為支撐在反應器內部形成圓筒,將反應器 分隔為圓筒內和圓筒外兩個空間,以聚酯無紡布增強上述圓筒結構的強度,將截留分子量 為1000 10000Da的膜裝填在上述圓筒結構的內側,膜內側表面上固定有蛋白酶;納濾裝 置中設有截留分子量為100 500Da的納濾膜;第1級固定化酶膜反應器圓筒外部通過管 道與第2級固定化酶膜反應器圓筒內部相連通,第2級固定化酶膜反應器圓筒外部通過管 道與第3級固定化酶膜反應器圓筒內部相連通,以此類推,直至第N級固定化酶膜反應器, 第N級固定化酶膜反應器圓筒外部通過管道與納濾裝置相連通,第2級至第N級固定化酶 膜反應器圓筒內部分別通過管道與納濾裝置相連通,上述管道都設有閥門;第1級固定化 酶膜反應器至第N級固定化酶膜反應器,其膜的截留分子量依次遞減;所述的N取2 100 的整數。 其中,所述截留分子量為1000 lOOOODa的膜為聚醯胺複合膜、醋酸纖維膜和聚 碳酸酯複合膜中的任意一種。 其中,所述固定化酶膜反應器裝有控溫夾套。 其中,所述固定化酶膜反應器圓筒內部設有攪拌槳。 其中,所述蛋白酶為鹼性蛋白酶(Alcalase)、胰酶(Trypsin)、木瓜蛋白酶 (Papain)、中性蛋白酶(Neutrase)、複合蛋白酶(Protemax)中的任意一種或幾種。
上述蛋白酶固定在膜上的方法為採用凝膠化法將蛋白酶固定化在膜內側表面 上。即用膜組件在操作壓力為0. 01 0. 08M Pa,循環流量10 30L/h的條件下超濾蛋白 酶溶液,由於酶分子不能透過膜而在膜表面沉積,當膜_液兩相界面處酶蛋白的濃度達到 凝膠化濃度時,酶便以一薄膜凝膠層的形式固定在膜的表面,從而實現酶在膜上面的固定 化。所述的蛋白酶溶液是通過將蛋白酶溶解於PH6. 0 9. 0的磷酸緩衝液中製成。
其中,所述N取2 5的整數。 利用上述多級固定化酶膜反應裝置製備酪蛋白磷酸肽的方法,將酪蛋白溶液注入 到第1級固定化酶膜反應器圓筒內部,進行酶解反應,反應結束後,通過超濾將圓筒內部液 體中分子量小於第1級膜分子量的物料轉換到圓筒外部,再通過管道將第1級固定化酶膜 反應器圓筒外部的物料注入第2級固定化酶膜反應器圓筒內部,進行酶解反應,反應結束 後,通過超濾將圓筒內部液體中分子量小於第2級膜分子量的物料轉換到圓筒外部,以此 類推,直至第N級固定化酶膜反應器,將第N級固定化酶膜反應器圓筒外部液體通過管道注 入納濾裝置中,經納濾脫鹽濃縮得到分子量小於第N級膜分子量且大於納濾膜分子量的酪 蛋白磷酸肽;同時可在第2級至第N級中的每一級固定化酶膜反應器進行超濾後將該級固 定化酶膜反應器圓筒內部的物料注入納濾裝置中,經納濾脫鹽濃縮得到分子量小於該級之 前一級膜分子量且大於該級膜分子量的酪蛋白磷酸肽,第1級固定化酶膜反應器圓筒內部 可補充酪蛋白溶液重複反應。 其中,所述的酪蛋白溶液,濃度為40 150g/L,pH為6. 5 9. 5。 其中,每一級固定化酶膜反應器的反應溫度為30 6(TC,攪拌速度為50
250rpm,酶解反應時間為1 3h。 其中,每一級固定化酶膜反應器超濾壓力為0. 01 0. 08M Pa。
上述反應可連續進行,也可以間歇性進行。
有益效果與現有技術相比,本發明的優點是
