β-胡蘿蔔素提取物中β-胡蘿蔔素含量的定量檢測方法
2024-03-28 04:09:05
β-胡蘿蔔素提取物中β-胡蘿蔔素含量的定量檢測方法
【專利摘要】本發明公開了一種β-胡蘿蔔素提取物中β-胡蘿蔔素含量的定量檢測方法，依次包括以下步驟：1)、將β-胡蘿蔔素標準品用石油醚-異丙醇混合液稀釋成系列濃度的標準品溶液；2)、稱取待測的β-胡蘿蔔素提取物溶於石油醚-異丙醇混合液中，作為樣品溶液；3)、將步驟1)所得的標準品溶液和步驟2)所得的樣品溶液分別進行高效液相色譜分析；從而分別獲得系列濃度的標準品溶液以及樣品溶液中β-胡蘿蔔素的吸收峰面積比；4)、建立β-胡蘿蔔素標準曲線；5)、將樣品溶液中胡蘿蔔素的峰高代入上述步驟4)所得的曲線方程中，從而最終得知待測的β-胡蘿蔔素提取物中β-胡蘿蔔素的含量。
【專利說明】β-胡蘿蔔素提取物中β-胡蘿蔔素含量的定量檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種工廠化提取物中β -胡蘿蔔素的定量檢測方法。
【背景技術】
[0002]β-胡蘿蔔素是一種天然類胡蘿蔔素，存在於包括蔬菜在內的許多植物組織和一些微生物中，是一種不飽和碳氫化合物，屬於異戊二烯構成的多烯類化合物。β_胡蘿蔔素是一種非常安全的、無任何毒副作用的營養元素，它含有豐富的胺基酸、維生素、天然保溼因子、微量元素及其它生物活性物質，具有重要的生理功能。
[0003]β-胡蘿蔔素是人體維生素A的重要來源，可在人體內轉化為VA，轉化比例是由人體VA狀態控制的。當體內VA的量足夠滿足體內代謝需要時，β_胡蘿蔔素會在體內儲存起來避免VA累積中毒現象，等到體內的VA不夠時再釋放給體內的代謝所需，並及時地轉化成VA。VA可以維持眼睛和皮膚的健康，改善夜盲症和皮膚粗糙的狀況。
[0004]胡蘿蔔素對心血管疾病、某些腫瘤、光敏性疾病、白內障有一定的預防、延緩治療和輔助作用，還能提高機體的免疫功能。此外β_胡蘿蔔素是一種抗氧化物，可清除人體自由基，保護細胞及組織，延緩衰老。因其有輕微而持續發汗的作用，可刺激皮膚的新陳代謝，增進血液循環，從而起到美容作用
[0005]β—胡蘿蔔素還可作為食用油溶性色素，其本身的顏色因濃度的差異，可涵蓋由紅色至黃色的所有色系，因此受到食品業相當熱烈的歡迎。其非常適合油性產品及蛋白質性產品的開發，如人造奶油、速食麵的調色等。而經過微膠囊處理的β—胡蘿蔔素，可轉化為水溶性色素，幾乎所有的食品都可應用。另外，β—胡蘿蔔素在飼料、化妝品等方面有重要用途。
[0006]蘿蔔硫素，又稱「萊菔硫素」，在西蘭花十字花科植物中含量較豐富，是常見抗氧化齊U，是所有天然抗癌物質裡，效力最強、效果最好的活性成分，具有獨特的抗癌功效。大量試驗證明，蘿蔔硫素對食道癌、肺癌、結腸癌、乳腺癌、肝癌及大腸癌等有很好的防治效果。它可以造成癌細胞的細胞凋亡和細胞阻滯，同時可以誘導人體內的II相解毒酶，同時抑制I型酶的產生，最終通過多種酶體系排出致癌物和自由基等有害成分，同時，該成分不會在人體內殘留，對機體無副作用，是一種新型的抗癌成分。此外蘿蔔硫素在清除肺部細菌、防治痛風等方面同樣具有多重功效。
[0007]β -胡蘿蔔素的測定方法有分光光度法、高效液相色譜法和其他方法。相比較而言，分光光度法操作步驟繁瑣、耗時、試劑消耗大，前處理周期長，易造成類胡蘿蔔素氧化，導致結果重現性差。其他一些方法由於其較大的局限性而應用不廣，近來的研究以高效液相色譜法為主。HPL C檢測具有測試結果準確的特點。
[0008]現有的高效液相色譜法測定β_胡蘿蔔素含量的方法有鄭群雄等報導的採用Kromasil C18色譜柱，流動相採用甲醇:四氫呋喃:2，6- 二叔丁基-4-甲基苯酹=90:10:0.1 (V/V)，紫外檢測器，波長為448nm，結果保留時間為21min。段淑娥等採用高效液相色譜法，利用梯度洗脫方式，以Shim-pack VP-ODS色譜柱，紫外檢測器，流動相為0.02mol/L乙酸銨:甲醇=95:5(￥八)，波長選擇23711111。上述檢測方法中，存在不但流動相中甲醇含量過高，保留時間較長，導致柱壓過高，梯度洗脫較複雜，同時浪費大量流動相。
