水稻白葉枯病菌快速分離方法
2024-03-26 06:29:05 2
專利名稱：水稻白葉枯病菌快速分離方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，涉及一種水稻白葉枯病菌快速分離方法。
背景技術：
水稻白葉枯病是亞洲和太平洋地區水稻生產上最重要的細菌性病害之一。水稻白葉枯病是由病原細菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae)侵染而引發的一種主要水稻病害，不但嚴重發生在東南亞各國，而且已經蔓延到澳洲，美洲和非洲。我國目前除新疆外，全國都有不同程度的發生，是水稻上僅次於稻瘟病的重要病害。水稻受害後，一般減產20％～30％，嚴重的減產50％甚至顆粒無收。水稻抗病品種的培育、利用和病害的流行學研究，以及病原菌的小種分化、群體遺傳多樣性研究，都離不開快速獲得具有致病性的病原細菌分離物。植物病原細菌快速分離和純培養，無論是在科學試驗或是生產實踐中都有著重大的理論張實踐意義，純培養意味著從自然界中將特定的微生物分離出來，在人工培養基上增殖。特別是病原細菌，如何有效地去除病組織表面或其內部的其它微生物，快速獲得目標病原菌，一直都是植物病理學家關注的重點。
目前，用於水稻白葉枯病菌分離方法多採用沙培法，主要機理為通過對病組織進行保溼，使菌膿從病組織切出口產生，將後將菌膿放在適當培養基上進行分離培養。病組織破碎稀釋塗板分離法，該方法主要機理為首先破碎病組織，用無菌水浸提適量含菌液，然後經倍比稀釋後，將稀釋液置於適當培基上進行分離培養，上述兩種方法預處理時間均較長，前者高達20小時，後者分離一個樣品也需5小時；操作佔用空間大，使用耗材和消耗樣品多，另外破碎病組織，使得大量內生細菌或腐生菌浸提出病組織，造成汙染率高，上述方法已不適用於水稻白葉枯病菌快速分離的需要，其分離速度太慢，所用空間大，在一定時間內處理的樣本量偏少，分離效率低，汙染程度高，常因病組織樣品處理不及時，使得樣品難以處理，浪費了大量的標本。達不到實驗中理想病原物快速分離和分離物選擇、致病性需求的目的。
發明內容
本發明克服現有水稻白葉枯病菌分離方法的不足，提供了一種能夠及時處理水稻白葉枯病害標樣，高效、快速、準確獲得目標病原物菌分離的方法。
本發明水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是1.採用載玻片噴菌法快速分離水稻白葉枯病菌(1)標樣選擇選取具有典型症狀的水稻白葉枯病標本，在發病擴展前沿病鍵交界處，剪取0.5-1.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來水衝洗，選用75％灑精消毒60-90秒，然後用無菌水衝洗3次，稍涼幹後用剪刀修剪，去除多餘的健康組織；(3)將消毒過的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上1滴無菌水，室溫靜止5-15min，待噴菌現象出現後，用移菌環沾含菌液在普通NA或SX培養基劃線；(4)細菌培養24-28℃培養基箱中培養48-72h後觀察，根據菌落形態、顏色等細菌培養性狀，進行挑選，然後將細菌純培養進行保存或和病性驗證。
其中步驟1中(4)細菌培養用NA，SX培養基，NA培養基配方牛肉浸膏3g、酵母提取物1g、多聚蛋白腖5g、蔗糖10g、瓊脂17g、加水定容至1000ml，pH調至7.0；SX培養基配方可溶性澱粉10g，氯化銨5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氫鉀2g、瓊脂17-20g、加水定容至1000ml、調pH至7.0。分裝300ml，高壓鍋滅菌，滅菌條件溫度121℃，壓力0.15Mpa，滅菌時間20-25min，待冷卻到50-55℃，倒平板，供分離用。
2.液體冷凍法保存將長好的單菌落，用滅菌芽籤挑取少許，直接放入盛有NB液體培養液和滅菌雙蒸水的凍存管中，加入甘油至終濃度15％，封口後，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。
3.分離菌株的致病性驗證採用剪葉法接種，接種前，以無菌水洗脫菌落，懸浮均勻，用分光光度計測定細菌菌懸液濃度，OD600nm＝0.5，接種品種包括感病品種，已知抗病基因的鑑別品種等，接種2周和3周後分別測量病斑長度和該葉片的全長，每個菌株測量10張葉片。以三周後調查的病斑長度小於接種葉長的四分之一為抗病(R)，反之大於或等於接種葉長的四分之一為感病(S)。