(1)採用凝膠化法將酶固定在膜上形成固定化酶膜反應器,實現酶的重複利用,降 低了生產成本。 (2)固定化的酶膜反應器集生產分離與一體,同步實現反應催化和產物分離,簡化 了酪蛋白磷酸肽的生產步驟,提高了生產效率。 (3)通過不同級數的酶膜反應器串聯,並用不同截留分子量的超濾膜和納濾膜組 合分離酪蛋白磷酸肽,可同時得到不同分子量大小的磷酸肽產品,可以隨時根據客戶要求 生產不同品質的產品。 (4)節約了原料,一級反應器中未被水解的底物酪蛋白經第二次反應時被利用,避 免了原料的浪費,直接降低了反應成本。 (5)本發明所涉及的反應條件溫和,能耗低,固定化酶膜反應器可以重複使用和連 續化生產,極大的提高酶的利用率和產品的純度,適合大規模連續化生產的要求。
圖1為本發明的多級固定化酶膜反應裝置示意圖。 其中1為控溫夾套;2為攪拌槳;3為膜組件(即圓筒);4為固定化酶膜反應器;5 為產品儲罐;6為閥門;7納濾裝置。
具體實施例方式
根據下述實施例,可以更好地理解本發明。然而,本領域的技術人員容易理解,實 施例所描述的具體的物料配比、工藝條件及其結果僅用於說明本發明,而不應當也不會限 制權利要求書中所詳細描述的本發明。
實施例1 : 圖1為本發明的一個具體的實施例,從圖中可以看出,該多級固定化酶膜反應裝 置,包含3級串聯的固定化酶膜反應器4和一個納濾裝置;每一級固定化酶膜反應器以聚碸 多孔材料為支撐在反應器內部形成圓筒3,將反應器分隔為圓筒內和圓筒外兩個空間,以聚 酯無紡布增強上述圓筒結構的強度,將截留分子量為1000 10000Da的膜裝填在上述圓筒 結構的內側,膜內側表面上固定有蛋白酶;納濾裝置中設有截留分子量為100 500Da的納 濾膜;第1級固定化酶膜反應器圓筒外部通過管道與第2級固定化酶膜反應器圓筒內部相 連通,並通過閥門6a控制管道開合;第2級固定化酶膜反應器圓筒外部通過管道與第3級 固定化酶膜反應器圓筒內部相連通,並通過閥門6b控制管道開合;第3級固定化酶膜反應 器圓筒外部通過管道與納濾裝置7相連通,並通過閥門6c控制管道開合;第2級固定化酶 膜反應器圓筒內部通過管道與納濾裝置7相連通,並通過閥門6d控制管道開合;第3級固 定化酶膜反應器圓筒內部通過管道與納濾裝置7相連通,並通過閥門6e控制管道開合;第 1級固定化酶膜反應器至第3級固定化酶膜反應器,其膜的截留分子量依次遞減。每一個固 定化酶膜反應器還裝有控溫夾套l,並且在圓筒內部設有攪拌槳2。 圖l只顯示了本發明的一種實施方式,當然固定化酶膜反應器的數量不僅僅是3 個,可以是2以上的任意個,無論固定化酶膜反應器的數量如何變化,其連接關係和連接原 理是類似於圖1顯示的裝置的,本領域技術人員很容易理解,按照圖1的結構原理,將N個 固定化酶膜反應器及納濾裝置連接起來,從而實現本發明的目的。
根據圖1的裝置,將截留分子量為8000、6000、3000Da的聚醯胺複合膜分別置於第
1、2、3級固定化酶膜反應器圓筒內側,將截留分子量為350Da的納濾膜置於納濾裝置中。當
然,本發明並不局限於上述截留分子量和上述材質的膜,任何截留分子量和材質的膜都可
以適用於本發明,只要保證膜的截留分子量按液流方向依次遞減即可。 稱取5g木瓜蛋白酶,溶於1L pH 7. 0的磷酸緩衝液中,將酶液倒入固定化酶膜反
應器圓筒內,在操作壓力0. 05M Pa,循環流量lOL/h的條件下進行超濾,由於酶分子不能透
