水稻冷誘導啟動子p-LTT7及其應用的製作方法
2024-03-01 21:19:15
專利名稱：水稻冷誘導啟動子p-LTT7及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種水稻冷誘導啟動子p-LTT7及其應用。
背景技術：
水稻是重要的糧食作物，冷害是影響水稻生產的重要限制因子之一。芽期、苗期和 孕穗開花期遭遇冷害，將導致水稻幼苗生長遲緩、分櫱減少，最終造成水稻產量的大幅度降 低，因此迫切需要發掘水稻耐冷種質資源，培育出水稻耐冷品種。 普通野生稻是亞洲栽培稻的祖先種，野生稻在演化成栽培稻的過程中，經過自然 選擇和人工選擇，基因多樣性降低，等位基因數減少。據統計，栽培稻的等位基因數約為 野生禾舀的60% (S皿C Q， Wang X K， Li Z C， Yoshimura A. Comparison of thegenetic diversity of common wild rice(0ryza rufipogon Griff.)and cultivatedrice(0. sativa L.)using RFLP markers. Theor A卯l Genet， 2001， 102 :157-162)，從而導致當前 水稻品種選育所面臨的遺傳瓶頸(genetic bottleneck)問題。因此從水稻的近緣野生種 (普通野生稻Oryza rufipogon Griff.)基因組中發掘和利用在栽培稻中已丟失或削弱的 優異基因，並把它們應用於水稻育種生產中具有十分重要的理論意義和實踐價值，也是解 決當前水稻育種難題的一條行之有效的途徑。 江西東鄉普通野生稻是目前世界上分布生境最北的野生稻之一。具有極強的耐冷 性，它的地下莖能耐-12.8。C的低溫並可安全過冬(Chen D Z， Xiao Y Q， Zhao S X， Xiong H J， Pi Y H， Luo L J. Studies on cold tolerance of seedling and headingstage in Dongxiang wild rice. Acta Agric Jiangxi，1996，8 :1-6 (in Chinese) ;Chen D Z， Xiao Y Q， Zhao S X， Pi Y H， Xiong H J， Luo L J. Genetic study on thecold tolerance of Dongxiang wild rice at the seedling stage. Acta Agric Jiangxi，1997，9 :56-59(in Chinese))，而當前栽培稻無一具此抗性，因此江西東鄉普通野生稻是水稻耐冷性研究的理 想、禾才茅鬥。Liu et al. (Liu F X，Sun C Q，Tan L B，Li DJ，Fu Y C，Wang X K. Identification and mapping of quantitative trait locicontrolling cold_tolerance of Chinese common wild rice(0. rufipogon Griff. )at booting to flowering stages. Chinese Science Bulletin, 2003， 48 :2068-2071)報導了 3個來自東鄉野生稻的QTL能提高栽培稻 受體親本(桂朝2號)的孕穗開花期耐冷性，進一步證實了從東鄉野生稻中發掘耐冷性基 因的可行性。 我國野生稻資源豐富，從野生稻中發掘、定位、克隆耐冷相關基因及其冷誘導啟動 子，將對水稻生產具有重要意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種水稻冷誘導啟動子p-LTT7及其應用。 本發明提供的水稻冷誘導啟動子，其名稱為p-LTT7，來源於稻屬普通野生稻
(0. rufipogon Griff.)。
本發明提供的DNA片段(啟動子)，為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子
1)序列表的序列1自5'末端第75至2036位核苷酸所示的DNA分子；
2)序列表中序列1所示的DNA分子； 3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；
4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90X以上同源性，且具有啟動子功能的 DNA分子。 上述嚴格條件可為在O. IXSSPE(或O. 1XSSC)、0. 1% SDS的溶液中，65"條件下 雜交並洗膜。 序列表中序列1所示的DNA由2036個核苷酸組成，含有ABRE、 DRE和CBF作用元 件，能特異性地對冷脅迫、乾旱和ABA等逆境起應答反應。 含有所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的 保護範圍。 用於構建含有所述啟動子的重組載體的出發載體可為pCAMBIA1381、 pBI121、 pBinl9、pCAMBIA2301或pCAMBIA1301-UbiN等。所述重組載體可為在pCambia1381的多克 隆位點插入所述DNA片段得到重組質粒。所述重組載體具體可為將序列表中序列1自5' 末端第75至2036位核苷酸所示的DNA分子插入pCambia1381的Smal和Pstl酶切識別位 點間得到的重組質粒。 擴增所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對也屬於本發明的保護範圍。
