一種黃牛fbxo32基因單核苷酸多態性及作為分子標記的檢測方法
2024-02-29 13:11:15
專利名稱：一種黃牛fbxo32基因單核苷酸多態性及作為分子標記的檢測方法
技術領域：
本發明屬於分子遺傳學領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測黃牛FBX032基因單核苷酸多態性的方法。
背景技術：
單核苷酸多態性(SNP)主要是指在基因組水平上由單個核苷酸的變異所引起的DNA序列多態性。SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位於編碼區內的SNP(coding SNP,cSNP)比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關注。然而隨著科學的發展，很多研究表明位於基因內含子中的SNP會影響基因的轉錄效率從而間接 的影響基因的功能，所以內含子的多態性也引起了關注。單核苷酸多態性是研究人類家族和動植物品系遺傳變異的重要依據。近年來，人們發展了許多用於探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多態技術(SSCP)、直接測序技術和PCR-RFLP等，但SSCP操作繁瑣、耗時長，結果易造成誤判；而直接測序技術成本又較高。因此，把構建DNA池進行測序和PCR-RFLP結合在一起的方法是一種檢測SNP的有效技術，在發現SNP位點後使用限制性內切酶進行切割，然後進行瓊脂糖凝膠電泳分析，就能準確地鑑別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了 SSCP費用昂貴、繁瑣操作、假陽性率高的缺點，而且所檢測的序列位點無特殊性要求。FBX032蛋白是F-box蛋白家族的成員，是泛素蛋白連接酶複合體組成之一。目前，對於FBX032基因的研究多在人類和小鼠上，主要在肌肉的代謝過程以及相關疾病發生機理等方面做了大量研究。國內外尚未見關於牛FBX032基因遺傳變異的研究。中國黃牛FBX032基因遺傳變異領域的研究匱乏，該基因位點的功能研究及其遺傳變異與經濟性狀(如體斜長和日增重等性狀)關聯的研究仍是空白。由於FBX032基因功能涉及日增重等生長性狀，本發明提供的檢測方法為FBX032基因的SNP與生長性狀關係的建立奠定了基礎，以便用於中國黃牛生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。
發明內容
本發明解決的問題在於利用PCR-RFLP和ACRS-PCR-RFLP方法檢測黃牛FBX032基因的多態性，並將其與生長性狀進行關聯分析，驗證其是否可以作為黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記，從而加快良種選育速度。本發明是通過以下技術方案來實現—種黃牛FBX032基因單核苷酸多態性及作為生長性狀分子標記的檢測方法，以包含FBX032基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3為引物，PCR擴增黃牛FBX032基因部分片段；用限制性內切酶Haelll、HaeIII, BfaI分別消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛FBX032基因第22830位、第44675位、第53423位的單核苷酸多態性。所述的引物對Pl為上遊引物5'CAGGTCCCCGTCCATCAGTC 3'下遊引物5'GGAAGCGTTTCCAGCCATCGGC 3'所述的引物對P2為 上遊引物5'GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3'下遊引物5'TTCCATCCACTCACATTCCCT 3'所述的引物對P3為上遊引物5'CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3'下遊引物5'AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3'所述的PCR擴增反應程序為94°C 預變性 5min ；34 個循環94°C變性 30s，Tni (分別為 66°C，58. 5°C，64. 7°C )退火 30s，72°C延伸30s ；72 延伸 IOmin。所述的根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛FBX032基因第22830位的單核苷酸多態性為AA基因型表現為長度為131bp的一條帶；AG基因型表現為長度分別為131bp、IlObp和2Ibp的三條帶；GG基因型表現為長度分別為IlObp和2Ibp的兩條帶。