一種半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法與流程
2024-03-27 19:12:05
本發明涉及一種植物組織培養技術領域，尤其涉及一種半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法。
背景技術：
半楓荷(Semiliquidambar cathayensis H.T.Chang)為金縷梅科半楓荷屬植物,為1962年發表的新屬半楓荷屬的模式種,我國特有種。該種在學術研究、中醫藥用以及園林應用等很多方面都具有極高的價值。但由於不合理的開發利用,其資源破壞嚴重。半楓荷在1987年國家環境保護局等頒布的《中國珍稀瀕危保護植物名錄(第一冊)》中,被列為國家三級重點級保護植物[2]；在1992年傅立國主編的的《中國植物紅皮書-稀有瀕危植物》中被列為稀有種[3]；在國務院1999年8月4日頒布的《國家重點保護野生植物名錄(第一批)》中提升為國家Ⅱ級保護植物。2003年在汪松、解焱主編的《中國物種紅色名錄》中,專家根據相關資料,推測半楓荷在過去3個世代內致危因素沒有停止,種群至少減少30％,因此將半楓荷列入易危等級,在未來一段時間內其種群面臨絕滅的機率較高[5]。
半楓荷藥用價值：半楓荷是一種珍貴的藥用植物，根、枝、樹皮都可入藥，能活血通絡，祛風除溼，可以治療風溼性關節炎，腰肌勞損，半身不遂，跌打瘀積、腫痛、產後風癱，外傷常用於止血，是產區群眾常用的中藥。目前，半楓荷作為重要的中藥已得到了廣泛的重視和開發。如半楓荷散、中藥巴布劑、半楓荷類注射液、苗嶺骨力膠囊等。
藥用半楓荷種類鑑別：在我國不同地方，叫「半楓荷」並作藥用的植物共有6科8屬15種，如五加科的楓荷桂(Dendvopanax dentigerus)，梧桐科的翻白葉樹(Pterospermum heterophyllum)，以及樟科的檫樹(Sassafras tzumu)，效用和金縷梅科的半楓荷相同，都是用根、莖或樹皮入藥，但金縷梅科的半楓荷(Semiliquidambar cathayensis H.T.Chang)功效最佳[9-10]。
2.半楓荷現有組織培養技術情況
在半楓荷組織培養方面，陳世紅等[11]採用單因子比較和均勻設計法，分別研究了影響半楓荷愈傷組織誘導和生長的各種因素。試驗結果表明：葉片愈傷組織誘導率高於莖段；愈傷組織誘導的最適基本培養基為MS，生長的最適培養基為：MS+6-BA2.0mg/L+NNA1.0mg/L+蔗糖3％，暗培養對愈傷組織生長極為有利，在生根培養基上誘導生根，但多次試驗均未見不定根發生。
李國楨等[12]採用均勻設計和單因子比較法，考察不同基本培養基，光照條件，蔗糖濃度，以及不同激素種類、濃度和組合對半楓荷愈傷組織誘導、繼代培養和再分化的影響。實驗結果表明：葉片愈傷組織誘導率高於莖段。愈傷組織誘導的最適基本培養基為MS，生長的最適培養基為：MS+6-BA1.0mg/L+NAA1.0mg/L+蔗糖3％。黑暗培養對愈傷組織生長極為有利。但生根培養基上誘導生根，但經多次試驗均未見不定根發生。
胡剛等瀕危植物半楓荷Semiliquidambar cathayensis組織培養快繁技術研究，以當年生半楓荷帶腋芽的莖段和幼葉作為外植體，開展組織培養。研究結果表明：半楓荷葉片在初代培養基：MS+BA2.0mg/L+NNA0.5mg/L上，愈傷組織誘導率為92％，芽誘導率為16.7％，腋芽在初代培養基：MS+BA1.0mg/L+NNA0.1mg/L上，腋芽誘導率為58％，莖段能直接誘導出芽是半楓荷快繁的主要外植體。新生芽在繼代增殖培養基：MS+BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L上，芽增殖係數為3.93，增殖培養基：MS+BA(1～0.5mg)/L+NAA(0.01～0.05mg)/L，較好叢生芽生根培養基以1/2WPM+NAA2mg/L+活性碳0.2％為宜。生根率可達到90％以上。松林腐殖土+珍珠巖(4：1)比較適合半楓荷的生長移栽成活率100％，苗木長勢好，葉綠色，可提供半楓荷優質種苗。
3.現有組織培養技術的不足
半楓荷對生態環境的要求比較苛刻，其自然繁殖率較低，加上人們長期的過量採挖，野生資源已經極度枯竭。面對這樣嚴峻的形式，可見對半楓荷的人工繁殖問題的研究是極其的重要。植物組織無菌培養方法是尋求解決半楓荷資源枯竭、保護其優良品種的有效途徑。近年來，人們對半楓荷的藥用成分及價值的研究日益增多，目前對半楓荷從種子萌發，到增殖壯苗生根的完整流程的無菌組織培養研究還未見報導，組培無菌培養快速繁殖方面多以莖段和葉片為外植體誘導。
技術實現要素：
本發明的目的是提供一種快速的、增值率高、成活率高的半楓荷的完整的組織培養方法。
本發明的技術方案為：一種半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法，包括以下步驟：
步驟1、無菌材料的建立：取半楓荷蒴果晾曬後取種子進行無菌處理；
步驟2、種子萌發培養：將步驟1處理後的種子消毒後接種於培養基中培養，得到萌發的種子；
步驟3、誘導愈傷組織：將步驟2處理後的萌發的種子的下胚軸作為誘導材料，剪切成莖段後，接種於培養基中，培養得到愈傷組織；