所述DNA片段可應用於啟動目的基因表達。所述目的基因表達可為低溫誘導表達 和/或組織特異表達。 所述組織特異表達中的組織具體可為水稻芽、水稻柱頭和水稻花葯等組織中的至 少一種。所述目的基因具體可為GUS基因。 所述DNA片段可應用於培育耐低溫的轉基因植物。如培育耐低溫的轉基因水稻。
本發明還保護一種培育轉基因植物的方法，是在目的植物中用所述DNA片段啟動 目的基因的表達，得到所述目的基因表達受低溫誘導的轉基因植物。所述目的植物可為水 稻，如水稻品種日本晴。所述低溫可為0-l(TC，如4t:。所述目的基因具體可為GUS基因； 所述方法具體可為將所述重組載體導入所述目的植物，從而在所述目的植物中用所述DNA 片段啟動GUS基因的表達。 本發明啟動子的發現和其功能的闡明，將對水稻耐冷分子機制的研究，水稻耐冷
品種的選育具有重要的理論及實際意義。本發明在農業領域將具有廣闊的應用和市場前
旦 豕。
圖1為基因在低溫處理前(0h)和低溫處理1、3、6、12和24小時後的表達譜。
圖2為以IL112基因組DNA為模板，在引物T7GUS引導下的PCR擴增產物，1為 Markerlll (所用Marker為天根生化科技有限公司的Markerlll，貨號MD103_01) ， 2為PCR產物。 圖3A，B為正常條件下p-LTT7轉基因水稻的GUS組織染色結果；圖3C為4。C低溫 處理3小時後p-LTT7轉基因水稻的GUS組織染色結果。
具體實施例方式
以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗 方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自 常規生化試劑商店購買得到的。所用引物合成及測序工作均由北京奧科生物科技有限責任 公司完成。 耐冷系IL112水稻由中國農業大學孫傳清實驗室構建的BQ&群體中所獲得的一 個系。 pCambia1381:GenBank號AF234302。
日本晴國家種質資源庫；庫編號I1A13071。
實施例1、水稻冷誘導啟動子p-LTT7的發現
—、冷誘導基因的發現 首先以耐冷系IL112水稻及對照親本桂朝2號水稻為材料進行晶片(晶片為 Affimetrix公司的水稻全基因組晶片(GeneChip Rice Genome Array)，貨號900599)
雜交，並在晶片數據分析的基礎上，結合比較基因組學分析，篩選耐冷相關基因，經過基因 組比較、耐冷相關性分析，最後獲得耐冷基因LTT7，冷處理條件下，基因的表達量明顯增加
(圖l)，是冷誘導基因。 二、冷誘導啟動子p-LTT7的發現 利用primer3引物設計軟體設計引物，並在引物兩端分別引入限制性內切酶Pstl
和Smal識別位點及保護鹼基。引物序列如下 T7GUSF:5' -TCCCCCGGGgttcctggggcagaatgtta-3'; T7GUSR : 5 ， -AACTGCAG gcctggctgtggagtgtagt-3，。 T7GUSF中，帶下劃線鹼基為限制性內切酶Smal識別位點及保護鹼基；T7GUSR中， 帶下劃線鹼基為限制性內切酶Pstl的識別位點及保護鹼基。 以耐冷系IL112水稻的基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR反應條件為先 94°C 5min ;然後94°C 30sec， 58°C 45sec， 72°C 2min，共30個循環；最後72°C 10min，獲得目 的產物。反應結束後，對擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示。將 PCR產物進行測序，測序結果表明，PCR產物具有序列表的序列1自5'末端第75至2036位 核苷酸所示的DNA片段，將序列表的序列1自5'末端第75至2036位核苷酸所示的DNA片 段命名為P-LTT7(冷誘導啟動子)。 用分析軟體(http:〃www. dna. affrc. go. jp/PLACE)對啟動子進行分析，發現在 其區域內含有與逆境脅迫相關的順式作用元件ABRE、 DRE和CBF。
實施例2、 p-LTT7轉基因水稻的獲得及其鑑定
—、 p-LTT7植物表達載體的構建 1、合成序列表的序列1所示的DNA，以合成的DNA為模板，用特異性引物對 T7GUS (T7GUSF/T7GUSR)進行PCR擴增，反應結束後，對PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電 泳檢測，回收並純化1979bp的DNA片段(p-LTT7)(所用回收試劑盒為天根生化科技有限公 司的DNA產物純化試劑盒，貨號DP204-02)。 2、用限制性內切酶Smal和Pstl酶切步驟1回收的PCR產物。