過膜而在膜表面沉積,當膜_液兩相界面處酶分子的濃度達到凝膠化濃度時,酶便以一薄
膜凝膠層的形式固定在膜的表面,從而實現酶在膜上面的固定化。當然酶的種類也不局限
於上述的木瓜蛋白酶,只有是具有水解酪蛋白為酪蛋白磷酸肽能力的酶都可以使用,且都
在本發明的保護範圍內。 以下實施例均使用本實施例中的裝置。
實施例2 : 稱取500g酪蛋白,加入10L 0. 05M NaOH溶液置於儲液罐中,加熱並不斷攪拌使得 酪蛋白完全溶解,待酪蛋白完全溶解後用5M NaOH溶液將反應液的pH調至7. 0。
將酪蛋白溶液注入第1級固定化酶膜反應器圓筒內,開啟循環冷卻加熱裝置,將 反應溫度控制在50°C,同時開啟攪拌槳,調節攪拌轉速為lOOrpm,開始酶解反應,反應過程 中用5M NaOH溶液將反應液的pH恆定在7. 0。水解2h後,開啟超濾裝置,超濾操作壓力為 0. 05Mpa,循環流量10L/h。將水解產生的分子量低於8000Da的酪蛋白磷酸肽透過,轉換到 圓筒的外部,開啟閥門6a,使分子量低於SOOODa的酪蛋白磷酸肽流入到第2級固定化酶膜 反應器圓筒內,未透過第1級膜的底物酪蛋白以及大分子多肽則留在酶膜反應器中繼續水 解,同時根據超濾透過的液體量補加同量的pH 7. 0的酪蛋白溶液繼續反應。
待第2級固定化酶膜反應器圓筒內的液體達到5L左右後,打開第2級攪拌槳, 開始水解反應,反應條件與第1級相同。約水解1小時後開啟超濾裝置,超濾操作壓力為 0. 05Mpa,循環流量10L/h。將水解產生的分子量低於6000Da的酪蛋白磷酸肽透過,轉換到 圓筒的外部,開啟閥門6b,使分子量低於6000Da的酪蛋白磷酸肽流入到第3級固定化酶膜 反應器圓筒內。第2級固定化酶膜反應器圓筒內為分子量在6000 8000Da之間的酪蛋白 磷酸肽。 待第3級固定化酶膜反應器圓筒內的液體達到3L左右後,打開第3級攪拌槳,
開始水解反應,反應條件與第1級相同。約水解1小時後開啟超濾裝置,超濾操作壓力為
0. 05Mpa,循環流量10L/h。將水解產生的分子量低於3000Da的酪蛋白磷酸肽透過,轉換到
圓筒的外部,開啟閥門6c,使分子量低於3000Da的酪蛋白磷酸肽流入到納濾裝置中。第2
級固定化酶膜反應器圓筒內為分子量在3000 6000Da之間的酪蛋白磷酸肽。 將開啟納濾裝置,用於產品的濃縮及脫鹽,操作壓力0. 15Mpa,當脫水率達50X,
結束納濾。納濾濃縮液為分子量在350 3000Da的酪蛋白磷酸肽產品。 也可開啟閥門6d,直接將第2級固定化酶膜反應器圓筒內液體注入納濾裝置中,
經納濾脫鹽濃縮得到分子量在6000 8000Da的酪蛋白磷酸肽產品。 也可開啟閥門6e,直接將第3級固定化酶膜反應器圓筒內液體注入納濾裝置中, 經納濾脫鹽濃縮得到分子量在3000 6000Da的酪蛋白磷酸肽產品。
經檢測,上述3種酪蛋白磷酸肽的指標如下
分子量8000 6000Da的酪蛋白磷酸肽純度22. 81%,蛋白含量93. 07%, N含
量14. 59%、P含量0. 99% ; 分子量3000 6000Da的酪蛋白磷酸肽純度44. 19%,蛋白含量92. 40X,N含
量14. 48%、P含量1. 47% ; 分子量350 3000Da的酪蛋白磷酸肽純度67. 25%,蛋白含量91. 71%, N含 量14. 37%、P含量1. 86%。