步驟4、愈傷組織增殖：將步驟3得到的愈傷組織轉接到培養基中，進行增殖培養；
步驟5、愈傷組織分化，將步驟4增殖後的愈傷組織切成塊狀物轉入培養基培養，得到具有真葉的組織；
步驟6、叢生芽誘導，將步驟5中的真葉剪下後接種到培養基中，得到分化的叢生芽；
步驟7、將步驟6得到的分化的叢生芽剪去基部後，接種於培養基中，得到壯苗；
步驟8：將步驟7得到的壯苗剪去基部後，接種於培養基中，進行生根培養。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的步驟2中的培養基包括以下組分：改良MS培養基、GA30.2～0.8mg/L、VB21.0～5.0mg/L、白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；
所述的步驟2的培養溫度為25～27℃，光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的步驟3中的培養基包括以下組分：改良MS培養基、6-BA0.5mg/L、2,4-D0.2～0.5mg/L、VB21.0～6.0mg/L、白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；
所述的步驟3的培養溫度為25～27℃，光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的步驟4中的培養基包括以下組分：改良MS培養基、6-BA0.3～0.5mg/L、NAA0.05～0.4mg/L、VB21.0～3.0mg/L、白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；
所述的步驟4的培養溫度為25～27℃，光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的步驟5中的培養基包括以下組分：改良MS培養基、6-BA0.03～0.08mg/L、NAA0.05～0.3mg/L、土白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；
所述的步驟5的培養溫度為24～28℃、光照強度為2000～3000lx、光照時間為10小時/天。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的步驟6中的培養基包括以下組分：改良MS培養基、6-BA0.5～0.8mg/L、NAA0.1～0.3mg/L、VB2 1.0～5.0mg/L、白糖30g/L、瓊脂3.6g/L；
所述的步驟6的光照強度為1500～2000lx，每天光照培養12小時。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的步驟7中的培養基包括以下組分：改良MS培養基、NAA1.0～2.0mg/L、6-BA0.1～1.0mg/L、VB22.0mg/L、GA31.0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂3.6g/L；
所述的步驟7的光照強度為2000～3000lx，每天光照培養12小時。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的步驟8中的培養基包括以下組分：1/2改良MS培養基、NAA1.0mg/L、IBA1.0mg/L、GA32.0mg/L、蔗糖30g/L、瓊脂3.6g/L；
所述的步驟8的光照強度為2000～3000lx，光照培養12小時。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的改良MS培養基中NH4NO3含量為340mg/L、KNO3含量為1318mg/L。
在上述的半楓荷種子萌發途徑的組培快繁方法中，所述的1/2改良MS培養基中包含：
NH4NO3 170mg/L；
KNO3 659mg/L；
MgSO4·7H2O 185mg/L；
KH2PO4 85mg/L；
CaCl2·2H2O 220mg/L；
MnSO4·4H2O 22.3mg/L；
ZnSO4·7H2O 8.6mg/L；
H3BO3 6.2mg/L；
KI 0.83mg/L；
Na2MoO4·2H2O 0.25mg/L；
CuSO4·5H2O 0.025mg/L；
CoCl2·6H2O 0.025mg/L；
FeSO4·7H2O 27.8mg/L；
Na2-EDTA·2H2O 37.3mg/L；
甘氨酸2.0mg/L；
鹽酸硫胺素0.1mg/L；
鹽酸吡哆醇0.5mg/L；
IV B煙酸0.5mg/L；
肌醇100mg/L。
本發明的有益效果如下：
本發明在以種子為外植體，對半楓荷進行研究的基礎上，通過對種子苗的大量增殖形成的叢生芽，使叢生芽在不同因素影響下進行壯苗生根，以期增強試管苗生命活力，以縮短適應外界環境時間從而提高成活率。
本發明的完整的技術路線為：以種子為外植體誘導愈傷組織愈傷組織增殖、叢生芽誘導、最後通過壯苗與生根培養而建立起半楓荷完整的快繁體系。