3、用限制性內切酶Smal和Pstl酶切植物表達載體pCambia1381，回收載體骨架。 4、將步驟2的酶切產物與步驟3的載體骨架連接，得到重組質粒。 5、將重組質粒進行測序，測序結果表明，得到了重組質粒pCambial381-pLTT7(在
pCambia1381的Smal和Pstl酶切位點之間插入序列表的序列1自5'末端第75至2036位
核苷酸所示的DNA片段)。 二、 p-LTT7轉基因水稻的獲得 將pCambial381-pLTT7用基因槍法轉化日本晴的成熟胚愈傷組織，用含50mg/L潮 黴素的NB培養基進行2輪篩選，每輪篩選20-30天，經預分化、分化得到陽性植株。將陽性 植株進行PCR鑑定，結果表明，得到了 T。代轉基因植株。 將pCambia1381用基因槍法轉化日本晴的成熟胚愈傷組織，用含50mg/L潮黴素的 NB培養基進行2輪篩選，每輪篩選20-30天，經預分化、分化得到T。代轉空載體對照植株。
三、轉基因水稻的組織表達特異性分析 對正常培養的的T。代轉基因植株和T。代轉空載體對照植株的幼芽(生長7天的 幼芽)、根(生長7天的根)、葉(孕穗期)、葉鞘(孕穗期)、莖(孕穗期)、柱頭(生殖期) 和花葯(生殖期)進行GUS組織染色。結果發現轉基因植株的GUS基因在生長7天的幼 芽、生殖期的柱頭和花葯中具有較高的表達活性，而在其他組織如葉、根、莖和葉鞘中的表 達量極低，甚至不表達(圖3A，B);轉空載體對照植株其相應組織均不具有GUS表達活性。
四、啟動子的低溫誘導活性驗證 將T。代植株進行自交，得到T。代植株的種子(L代)。 將T。代植株的種子(轉基因植株和轉空載體對照植株)在常溫下培養，待芽長至 5mm左右時，進行4t:低溫處理3小時，隨後同時進行GUS組織染色。結果發現轉基因植株 低溫處理後的幼芽中GUS表達活性增強，顏色較正常條件下的更深(圖3C);而空載對照在 低溫處理前後均沒有GUS表達活性。 實施例2的實驗重複進行三次，都得到的同樣的結果。
權利要求
DNA片段，為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表的序列1自5』末端第75至2036位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。
2. 含有權利要求1所述DNA片段的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
3. 如權利要求2所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為在pCambia1381的多 克隆位點插入權利要求1所述DNA片段得到重組質粒。
4. 如權利要求3所述的重組載體，其特徵在於所述重組載體為將序列表的序列1自 5'末端第75至2036位核苷酸所示DNA片段插入pCambia1381的Smal和Pstl酶切識別位 點間得到的重組質粒。
5. 擴增權利要求1所述DNA片段的全長或其任意片段的引物對。
6. 權利要求1所述DNA片段在啟動目的基因表達中的應用。
7. 如權利要求1所述的應用，其特徵在於所述目的基因表達為低溫誘導表達和/或 組織特異表達；所述組織特異表達中的組織為水稻芽、水稻柱頭和水稻花葯中的至少一種。
8. 權利要求1所述DNA片段在培育耐低溫轉基因植物中的應用。
9. 一種培育轉基因植物的方法，是在目的植物中用權利要求1所述DNA片段啟動目的 基因的表達，得到所述目的基因表達受低溫誘導的轉基因植物。
10. 如權利要求9所述的方法，其特徵在於所述目的植物為水稻，優選水稻品種日本 晴；所述低溫為0-l(TC，優選4t:;所述目的基因為GUS基因；所述方法為將權利要求4所 述重組載體導入所述目的植物，從而在所述目的植物中用權利要求1所述DNA片段啟動GUS 基因的表達。
全文摘要
本發明公開了一個水稻冷誘導啟動子p-LTT7及其應用。該啟動子為如下1)或2)或3)或4)的DNA分子1)序列表的序列1自5』末端第75至2036位核苷酸所示的DNA分子；2)序列表中序列1所示的DNA分子；3)在嚴格條件下與1)或2)限定的DNA序列雜交且具有啟動子功能的DNA分子；4)與1)或2)或3)限定的DNA序列具有90％以上同源性，且具有啟動子功能的DNA分子。該啟動子含有ABRE、DRE和CBF等逆境響應元件，在水稻幼芽、柱頭和花葯中特異表達。該啟動子對於水稻耐冷性分子機制的研究，以及水稻耐冷性分子育種具有重要的理論及實際意義。本發明在農業領域將具有廣闊的應用和市場前景。
文檔編號C12N15/63GK101768590SQ201010122399
公開日2010年7月7日 申請日期2010年3月11日 優先權日2010年3月11日
發明者付永彩, 劉鳳霞, 孫傳清, 朱作峰, 蘇震, 謝道昕, 譚祿賓 申請人:中國農業大學