本方法的有益效果利用細菌的噴菌現象原理，以載玻片為分離載體，按照本發明的描述的白葉枯病菌快速分離方法，由於本方法分離病原細菌，使用病組織體積小，並且未破壞病組織原始結構，病菌從病組織切口處噴出，含菌液中細菌單一，活力強，與國內同類分離方法相比優點表現在(1)用該方法分離的水稻白葉枯病菌，能保持原野生型的活性，變異程度極低。解決了其它分離方法汙染率高，不易得到目標病原細菌的問題；(2)分離速度快，主要原因是縮短了樣品處理時間，由傳統沙培法的20小時，縮短為2-3h，該方法與沙培法相比處理樣本數量大，減少了病標本使用量，而且分離獲得的病原物純度高；(3)操作簡單，簡便易行，成本低，應用廣泛。該方法除用於分離水稻白葉枯病菌外，還已用於分離水稻細菌性條斑病菌、紅掌細菌性疫病等葉斑類植物病原細菌。
具體實施例方式
實施例一本發明水稻白葉枯病菌快速分離方法，具體步驟是1.水稻白葉枯病菌快速分離，具體步驟如下(1)標樣選擇選取具有典型症狀的水稻白葉枯病標本，在發病擴展前沿病鍵交界處，剪取0.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來水衝洗，選用75％灑精消毒60秒，然後用無菌水衝洗3次，稍涼幹後用剪刀修剪，去除多餘的健康組織；(3)將消毒過的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上1滴無菌水，室溫靜止5min，待噴菌現象出現後，用移菌環沾取含菌液在普通NA培養基劃線；(4)細菌培養24℃培養基箱中培養48h後觀察，根據菌落形態、顏色等細菌培養性狀，進行挑選，然後將細菌純培養進行保存或和病性驗證。
2.液體冷凍法保存將長好的單菌落，用滅菌芽籤挑取少許，直接放入盛有NB液體培養液和滅菌雙蒸水的凍存管中，加入甘油至終濃度15％，封口後，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。
3.分離菌株的致病性驗證採用剪葉法接種，接種前，以無菌水洗脫菌落，懸浮均勻，用分光光度計測定細菌菌懸液濃度，OD600nm＝0.5，接種品種包括感病品種，已知抗病基因的鑑別品種等，接種2周和3周後分別測量病斑長度和該葉片的全長，每個菌株測量10張葉片。以三周後調查的病斑長度小於接種葉長的四分之一為抗病(R)，反之大於或等於接種葉長的四分之一為感病(S)。
沙培法分離水稻白葉枯病菌方法如下首先要切取水稻白葉枯病病葉子3-5cm，每份標本至少需3片葉，仍採用75％酒精進行表面消毒，然後將病葉插入裝有滅菌沙子的瓷缸(直徑8cm)中，用無菌水將沙子溼潤，然後用兩層砂布封口，室溫下擺放，20小時後，揭開砂布，用移菌粘取病葉切口處的菌膿，進行劃線培養，培養基採用普通NA培養基，根據菌落形態等培養性狀，進行選擇，即可獲得大量水稻白葉枯病菌。同樣採用液體冷凍法保存和分離菌株的致病性驗證。
4.實施效果從表1可知，採用本發明的快速分離方法，在處理同樣病樣時，與採用通用的沙培法分離相比，分離所需時間由48h縮短為4h，提高了分離速度，成本顯著降低，不使用砂布和瓷缸，減少了無菌水的用量和佔用空間體積由10m2減為0.5m2。病葉數使用量減少。特別是分離效率顯著提高，載玻片噴菌法分離效率為96％，而沙培法僅為40％，汙染率顯著降低。
表1.本發明與沙培法分離水稻白葉枯病菌的比較
實施例二本發明水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是1.水稻白葉枯病菌快速分離方法，具體步驟如下(1)標樣選擇選取具有典型症狀的水稻白葉枯病標本，在發病擴展前沿病鍵交界處，剪取1.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來水衝洗，選用75％灑精消毒90秒，然後用無菌水衝洗3次，稍涼幹後用剪刀修剪，去除多餘的健康組織；(3)將消毒過的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上1滴無菌水，室溫靜止15min，待噴菌現象出現後，用移菌環劃線於普通SX培養基上，SX培養基配方可溶性澱粉10g，氯化銨5g，牛肉浸膏1g，磷酸二氫鉀2g，瓊脂17g，加水定容至1000ml，調pH至7.0；(4)細菌培養28℃培養基箱中培養72h後觀察，根據菌落形態、顏色等細菌培養性狀，進行挑選，然後將細菌純培養進行保存或和病性驗證。