本發明的誘導率是用種子萌發為種苗的，誘導率達到93％。誘導種苗形成直徑大小在0.8～1.6cm的淺綠色愈傷組織，經愈傷組織增殖培養基使其增殖係數達到10.8。誘導叢生芽並使其增值係數達到7.9。苗高3.0～4.0cm，壯苗率100％(壯苗率(％)＝(壯苗株數/接種株數)x100％)[14]。生根率為94.6％。利用此方法可以快速地培育出大量的半楓荷組培苗，從而有效地保護和繁殖該物種，滿足市場對半楓荷的需求。
附圖說明
圖1和2為實施例1的種子萌發培養結果；
圖3和4為實施例1的愈傷組織誘導與增值結果；
圖5和6為實施例1的愈傷組織分化結果；
圖7和8為實施例1的叢生芽誘導結果；
圖9、10和11為實施例1的壯苗培養結果；
圖12、13、14和15為實施例1的生根培養結果。
具體實施方式
下面結合具體實施方式，對本發明的技術方案作進一步的詳細說明，但不構成對本發明的任何限制。
實施例1
一種半楓荷種子萌發途徑的組織培養
(1)半楓荷種子的萌發培養：將取於廣西防城港那勤的成熟的野生半楓荷蒴果，將成熟的半楓荷蒴果，晾曬到九成幹後取出種子，作為外植體原材料；將選取好的種子用洗潔精清洗，置於超淨工作檯上，再用0.1％的次氯酸鈉原液浸泡5～7min，然後用無菌水衝洗5～8次；將外植體消毒後接種於無菌誘導培養基中，在溫度為25～27℃、光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天的條件下培養，15天種子萌發率達到77％，30天後萌發率達到93％。見附圖1和圖2。
種子萌發培養基為：
B1：改良MS+GA30.2mg/L+VB21.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B2：改良MS+GA30.5mg/L+VB21.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B3：改良MS+GA30.8mg/L+VB22.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B4：改良MS+GA30.8mg/L+VB23.5mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
(2)半楓荷愈傷組織的誘導與增值：選取半楓荷種子萌發後的下胚軸作為誘導材料，剪切成1.5～2.0cm的莖段後，接種於無菌誘導培養基中在溫度為25～27℃、光照強度為1500～2000lx、光照時間為10小時/天的條件下培養20～30天，形成直徑大小在0.8～1.6cm的淺綠色的愈傷組織；將生長良好的愈傷組織轉接入增殖培養基中，進行增殖培養培養的環境條件為：溫度25～27℃、光照1500～2000lx、光照時間10小時/天。45天增殖係數達到10.8，愈傷組織顏色深綠。見附圖3和4。
誘導愈傷組織培養成分：
B5：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB21.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B6：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB26.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B7：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+VB21.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B8：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.5mg/L+VB26.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B9：改良MS+6-BA0.5mg/L+2,4-D0.2mg/L+VB23.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
誘導愈傷組織增值培養基成分：
B10：改良MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.05mg/L+VB22.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B11：改良MS+6-BA0.3mg/L+NAA0.1mg/L+VB23.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B12：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+VB21.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B13：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.4mg/L+VB22.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
(3)半楓荷愈傷組織的分化。將愈傷組織切成1.0cm2大小的塊狀物轉入分化培養基中，在溫度為24～28℃、光照強度為2000～3000lx、光照時間為10小時/天的條件下，培養45～60天，愈傷組織先是長出根部，在根長到2.0cm左右開始長出芽部分，45天後芽高約1.5cm，真葉2-4片；見附圖5和6。
