生產葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法
2024-02-29 17:09:15
專利名稱：生產葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，涉及構建微生物工程菌生產重組蛋白的方法。具體是應用微生物工程菌生產重組混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶。
背景技術：
葡聚糖內切酶(endo-1,4-@-D-glucanase)、葡聚糖外切酶(exo_l,4-3-D-glucanase)和P _葡萄糖苷酶(P-glucosidase)具有聯合水解纖維素的作用。纖維素由葡萄糖分子組成。葡聚糖內切酶(endo-1,4-0-D-glucanase)作用於纖維素內部的非結晶區，隨機水解￠-1,4-糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量非還原性末端的小分子纖維素。葡聚糖外切酶作用於纖維素線狀分子末端，依次切下一個纖維二糖分 子；￠-葡萄糖苷酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。即在葡聚糖內切酶，葡聚糖外切酶以及^ -葡萄糖苷酶的聯合作用下，纖維素水解為葡萄糖分子。葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和
葡萄糖苷酶廣泛應用於飼料、纖維素乙醇，食品、紡織和環衛業等領域，具有巨大的市場潛力。目前葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶產品是來源於天然的產纖維素酶的菌株(細菌、放線菌和絲狀真菌)。但是，由於細菌產生的葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶是以包涵體形式存在於胞內，產物難於純化；而放線菌和絲狀真菌生長緩慢，營養要求較高，分泌大量自身的蛋白，難於純化，生產成本較高。近些年來，陸續有報導表達重組葡聚糖內切酶或葡聚糖外切酶或￠-葡萄糖苷酶。由於引用強的啟動子，選擇生產性能良好的宿主菌和採取基因多拷貝重組的策略，可以較顯著地提高重組酶的表達量。但工業上需求的並非葡聚糖內切酶或葡聚糖外切酶或￠-葡萄糖苷酶，而是葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和3-葡萄糖苷酶的混合酶。當前市面上尚沒有重組生產的混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶的混合酶產品，若用現有的含葡聚糖內切酶或葡聚糖外切酶或3 -葡萄糖苷酶的工程菌生產單酶，然後再將這些酶進行混合應用，其工序複雜，成本高。枯草芽孢桿菌和畢赤酵母都是常用於生產重組蛋白的宿主菌，但各具有特徵。畢赤酵母的主要特徵是分泌極少自身蛋白有利於表達產物的純化；枯草芽孢桿菌具有兼性厭氧的特性，既能在有要氧的環境進行發酵，也能在無氧的環境進行發酵。
發明內容
本發明構建含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和^-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和3-葡萄糖苷酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌；用含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌和含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和3-葡萄糖苷酶基因表達框架的畢赤酵母工程菌生產重組混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。本發明所採用的技術方案是I.克隆基因從木黴基因組中克隆葡聚糖內切酶，葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因。2.獲得構建表達載體的啟動子，重組序列，信號肽，轉錄終止子序列和抗性基因序列。3.構建如附圖I和附圖2的兩種表達載體。4.通過電轉化方法將以上構建的含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、聚糖外切酶基因表達框架和β-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草桿菌表達載體轉化枯草芽孢桿菌、將含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、聚糖外切酶基因表達框架和β -葡萄糖苷酶基因 表達框架的畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母基因組。篩選高表達葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的重組子作為工程菌。5.發酵含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、聚糖外切酶基因表達框架和β-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌和畢赤酵母工程菌生產重組混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。本發明構建含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、聚糖外切酶基因表達框架和β-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌和畢赤酵母工程菌生產重組混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的優點體現於(I)用工程菌取代天然菌株生產葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶，通過增加基因拷貝數而提高酶的產量。