實施例3 : 稱取400g酪蛋白,加入8L 0.05M NaOH溶液置於儲液罐中,加熱並不斷攪拌使得 酪蛋白完全溶解,待酪蛋白完全溶解後用5M NaOH溶液將反應液的pH調至7. 0。
將酪蛋白溶液注入第1級固定化酶膜反應器圓筒內,開啟循環冷卻加熱裝置,將 反應溫度控制在55°C,同時開啟攪拌槳,調節攪拌轉速為150rpm,開始酶解反應,反應過程 中用5M NaOH溶液將反應液的pH恆定在8. 0。水解3h後,開啟超濾裝置,超濾操作壓力為 0. 05Mpa,循環流量10L/h。將水解產生的分子量低於8000Da的酪蛋白磷酸肽透過,轉換到 圓筒的外部,開啟閥門6a,使分子量低於8000Da的酪蛋白磷酸肽流入到第2級固定化酶膜 反應器圓筒內,未透過第1級膜的底物酪蛋白以及大分子多肽則留在酶膜反應器中繼續水 解,同時根據超濾透過的液體量補加同量的pH 7. 0的酪蛋白溶液繼續反應。
待第2級固定化酶膜反應器圓筒內的液體達到5L左右後,打開第2級攪拌槳, 開始水解反應,反應條件與第1級相同。約水解1小時後開啟超濾裝置,超濾操作壓力為 0. 05Mpa,循環流量10L/h。將水解產生的分子量低於6000Da的酪蛋白磷酸肽透過,轉換到 圓筒的外部,開啟閥門6b,使分子量低於6000Da的酪蛋白磷酸肽流入到第3級固定化酶膜 反應器圓筒內。第2級固定化酶膜反應器圓筒內為分子量在6000 8000Da之間的酪蛋白 磷酸肽。 直接打開閥門6e,使來自第2級固定化酶膜反應器圓筒外的液體不經水解反應直
接注入納濾裝置,開啟納濾裝置,用於產品的濃縮及脫鹽,操作壓力O. 15Mpa,當脫水率達
50%,結束納濾。納濾濃縮液為分子量在350 6000Da的酪蛋白磷酸肽產品。 也可開啟閥門6d,直接將第2級固定化酶膜反應器圓筒內液體注入納濾裝置中,
經納濾脫鹽濃縮得到分子量在6000 8000Da的酪蛋白磷酸肽產品。 經檢測,上述2種酪蛋白磷酸肽的指標如下 分子量6000 8000Da的酪蛋白磷酸肽純度24. 21%,蛋白含量93. 37%, N含
量14. 63%、P含量0. 95% ; 分子量350 6000Da的酪蛋白磷酸肽純度49. 80%,蛋白含量91. 23%, N含 量14. 30%、P含量1. 43%。
權利要求
一種多級固定化酶膜反應裝置,其特徵在於它包含N級串聯的固定化酶膜反應器和一個納濾裝置;每一級固定化酶膜反應器以聚碸多孔材料為支撐在反應器內部形成圓筒,將反應器分隔為圓筒內和圓筒外兩個空間,以聚酯無紡布增強上述圓筒結構的強度,將截留分子量為1000~10000Da的膜裝填在上述圓筒結構的內側,膜內側表面上固定有蛋白酶;納濾裝置中設有截留分子量為100~500Da的納濾膜;第1級固定化酶膜反應器圓筒外部通過管道與第2級固定化酶膜反應器圓筒內部相連通,第2級固定化酶膜反應器圓筒外部通過管道與第3級固定化酶膜反應器圓筒內部相連通,以此類推,直至第N級固定化酶膜反應器,第N級固定化酶膜反應器圓筒外部通過管道與納濾裝置相連通,第2級至第N級固定化酶膜反應器圓筒內部分別通過管道與納濾裝置相連通,上述管道都設有閥門;第1級固定化酶膜反應器至第N級固定化酶膜反應器,其膜的截留分子量依次遞減;所述的N取2~100的整數。