B14：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+VB22.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B15：改良MS+6-BA0.5mg/L+NAA0.3mg/L+VB23.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B16：改良MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.1mg/L+VB24.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B17：改良MS+6-BA0.8mg/L+NAA0.3mg/L+VB25.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
(4)半楓荷叢生芽誘導。種子萌發30天後，一般已長出2～4片真葉，即可將其帶節的莖剪下接到誘導叢生芽增殖的培養基中，並置於光照強度為1500～2000lx下培養，每天光照培養12小時；培養30-40天後植株高約3.0～5.0cm，增殖係數為2.8。見附圖7和圖8。
叢生芽誘導培養基成分：
B18：改良MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.1mg/L+VB22.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B19：改良MS+6-BA0.05mg/L+NAA0.3mg/L+VB2 25mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B20：改良MS+6-BA0.08mg/L+NAA0.1mg/L+VB2 1.0mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B21：改良MS+6-BA0.08mg/L+NAA0.3mg/L+VB23.5mg/L+白糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
(5)半楓荷壯苗培養：將經分化的叢生芽剪去基部，接種於下面壯苗培養基中：並置於光照強度為2000～3000lx下培養，每天光照培養12小時；培養30-40天後植株高約3.0～4.0cm，根數4～6條，根長2～3cm。見附圖9、圖10、圖11。
壯苗培養基：
B22：改良MS+NAA1.0mg/L+6-BA0.5mg/L+VB22.0mg/L+GA31.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B23：改良MS+NAA1.5mg/L+6-BA0.1mg/L+VB22.0mg/L+GA31.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B24：改良MS+NAA2.0mg/L+6-BA0.1mg/L+VB22.0mg/L+GA31.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
B25：改良MS+NAA2.0mg/L+6-BA1.0mg/L+VB22.0mg/L+GA31.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂3.6g/L；
(6)半楓荷生根培養：將經壯苗後的植株剪去基部接種於生根培養基中：並置於光照強度為2000～3000lx下培養，每天光照培養12小時；培養30～40天後植株高約3.0～4.0cm，80％出根，根數4～6條，根長2～3cm。見附圖12、圖13、圖14、圖15。
生根培養基成分：
B26：1/2改良MS+NAA1.0mg/L+IBA1.0mg/L+GA32.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L；
B27：1/2改良MS+NAA2.0mg/L+IBA1.0mg/L+GA32.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L；
B28：1/2改良MS+NAA1.0mg/L+IBA2.0mg/L+GA32.0mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L；
B29：1/2改良MS+NAA2.0mg/L+IBA2.0mg/L+GA32.5mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂4g/L；
表1、表2和表3示出了改良MS、1/2改良MS、MS的組分。
表1改良MS
表2 1/2改良MS
表3MS
以上所述的僅為本發明的較佳實施例，凡在本發明的精神和原則範圍內所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。