2.液體冷凍法保存同實施例一。
3.分離菌株的致病性驗證同實施例一。
病組織破碎稀釋塗板法，具體步驟為首先將病組織消毒，採用0.1％升汞進行表面消毒，然後用無菌水衝洗，然後再用選用75％灑精消毒90秒，然後用無菌水衝洗3次，置於已滅菌的培養皿中，用剪刀或玻璃棒破碎，然後加入3-5ml無菌水，室溫靜止20min，然後用移液管洗取1ml含菌浸出液，進行10x系列稀釋，選取10-3，10-4，10-5三個梯度，每皿塗0.1ml，用自製玻璃塗棒在SX培養基上進行塗板，28℃培養基箱中培養72h後觀察，根據菌落形態、顏色等細菌培養性狀，進行挑選，然後將細菌純培養進行保存或和病性驗證。
4.實施效果從表2可知，採用本發明的快速分離方法，在處理同樣病樣時，與採用通用的沙培法分離相比，分離每個樣品所需時間由30min縮短為10min，提高了分離速度，成本顯著降低，不使用培養皿，顯著減少了無菌水的用量由每個樣品需200ml至30ml和佔用空間體積由5m2減為0.1m2。病葉數使用量減少。特別是分離效率顯著提高，載玻片噴菌法分離效率為95％，而沙培法僅為50％，汙染率顯著降低。
表2.本發明與病組織破碎稀釋塗板分離法的比較
實施例三本發明水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是1.水稻白葉枯病菌快速分離方法，具體步驟如下(1)標樣選擇選取具有典型症狀的水稻白葉枯病標本，在發病擴展前沿病鍵交界處，剪取1.0cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來水衝洗，選用75％灑精消毒75秒，然後用無菌水衝洗3次，稍涼幹後用剪刀修剪，去除多餘的健康組織；(3)將消毒過的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上1滴無菌水，室溫靜止10min，待噴菌現象出現後，用移菌環劃線於普通SX培養基上，SX培養基配方可溶性澱粉10g、氯化銨5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氫鉀2g、瓊脂17g、加水定容至1000ml，調pH至7.0；(4)細菌培養25℃培養基箱中培養56h後觀察，根據菌落形態、顏色等細菌培養性狀，進行挑選，然後將細菌純培養進行保存或和病性驗證。
2.液體冷凍法保存同實施例一。
3.分離菌株的致病性驗證同實施例一。
沙培法分離水稻白葉枯病菌方法如下首先要切取水稻白葉枯病病葉子3-5cm，每份標本至少需3片葉，仍採用75％酒精進行表面消毒，然後將病葉插入裝有滅菌沙子的瓷缸(直徑8cm)中，用無菌水將沙子溼潤，然後用兩層砂布封口，室溫下擺放，20小時後，揭開砂布，用移菌粘取病葉切口處的菌膿，進行劃線培養，培養基採用普通NA培養基，根據菌落形態等培養性狀，進行選擇，即可獲得大量水稻白葉枯病菌。同樣採用液體冷凍法保存和分離菌株的致病性驗證。
病組織破碎稀釋塗板法，具體步驟為首先將病組織消毒，採用0.1％升汞進行表面消毒，然後用無菌水衝洗，然後再用選用75％灑精消毒90秒，然後用無菌水衝洗3次，置於已滅菌的培養皿中，用剪刀或玻璃棒破碎，然後加入3-5ml無菌水，室溫靜止20min，然後用移液管洗取1ml含菌浸出液，進行10x系列稀釋，選取10-3，10-4，10-5三個梯度，每皿塗0.1ml，用自製玻璃塗棒在SX培養基上進行塗板，28℃培養基箱中培養72h後觀察，根據菌落形態、顏色等細菌培養性狀，進行挑選，然後將細菌純培養進行保存或和病性驗證。
4.實施效果從表3可知，採用本發明的快速分離方法，在處理同樣病樣時，與採用通用的沙培法和病組織破碎稀釋塗板分離法分離相比，分離每個樣品所需時間分別由1h和30min縮短為10min，提高了分離速度，成本顯著降低，不使用紗布、試管、塗棒、培養皿，顯著減少了無菌水的用量由每個樣品需100ml和200ml至30ml和佔用空間體積由25m2和4.7m2減為0.09m2。病葉數使用量減少。特別是分離效率顯著提高，載玻片噴菌法分離效率為93％，而沙培法和病組織破碎稀釋塗板分離法僅為40％和47％，汙染率顯著降低。
表3.本發明與沙培法和病組織破碎稀釋塗板分離法的比較