【發明內容】
[0009]本發明要解決的技術問題是提供一種工藝簡潔、準確性高的胡蘿蔔素提取物中β_胡蘿蔔素含量的定量檢測方法。
[0010]為了解決上述技術問題，本發明提供一種β-胡蘿蔔素提取物中β-胡蘿蔔素含量的定量檢測方法，依次包括以下步驟:
[0011]I)、將β-胡蘿蔔素標準品溶解於石油醚-異丙醇混合液中，作為儲備液；將所述儲備液用石油醚-異丙醇混合液稀釋成系列濃度的標準品溶液；
[0012]2)、稱取2~3mg(較佳為2.5mg)的待測的β -胡蘿蔔素提取物溶於1.5ml的石油醚-異丙醇混合液中，作為樣品溶液；
[0013]上述步驟I)和步驟2)中的石油醚-異丙醇混合液均為:由石油醚與異丙醇按照3:1體積比混合而得；
[0014]3)、將步驟I)所得的系列濃度的標準品溶液(即，稀釋成系列濃度的標準品溶液)和步驟2)所得的樣品溶液分別進行高效液相色譜分析，檢測條件如下:
[0015]SHIMADZU ODS C18column (5 μ m, 150mmX4.6mm)色譜柱；流動相為甲醇-乙臆-二氯甲燒=50-10-40 (v/v),進樣量20微升，流速1.0mL/min,柱溫30 V，紫外檢測波長445nm，採用外標法定量；從而分別獲得系列濃度的標準品溶液以及樣品溶液中胡蘿蔔素的吸收峰面積比(吸收峰高)；
[0016]備註說明:流動相為甲醇-乙腈-二氯甲烷=50-10-40 (v/v)，即，甲醇、乙腈、二氯甲烷在流動相中的體積濃度分別為50^^10^^40% ；
[0017]流動相的用量一般為400~600ml (例如為500ml)。
[0018]4)、建立β -胡蘿蔔素標準曲線:
[0019]根據步驟3)所得結果，製備β_胡蘿蔔素系列濃度的標準品溶液的HPLC檢測譜圖，以峰高(Y)為縱坐標，以質量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸；得曲線方程；
[0020]備註說明:質量濃度⑴是指系列濃度的標準品溶液中β -胡蘿蔔素的濃度；
[0021]5)、樣品含量測定:
[0022]根據步驟3)所得結果，將樣品溶液中胡蘿蔔素的峰高代入上述步驟4)所得的曲線方程中，從而獲得樣品溶液中β_胡蘿蔔素的含量，最終得知待測的β_胡蘿蔔素提取物中β_胡蘿蔔素的含量。
[0023]作為本發明的β -胡蘿蔔素提取物中β -胡蘿蔔素含量的定量檢測方法的改進:
[0024]系列濃度的標準品溶液中β -胡蘿蔔素的濃度為50.0~0.33 μ g/ml。具體為:50.0, 25.0,12.5,6.25, 3.10,1.50,0.75,0.33 μ g/mL。
[0025]作為本發明的β_胡蘿蔔素提取物中β_胡蘿蔔素含量的定量檢測方法的進一步改進:
[0026]所述曲線方程為Y = 5.1144Χ- 0.2307 (r = 0.9999)，縱坐標Y代表峰高，橫坐標X代表質量濃度μ g/ml。
[0027]為了驗證本發明的方法的正確性和實用性，發明人進行了如下的試驗:[0028]1、精密度試驗:
[0029]分別取3種濃度(0.75,3.1,6.25 μ g/mL，代表標準曲線濃度範圍內的高、中、低濃度)的β-胡蘿蔔素標準溶液，每種濃度分別在同一條件下(如步驟3)所述的高效液相色譜分析檢測條件)連續測定3次，記錄β -胡蘿蔔素的峰高，計算RSD值(即，相對標準
差)O
[0030]當RSD值符合低於3%要求時，能證明本檢測方法變異較小。
[0031]2、穩定性試驗:
[0032]精密吸取同一標準品溶液(將胡蘿蔔素標準品溶解於石油醚-異丙醇混合液，然後保存於棕色瓶)，分別於配製後0、2、4h測定(如步驟3)所述的高效液相色譜分析檢測條件)，分別進樣20 μ L，每個時間段進樣3次，計算RSD值。
[0033]當RSD值符合低於3%要求時，能證明本檢測方法在規定保存條件下較穩定，滿足檢測要求。
[0034]3、重現性試驗:
[0035]對同一批號或來源的胡蘿蔔素樣品3份進行測定，記錄色譜峰高，計算RSD值，觀察重現性。
[0036]當RSD值符合低於3%要求時，能證明本檢測方法重現性較好。
[0037]4、回收率試驗:
[0038]準確製備已知含量的樣品適量，精密稱定，分別加入標準品適量，進樣5次，測定β_胡蘿蔔素的峰高，計算平均回收率及RSD。當回收率高於95%以上，證明本檢測方法回收率較高，滿足檢測要求。
[0039]相對於現有技術而言，本發明關於流動相的發明點主要包括了以下幾點:
[0040]1、流動相相對較簡單，而且流動相中沒有鹽類成分。
[0041]2、流動相中增加了洗脫能力較強的二氯甲烷。
[0042]3、甲醇含量相對較低。
[0043]經上述實驗證明，本發明具有如下技術優勢:
[0044]1、避免鹽類在色譜柱中沉積，延長色譜柱壽命。
[0045]2、蘿蔔硫素保留時間大大縮短，節約流動相。
[0046]3、柱壓降低，避免泵在高壓下運行，降低損耗。
[0047]綜上所述，本發明的定量檢測方法針對現有技術存在的缺陷進行了改進:流動相去除鹽類，同時甲醇含量降低，由於胡蘿蔔素非極性較強，難以洗脫，本發明採用了向流動相中加入一定比例的二氯甲烷增強洗脫能力。保留時間較短，樣品分析較快，節約流動相，而且柱壓較低，對洗脫損傷較小。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0048]下面結合附圖對本發明的【具體實施方式】作進一步詳細說明。
[0049]圖1?圖4為β -胡蘿蔔素的色譜圖；
[0050]具體如下:
[0051]圖1:標準液色譜圖25 μ g/mL ；
[0052]圖2:標準液色譜圖3.1 μ g/mL ；[0053]圖3:標準液色譜圖0.75 μ g/mL ；
[0054]圖4:粗提物色譜圖；
[0055]圖1?圖4中，峰1:β-胡蘿蔔素。
【具體實施方式】
[0056]以下實施例中的石油醚-異丙醇混合液均為:由石油醚與異丙醇按照3:1體積比混合而得。
[0057]實施例1、一種β -胡蘿蔔素提取物中β -胡蘿蔔素的檢測方法，依次進行以下步驟:
[0058]I)、準確稱取β_胡蘿蔔素標準品溶解於石油醚-異丙醇混合液(體積比3:1)中，作為儲備液，利用石油醚-異丙醇混合液將儲備液稀釋為β-胡蘿蔔素濃度分別50.0，25.0,12.5,6.25, 3.10,1.50,0.75,0.33 μ g/mL的系列標準液(即，系列濃度的標準品溶液)；
[0059]2)、稱取2.5mg的作為待測樣品的β -胡蘿蔔素提取物溶於1.5ml石油醚-異丙醇混合液(體積比3:1)中作為樣品溶液。
[0060]共設置5種待測樣品，分別為如表I所述的A、B、C、D、E。
[0061]3)、將步驟I)所得的標準品溶液和步驟2)所得的樣品溶液分別進行高效液相色譜分析，檢測條件如下:
[0062]SHIMADZU ODS C18column (5 μ m, I5OmmX 4.6mm)色譜柱；流動相為甲醇-乙臆-二氯甲燒=50-10-40 (v/v),流速1.0mL/min,柱溫3(TC,檢測波長445nm,採用外標法定量；從而分別獲得標準品以及樣品中胡蘿蔔素的吸收峰高；
[0063]標準品溶液/樣品溶液的進樣量為20 μ L ;流動相的用量為500ml。
[0064]備註說明:圖1?圖3中選擇了線性範圍內的高、中、低濃度作為代表圖譜。
[0065]圖4對應的是平均濃度(表2中的5種待測樣品)
[0066]備註說明:
[0067]濃度為50.0,25.0,12.5,6.25,3.10，1.50，0.75，0.33 μ g/mL 的標準品溶液對應的峰高分別為255.54,128.5,62.44,30.1,15.6,8.2,4.1,2.2，以峰高(Y)為縱坐標，以質量濃度(X，單位為yg/mL)為橫坐標進行線性回歸。結果顯示β_胡蘿蔔素標準曲線方程為Y = 5.1144Χ- 0.2307 (r = 0.9999)，由此說明在0.33-50 μ g/mL範圍內線性關係較好。
[0068]備註說明:常規的胡蘿蔔素提取物中胡蘿蔔素的含量一般為0.01-1%，因此，按照本發明所述的「將2?3mg的作為待測品的β-胡蘿蔔素提取物溶於1.5ml石油醚-異丙醇混合液」，能滿足所得樣品中β -胡蘿蔔素的濃度落入「0.33-50 μ g/mL」這個範圍值內。
[0069]4)、樣品含量測定:
[0070]將樣品溶液測試所得的峰高代入上述曲線方程中，從而獲得樣品溶液中β -胡蘿蔔素的含量，最終得知待測的β_胡蘿蔔素提取物中β_胡蘿蔔素的含量。
[0071]具體如下:
[0072]A 的峰高為:2.398，
[0073]B 的峰高為:2.484，[0074]C 的峰高為:2.305，
[0075]D 的峰高為:2.340，
[0076]E 的峰高為 '2.429，
[0077]所得的5種樣品溶液中β -胡蘿蔔素的濃度如表2所示。
[0078]然後經過如下的換算公式:含量=Ol.5/2500 ;最終所得的5種樣品中β -胡蘿蔔素的含量如表1所述。C代表樣品溶液中β_胡蘿蔔素的濃度，單位為yg/mL。
[0079]表1粗提物中β -胡蘿蔔素含量測定結果(η = 5)
[0080]
【權利要求】
1.β-胡蘿蔔素提取物中β-胡蘿蔔素含量的定量檢測方法，其特徵是依次包括以下步驟: 1)、將β-胡蘿蔔素標準品溶解於石油醚-異丙醇混合液中，作為儲備液；將所述儲備液用石油醚-異丙醇混合液稀釋成系列濃度的標準品溶液； 2)、稱取2?3mg的待測的β-胡蘿蔔素提取物溶於1.5ml的石油醚-異丙醇混合液中，作為樣品溶液； 上述步驟I)和步驟2)中的石油醚-異丙醇混合液均為:由石油醚與異丙醇按照3:1體積比混合而得； 3)、將步驟I)所得的系列濃度的標準品溶液和步驟2)所得的樣品溶液分別進行高效液相色譜分析，檢測條件如下: SHIMADZU ODS C18column (5 μ m, 150mmX 4.6mm)色譜柱；流動相為甲醇-乙臆-二氯甲烷=50-10-40 (v/v)，進樣量20微升，流速1.0mL/min,柱溫30°C，紫外檢測波長445nm，採用外標法定量；從而分別獲得系列濃度的標準品溶液以及樣品溶液中β_胡蘿蔔素的吸收峰面積比； 4)、建立β-胡蘿蔔素標準曲線: 根據步驟3)所得結果，製備β_胡蘿蔔素系列濃度的標準品溶液的HPLC檢測譜圖，以峰高(Y)為縱坐標，以質量濃度(X)為橫坐標進行線性回歸；得曲線方程； 5)、樣品含量測定: 根據步驟3)所得結果，將樣品溶液中胡蘿蔔素的峰高代入上述步驟4)所得的曲線方程中，從而獲得樣品溶液中胡蘿蔔素的含量，最終得知待測的胡蘿蔔素提取物中β_胡蘿蔔素的含量。
2.根據權利要求1所述的β-胡蘿蔔素提取物中β -胡蘿蔔素含量的定量檢測方法，其特徵是: 所述系列濃度的標準品溶液中β -胡蘿蔔素的濃度為50.0?0.33 μ g/ml。
3.根據權利要求1或2所述的β-胡蘿蔔素提取物中β-胡蘿蔔素含量的定量檢測方法，其特徵是: 所述曲線方程為Y = 5.1144Χ - 0.2307 (r = 0.9999)，縱坐標Y代表峰高，橫坐標X代表質量濃度μ g/ml。
【文檔編號】G01N30/88GK103995079SQ201410235214
【公開日】2014年8月20日 申請日期:2014年5月29日 優先權日:2014年5月29日
【發明者】鄧同樂, 葛建, 萬旺軍, 肖桂鳳, 許健, 林芳 申請人:中國計量學院