(2)用含葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶基因的工程菌取代含單一酶基因的工程菌生產酶，用一個發酵工序同時生產葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶取代了用三個工序分別生產重組葡聚糖內切酶或葡聚糖外切酶或β-葡萄糖苷酶。節省了原材料、能耗和人力資源。(3)枯草芽孢桿菌和畢赤酵母在生產重組蛋白方面各具特徵，本發明分別構建含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、聚糖外切酶基因表達框架和β -葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌和畢赤酵母工程菌，為其重組酶生產提供兩種菌株選擇。
附圖I.含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和β-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草桿菌表達載體。p.巨大芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶(GAP)啟動子；S. α因子信號肽；genel.木黴的葡聚糖內切酶基因；gene 2.木黴的聚糖外切酶基因；gene 3.木黴的β -葡萄糖苷酶基因；TT.轉錄終止子序列；G418.G418抗性基因(應用於篩選枯草芽孢桿菌重組子)；ColEl.大腸桿菌複製起點；AMP.氨苄青黴素抗性基因(應用於篩選大腸桿菌轉化子)；B. subtilis rDNA.枯草芽抱桿菌的rDNA序列。附圖2.含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和β-葡萄糖苷酶基因表達框架的畢赤酵母表達載體。p.畢赤酵母的三磷酸甘油醒脫氫酶(GAP)啟動子；S. α因子信號肽；genel.木黴的葡聚糖內切酶基因；gene 2.木黴的聚糖外切酶基因；gene 3.木黴的P -葡萄糖苷酶基因；TT.轉錄終止子序列；G418.G418抗性基因(應用於篩選畢赤酵母重組子)；ColEl.大腸桿菌複製起點；AMP.氨苄青黴素抗性基因(應用於篩選大腸桿菌轉化子)f.pastorisrDNA.畢赤酵母的rDNA序列。
具體實施例方式下面用非限定性實施例對本發明作進一步說明。實施例I :I. I構建含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和^-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌表達載體I. I. I構建克隆載體
由專業的DNA序列合成公司合成含氨苄青黴素(AMP)基因序列、多克隆接頭和大腸桿菌複製起點的兩條鹼基互補的DNA雙鏈，並且在每條DNA鏈序列的兩端形成粘性末端。通過DNA連接酶的作用使其環化，形成DNA克隆載體。將其克隆載體命名為pBCL。I. I. 2用反轉錄PCR擴增木黴的葡聚糖內切酶基因、葡聚糖外切酶基因和P葡萄糖苷酶基因合成如下引物引物a:5' tcgaattcccgaattccagcagactg3'[說明5』 端的 8 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]引物b:5' ttGCGGCCGCatgcggccgcctactttc3'[說明5』端的 10 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個鹼基)]引物c:5' gcgaattcccgaattccaagcttgct3;[說明5』 端的 8 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]引物d 5/ aaGCGGCCGCcagcggccgcttacaggaa3 [說明5』 端的 10 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個鹼基)]引物e:5' ccgaattcgcgctacgtagttgtacct 3'[說明5』 端的 8 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]引物f:5' tagcggccgcataagcggccgcctac 3'[說明5』 端的 10 個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的8個鹼基)] 應用RNA提取試劑盒提取木黴的總RNA，應用cDNA合成試劑盒合成其cDNA。以上述合成的木黴的cDNA為模板，應用引物a和引物b進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是木黴的葡聚糖內切酶基因序列；以上述合成的木黴的cDNA為模板，應用引物c和引物d進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是木黴的葡聚糖外切酶基因序列；以上述合成的木黴的cDNA為模板，應用引物e和引物f進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是木黴的P葡萄糖苷酶基因序列。I. I. 3分別構建上述各種酶基因表達框架I. I. 3. I用PCR擴增巨大芽孢桿菌(Bacillus megaterium)的三磷酸甘油醒脫氫酶啟動子序列。引物I:
5』 CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCA 3』引物2:5』 GGGCATGCGGGTATTTCCTCCTTGAATGT 3』[說明引物5』端的8個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]提取巨大芽孢桿菌的基因組DNA[巨大枯草芽孢桿菌基因組DNA提取方法將枯草芽孢桿菌細胞加於9mg/ml的蝸牛酶溶液(蝸牛酶用lmol/L的山梨醇溶解)於30°C振搖30分鐘，然後按照常規的細菌基因組DNA提取方法提取其基因組DNA]，應用引物I和引物2進行PCR擴增，PCR產物經序列測定和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是巨大芽孢桿菌三磷酸甘油醛脫氫酶基因的啟動子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子序列]:CCTACGTAGATCCATTATCGGTGAACCATCTATTAAAGACATGCTTCATTTAATTAAGTCCGCTGGTATGGTTGTTCACG GAATAGGAGACGCTATGACAATGGCAGAACGCCGTAAAACACCACAAGCAGACTTAGAAAAAGTGAAAAATGGACATGCT GTAGGTGAGGCATTTGGATACTATTTTAATCATCAAGGCGAAGTTGTTCATAAAGTTAAAACAGTTGGCATACAACTCGA TGATTTAAAGAACAATAAATGTGTTATTGCTGTTGCAGGAGGTTCATCAAAAGCAAAGGCAATTAAAGCGTTTATGCAAC AAGCGCATGATTCGATTCTCATTACAGATGAAGGCGCCGCAAAAGAGTTAGTAAGGGATTTTAATTAATCCCTCATATAA AAAATACTTTTTACATTCAAGGAGGAAATACCCGCATGCCCI. I. 3. 2由專業的DNA序列合成公司合成α因子信號肽[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是α因子信號肽序列]: CCGCATGCATGAGATTTCCTTCAATTTTTACTGCAGTTTTATTCGCAGCATCCTCCGCATTAGCTGCTCCAGTCAACACT ACAACAGAAGATGAAACGGCACAAATTCCGGCTGAAGCTGTCATCGGTTACTCAGATTTAGAAGGGGATTTCGATGTTGC TGTTTTGCCATTTTCCAACAGCACAAATAACGGGTTATTGTTTATAAATACTACTATTGCCAGCATTGCTGCTAAAGAAG AAGGGGTATCTCTCGAGAAAAGAGAGGCTGAAGCTTACACTAGTCC I. I. 3. 3由專業的DNA序列合成公司合成轉錄終止子序列[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是轉錄終止子序列]:GGACTAGTCCTTAGACATGACTGTTCCTCAGTTCAAGTTGGGCACTTACGAGAAGACCGGTCTTGCTAGATTCTAATCAA GAGGATGTCAGAATGCCATTTGCCTGAGAGATGCAGGCTTCATTTTTGATACTTTTTTATTTGTAACCTATATAGTATAG GATTTTTTTTGTCATTTTGTTTCTTCTCGTACGAGCTTGCTCCTGATCAGCCTATCTCGCAGCTGATGAATATCTTGTGG TAGGGGTTTGGGAAAATCATTCGAGTTTGATGTTTTTCTTGGTATTTCCCACTCCTCTTCAGAGTACAGAAGATTAAGTG AGAAGTTCGTTTGTGCAAGCTTATCGATCCI. I. 3. 4用套疊PCR法合成如下G418抗性基因序列[如下序列有下劃線的是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(6個鹼基)，沒有下劃線的是G418抗性基因序列]GGATCGATCCAATTCTGATTAGAAAAACTCATCGAGCATCAAATGAAACTGCAATTTATTCATATCAGGATTATCAATAC CATATTTTTGAAAAAGCCGTTTCTGTAATGAAGGAGAAAACTCACCGAGGCAGTTCCATAGGATGGCAAGATCCTGGTAT CGGTCTGCGATTCCGACTCGTCCAACATCAATACAACCTATTAATTTCCCCTCGTCAAAAATAAGGTTATCAAGTGAGAA ATCACCATGAGTGACGACTGAATCCGGTGAGAATGGCAAAAGCTTATGCATTTCTTTCCAGACTTGTTCAACAGGCCAGC CATTACGCTCGTCATCAAAATCACTCGCATCAACCAAACCGTTATTCATTCGTGATTGCGCCTGAGCGAGACGAAATACG CGATCGCTGTTAAAAGGACAATTACAAACAGGAATCGAATGCAACCGGCGCAGGAACACTGCCAGCGCATCAACAATATT TTCACCTGAATCAGGATATTCTTCTAATACCTGGAATGCTGTTTTCCCGGGGATCGCAGTGGTGAGTAACCATGCATCAT CAGGAGTACGGATAAAATGCTTGATGGTCGGAAGAGGCATAAATTCCGTCAGCCAGTTTAGTCTGACCATCTCATCTGTA ACATCATTGGCAACGCTACCTTTGCCATGTTTCAGAAACAACTCTGGCGCATCGGGCTTCCCATACAATCGATAGATTGT CGCACCTGATTGCCCGACATTATCGCGAGCCCATTTATACCCATATAAATCAGCATCCATGTTGGAATTTAATCGCGGCC TCGAGCAAGACGTTTCCCGTTGAATATGGCTCATGGTACCGGI. I. 3. 5用PCR從枯草芽孢桿菌基因組中擴增rDNA序列引物I :5，CCGGTACCgacgaacgctggcggcgtgc3 引物2 :5，CCTTCGAAgcaccttccgatacggctacct3 [說明引物5』端的8個鹼基是酶切保護鹼基(2個鹼基)和DNA限制性內切酶識別位點(有下劃線的6個鹼基)]提取枯草芽孢桿菌基因組DNA (枯草芽孢桿菌基因組DNA提取方法同以上所述的巨大芽孢桿菌基因組DNA提取方法)，以基因組DNA為模板應用引物I和引物2進行PCR擴增，獲得的PCR產物經序列分析和用NCBI提供的BLAST軟體分析證明是枯草芽孢桿菌基因組的rDNA序列。