第44675位的單核苷酸多態性為TT基因型表現為長度為331bp的一條帶；TC基因型表現為長度分別為331bp、257bp和74bp的三條帶；CC基因型表現為長度分別為257bp和74bp的兩條帶。第53423位的單核苷酸多態性為GG基因型表現為長度為587bp的一條帶；AG基因型表現為長度分別為587bp、450bp和137bp的三條帶；AA基因型表現為長度分別為450bp和137bp的兩條帶。本發明根據FBX032基因的序列設計引物，分別以6種黃牛品種構建的基因組DNA池為模板，進行PCR擴增，並對PCR產物進行測序，測序後得到黃牛FBX032基因的部分序列，與NCBI公布的序列進行比較發現在第22830位、第44675位、第53423位存在單核苷酸多態性。針對上述三處SNP多態性，本發明還公開了其篩查和檢測方法，通過設計特定的弓I物進行PCR擴增，並用特定的限制性內切酶酶切PCR產物鑑定，能夠簡單、快速、成本低、精確的檢測其單核苷酸的多態性。本發明對6個黃牛品種的SNP基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNP位點與南陽牛部分生長性狀(體重和日增重等)進行關聯分析，結果表明該位點能夠作為提高黃牛生長性狀的分子標記。
圖I為黃牛FBX032基因酶切電泳結果圖，其中圖la、lb、lc、分別為黃牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位的多態位點PCR產物的酶切電泳結果。
圖2為黃牛FBX032基因SNP多態性測序結果圖，其中圖2a、2b、2c分別為黃牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位多態位點的測序結果圖，不同顏色的曲線代表不同的鹼基(藍線表示C鹼基的測序峰，紅線代表T鹼基的測序峰；黑線代表G鹼基的測序峰；綠線代表A喊基的測序峰)。圖3為黃牛FBX032基因部分DNA序列圖，其中圖3a、3b、3c分別為黃牛FBX032基因包含第22830位、第44675位、第53423位的多態位點的DNA片段圖。
具體實施例方式本發明利用PCR-RFLP和ACRS-PCR-RFLP方法對黃牛FBX032基因第22830位、第44675位、第53423位的單核苷酸多態性進行檢測和關聯分析，下面對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明
的解釋而不是限定。a、黃牛FBX032基因含第3外顯子、第8內含子和第10內含子PCR引物的設計以NCBI所公布的牛序列(NC_007312. 4)為參考，利用Primer 5. O設計能夠擴增分別包含黃牛FBX032基因第3外顯子、第8內含子和第10內含子的PCR引物。擴增第3外顯子的引物為上遊引物5'CGACCCTCTACCGTGCGTTCC 3'下遊引物5'GGGCTCCCTCCTCACCCTGTT 3'擴增第8內含子的引物為上遊引物5'GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3'下遊引物5'TTCCATCCACTCACATTCCCT 3'擴增第10內含子的引物為上遊引物5'CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3'下遊引物5'AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3'以上述引物對黃牛基因組擴增，分別擴增包含黃牛FBX032基因(NC_007312. 4)第3外顯子、第8內含子和第10內含子的DNA片段，對擴增的片段進行測序鑑定後發現在第3外顯子存在一處SNP(NC_007312. 4 22830A > G)，在第8內含子存在一處SNP (NC_007312. 4 44675T > C)，在第 10 內含子存在一處 SNP (NC_007312. 4 53463G > A)。經過分析，以上第3外顯子處SNP不存在天然酶切位點，因此，通過設計引物Pl對該處SNP引入HaeIII酶切位點。b、以引物P進行PCR擴增待測黃牛的FBX032基因片段I、黃牛樣本的採集本發明具體以7個中國地方黃牛品種的種群作為檢測對象，具體採集樣本見表I :表I黃牛樣本的採集
權利要求