實施例四本發明水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是1.水稻白葉枯病菌快速分離，具體步驟如下(1)標樣選擇選取具有典型症狀的水稻白葉枯病標本，在發病擴展前沿病鍵交界處，剪取0.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來水衝洗，選用75％灑精消毒80秒，然後用無菌水衝洗3次，稍涼幹後用剪刀修剪，去除多餘的健康組織；(3)將消毒過的組織塊放在滅菌的載玻片上(事先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，用前在酒精燈火上輕燒)，兩端滴上3滴無菌水，室溫靜止15min，待噴菌現象出現後，用移菌環劃線於普通NA培養基上；(4)細菌培養25℃培養基箱中培養56h後觀察，根據菌落形態、顏色等細菌培養性狀，進行挑選，然後將細菌純培養進行保存或和病性驗證。
2.液體冷凍法保存將長好的單菌落，用滅菌芽籤挑取少許，直接放入盛有NB液體培養液和滅菌雙蒸水的凍存管中，加入甘油至終濃度15％，封口後，立即放入-30℃或-70℃的冰箱中。
3.分離菌株的致病性驗證採用剪葉法接種，接種前，以無菌水洗脫菌落，懸浮均勻，用分光光度計測定細菌菌懸液濃度，OD600nm＝0.5，接種品種包括感病品種，已知抗病基因的鑑別品種等，接種2周和3周後分別測量病斑長度和該葉片的全長，每個菌株測量10張葉片。以三周後調查的病斑長度小於接種葉長的四分之一為抗病(R)，反之大於或等於接種葉長的四分之一為感病(S)。
4.實施效果詳見表3、4。採用本發明從雲南省9個地州約40個縣市120點，分離獲得和保存菌株約200株，其中40個代表代表菌株的致病性測定表明菌株純度高，致病性差異明顯，能保持菌株的野生型，基本上接自然菌株存在的狀態，由強毒性和弱毒性菌株組成，病斑長度從1.9到24.2cm。利用含不同抗病基因的水稻近等基因系品種IRBB5、IRBB4、IRBB3、IRBB14、IRBB1和IR24作為鑑別品種，根據病原菌菌株與這些鑑別品種的互作反應，將採用本發明分離的白葉枯菌株劃分為相應的11個小種。對應11個小種互作模式為，R1抗抗抗抗抗抗；R2抗抗抗抗抗感；R3抗抗抗抗感感；R4抗抗抗感感感；R5抗抗感感感感；R7抗感感抗感感；R8抗感感感感感；R9感感感感感感；R10抗感抗抗感感；R12抗抗感抗感感；R13抗感抗感感感。
表4.採用本發明分離獲得的代表性菌株的致病性測定
續表4.採用本發明分離獲得的代表性菌株的致病性測定
表5.雲南水稻白葉枯代表菌株小種分化
權利要求
1.水稻白葉枯病菌快速分離方法，其步驟是(1)標樣選擇選取具有典型症狀的水稻白葉枯病標本，在發病擴展前沿病鍵交界處，剪取0.5-1.5cm組織塊；(2)消毒首先將組織塊用自來水衝洗，選用75％灑精消毒60-90秒，然後用無菌水衝洗3次，稍涼幹後用剪刀修剪，去除多餘的健康組織；(3)先將載玻片放入95％乙醇中浸泡，在酒精燈火上輕燒，將消毒過的組織塊放在滅菌的載玻片上，兩端滴上1滴無菌水，室溫靜置5-15min，待噴菌現象出現後，用移菌環沾含菌液劃線於普通NA或SX培養基上；(4)細菌培養24-28℃培養基箱中培養48-72h後觀察，根據菌落形態、顏色等細菌培養性狀，進行挑選，然後將細菌純培養保存。
2.根據權利要求所述的水稻白葉枯病菌分離方法，其特徵是，所述NA培養基的配方為牛肉浸膏3g、酵母提取物1g、多聚蛋白腖5g、蔗糖10g、瓊脂17g、加水定容至1000ml，調pH至7.0。
3.根據權利要求所述的水稻白葉枯病菌分離方法，其特徵是，所述SX培養基配方可溶性澱粉10g、氯化銨5g、牛肉浸膏1g、磷酸二氫鉀2g、瓊脂17-20g，加水定容至1000ml，調pH至7.0。
全文摘要
本發明涉及水稻白葉枯病菌快速分離方法，屬微生物技術領域。將含目標病原細菌的水稻病組織，經用75％灑精消毒60－90秒後，用無菌水衝洗，將病組織置於無菌載玻片上，滴加無菌水，室溫擺放5－15min，待病原菌從病組織中噴出到切口處的水中，用移菌環沾取含菌液劃線於適於水稻白葉枯病菌生長的NA或SX培養基上，25－28℃培養，即可得到相應的目標細菌。本發明分離細菌快速、準確、汙染率低、純度高、菌株變異極小，保持了病原菌野生型的特性。
文檔編號C12N1/20GK1807587SQ20051004873
公開日2006年7月26日 申請日期2005年12月22日 優先權日2005年12月22日
發明者姬廣海, 張世光, 陳興全, 何月秋 申請人:雲南農業大學