2. 根據權利要求1所述的多級固定化酶膜反應裝置,其特徵在於所述截留分子量為 1000 10000Da的膜為聚醯胺複合膜、醋酸纖維膜和聚碳酸酯複合膜中的任意一種。
3. 根據權利要求1所述的多級固定化酶膜反應裝置,其特徵在於所述固定化酶膜反應 器裝有控溫夾套。
4. 根據權利要求1所述的多級固定化酶膜反應裝置,其特徵在於所述固定化酶膜反應 器圓筒內部設有攪拌槳。
5. 根據權利要求1所述的多級固定化酶膜反應裝置,其特徵在於所述蛋白酶為鹼性蛋 白酶、胰酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、複合蛋白酶中的任意一種或幾種。
6. 根據權利要求1所述的多級固定化酶膜反應裝置,其特徵在於所述N取2 5的整數。
7. 利用權利要求1所述多級固定化酶膜反應裝置製備酪蛋白磷酸肽的方法,其特徵在 於將酪蛋白溶液注入到第1級固定化酶膜反應器圓筒內部,進行酶解反應,反應結束後,通 過超濾將圓筒內部液體中分子量小於第1級膜分子量的物料轉換到圓筒外部,再通過管道 將第1級固定化酶膜反應器圓筒外部的物料注入第2級固定化酶膜反應器圓筒內部,進行 酶解反應,反應結束後,通過超濾將圓筒內部液體中分子量小於第2級膜分子量的物料轉 換到圓筒外部,以此類推,直至第N級固定化酶膜反應器,將第N級固定化酶膜反應器圓筒 外部液體通過管道注入納濾裝置中,經納濾脫鹽濃縮得到分子量小於第N級膜分子量且大 於納濾膜分子量的酪蛋白磷酸肽;同時可在第2級至第N級中的每一級固定化酶膜反應器 進行超濾後將該級固定化酶膜反應器圓筒內部的物料注入納濾裝置中,經納濾脫鹽濃縮得 到分子量小於該級之前一級膜分子量且大於該級膜分子量的酪蛋白磷酸肽,第1級固定化 酶膜反應器圓筒內部可補充酪蛋白溶液重複反應。
8. 根據權利要求7所述的製備酪蛋白磷酸肽的方法,其特徵在於所述的酪蛋白溶液, 濃度為40 150g/L, pH為6. 5 9. 5。
9. 根據權利要求7所述的製備酪蛋白磷酸肽的方法,其特徵在於每一級固定化酶膜反 應器的反應溫度為30 6(TC,攪拌速度為50 250rpm,酶解反應時間為1 3h。
10. 根據權利要求7所述的製備酪蛋白磷酸肽的方法,其特徵在於每一級固定化酶膜 反應器超濾壓力為0. 01 0. 08MPa。
全文摘要
本發明公開了一種多級固定化酶膜反應裝置,它包含N級串聯的固定化酶膜反應器和一個納濾裝置;每一級固定化酶膜反應器內部設有圓筒,將截留分子量為1000~10000Da的膜裝填在上述圓筒內側,膜內側表面上固定有蛋白酶;納濾裝置中設有截留分子量為100~500Da的納濾膜;第1級反應器圓筒外部與第2級反應器圓筒內部相連通,以此類推,第N級反應器圓筒外部與納濾裝置相連通,第2級至第N級反應器圓筒內部分別與納濾裝置相連通;第1級至第N級反應器,其膜的截留分子量依次遞減。本發明還公開了利用上述裝置製備酪蛋白磷酸肽的方法。通過本發明可以同時製備出不同分子量和品質的酪蛋白磷酸肽,簡化了生產過程,降低了生產成本。
文檔編號C12M1/40GK101768551SQ20101902602
公開日2010年7月7日 申請日期2010年2月4日 優先權日2010年2月4日
發明者應漢傑, 張磊, 徐李鵬, 柏建新, 熊健, 陳勇, 黃小權 申請人:南京工業大學;南京同凱兆業生物技術有限責任公司