1.一種黃牛FBX032基因單核苷酸多態性及作為分子標記的檢測方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)以包含FBX032基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2、P3為引物，PCR擴增黃牛FBX032基因部分片段， 所述的引物對Pl為 上遊引物5' CAGGTCCCCGTCCATCAGTC 3' 下遊引物5' GGAAGCGTTTCCAGCCATCGGC 3' 所述的引物對P2為 上遊引物5' GGCCCTGTCTGCCATTTATCT 3' 下遊引物5' TTCCATCCACTCACATTCCCT 3' 所述的引物對P3為 上遊引物5' CCAAACAGTCACCGCATCTCC 3' 下遊引物5' AGGGCCTGCATCAGTCTTACC 3' 上述引物對在FBX032基因(NCBI參考序列號NC_007312. 4)中的位置如下 Pl :上遊引物322bp 341bp ;下遊引物431bp 452bp ； P2 :上遊引物738bp 758bp ;下遊引物1049bp 1069bp ； P3 :上遊引物53299bp 53319bp ;下遊引物53855bp 53875bp ； (2)以限制性內切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分別消化PCR擴增產物之後； (3)對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛FBX032基因(NCBI參考序列號NC_007312. 4)第22830位、第44675位、第53423位的單核苷酸多態性。
2.根據權利要求I所述的檢測黃牛FBX032基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述的PCR擴增反應程序為 94°C預變性5min ；34 個循環94°C變性 30s, T111 (分別為 66°C, 58. 5°C,64. 7V )退火 30s，72°C延伸 30s ；72°C延伸 lOmin。
3.根據權利要求I所述的檢測黃牛FBX032基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述的瓊脂糖凝膠的質量濃度分別為3. 5%、2. O%、2. O%。
4.根據權利要求I所述的檢測黃牛FBX032基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛FBX032基因第22830位的單核苷酸多態性為AA基因型表現為長度為131bp的一條帶；AG基因型表現為長度分別為131bp、IlObp和21bp的三條帶；GG基因型表現為長度分別為IlObp和21bp的兩條帶。
5.根據權利要求I所述的檢測黃牛FBX032基因單核苷酸多態性的方法，第44675位的單核苷酸多態性為TT基因型表現為長度為331bp的一條帶；TC基因型表現為長度分別為331bp、257bp和74bp的三條帶；CC基因型表現為長度分別為257bp和74bp的兩條帶。
6.根據權利要求I所述的檢測黃牛FBX032基因單核苷酸多態性的方法，第53423位的單核苷酸多態性為GG基因型表現為長度為587bp的一條帶；AG基因型表現為長度分別為587bp、450bp和137bp的三條帶；AA基因型表現為長度分別為450bp和137bp的兩條帶。
7.根據權利要求I至6中任意一項權利要求所述的檢測黃牛FBX032基因單核苷酸多態性的方法在鑑定不同黃牛群體多態性中的診斷應用。
8.根據權利要求7所述的診斷應用，其特徵在幹，鑑定不同黃牛多態性，黃牛FBX032基因第22830位和第53423位的SNP作為在黃牛分子育種中輔助選擇的分子標記，第44675位的CC基因型為提高黃牛體斜長、胸圍、坐骨端寬和日增重的候選分子遺傳標記。
全文摘要
本發明公開了一種黃牛FBXO32(F-boxprotein 32)基因單核苷酸多態性及作為分子標記的檢測方法。以包含FBXO32基因的待測黃牛全基因組DNA為模板，以引物對P(P1、P2、P3)為引物，PCR擴增黃牛FBXO32基因；用限制性內切酶HaeIII、HaeIII、BfaI分別消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定黃牛FBXO32基因(NCBI參考序列號NC_007312.4)第22830位、第44675位、第53423位的單核苷酸多態性。本發明提供的檢測方法為FBXO32基因的單核苷酸多態性與生長性狀關係的建立奠定了基礎，以便用於中國黃牛肉用生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，快速建立遺傳資源優良的黃牛種群。
文檔編號C12N15/11GK102816836SQ20121014225
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月9日 優先權日2012年5月9日
發明者陳宏 , 王愛蘭, 藍賢勇 申請人:西北農林科技大學