I. I. 3. 6表達框架構建(啟動子-信號肽-基因-轉錄終止子序列)過程D.構建葡聚糖內切酶基因表達框架通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，將巨大枯草芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組於pBCL載體的多克隆位點；將α因子信號肽DNA序列重組於pBCL載體的多克隆位點，並使其位於啟動子序列的下遊；將木黴的葡聚糖內切酶基因序列重組於PBCL載體的多克隆位點，並使其位於信號肽序列的下遊；將轉錄終止子序列重組於pBCL載體的多克隆位點，並使其位於基因序列下遊。此含葡聚糖內切酶基因表達框架的載體稱為PBCL1。E.構建葡聚糖外切酶基因表達框架通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，將巨大枯草芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組於pBCL載體的多克隆位點；將α因子信號肽DNA序列重組於PBCL載體的多克隆位點，並使其位於啟動子序列的下遊；將木黴的葡聚糖外切酶基因序列重組於PBCL載體的多克隆位點，並使其位於信號肽序列的下遊；將轉錄終止子序列重組於pBCL載體的多克隆位點，並使其位於基因序列下遊。此含葡聚糖外切酶基因表達框架的載體稱為PBCL2。F.構建β葡萄糖苷酶基因表達框架通過DNA限制性內切酶和Τ4 DNA連接酶的作用，將巨大枯草芽孢桿菌的三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子DNA序列重組於pBCL載體的多克隆位點；將α因子信號肽DNA序列重組於pBCL體的多克隆位點，並使其位於啟動子序列的下遊；將木黴的β葡萄糖苷酶基因序列重組於pBCL載體的多克隆位點，並使其位於信號肽序列的下遊；將轉錄終止子序列重組於pBCL載體的多克隆位點，並使其位於基因序列下遊。此含β葡萄糖苷酶基因表達框架的載體稱為PBCL3。1.1.4完成表達載體的構建I. I. 4. I將3套表達框架組裝於同一個克隆載體。通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用，切取pBCL2，和pBCL3載體的表達框架，並將切下的這兩套表達框架依次插入於PBCLl的多克隆位點。此載體稱為PBCL123。I. I. 4. 2通過DNA限制性內切酶和T4 DNA連接酶的作用依次將枯草芽孢桿菌的rDNA (DNA重組序列)和G418基因重組於pBCL123載體的多克隆位點。構成含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌表達載體(附圖I)。I. 2構建含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和 ^-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌。用電轉化方法將含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和3-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌表達載體轉化枯草芽胞桿菌，將經過電轉化作用的枯草芽孢桿菌塗布於G418-LB(1%胰蛋白腖，0.5%酵母提取物，1%氯化鈉，1.5%瓊脂粉，終濃度為70011§/1111的6418)平板，在37 °C培養3天後生長出菌落(重組子)。分別應用以上所述的葡聚糖內切酶基因、葡聚糖外切酶基因和￠-葡萄糖苷酶基因特異引物，以重組子基因組DNA為模板，進行PCR擴增；重組子能擴增出目標大小的PCR擴增帶，並且對其PCR產物進行序列測定證明其木黴的葡聚糖內切酶基因、葡聚糖外切酶基因和葡萄糖苷酶基因已經重組於重組子的基因組。將生長於G418抗性平板的並經過用基因特異引物進行PCR驗證的重組子分別在37°C進行搖瓶發酵2天，用常規方法測定發酵液上清的葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶活性，根據酶活性測定，篩選高表達以上所述的三種酶的重組子作為含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和3-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌。I. 3生產重組混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和P -葡萄糖苷酶將含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和￠-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌接種於LB (I %胰蛋白腖，0. 5 %酵母提取物，1%氯化鈉)液體培養基，分裝成3瓶，在37°C發酵2天；將天然的產葡聚糖內切酶，葡聚糖外切酶和￠-葡萄糖苷酶的木黴(即I. I. 2. 4應用於擴增基因的木黴)接種於常規的真菌培養基(土豆汁200g/L、葡萄糖20g/L)，分裝成3瓶，在30°C發酵3天。離心取上清。分析發酵液上清對羧甲基纖維素的水解作用(表I)。用統計學的差異性對表I的結果進行分析，結果表明含木黴葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和3 -葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌的發酵液上清對纖維素水解生成葡萄糖的作用顯著強於天然的產葡聚糖內切酶，葡聚糖外切酶和3 -葡萄糖苷酶的木黴的發酵液上清對纖維素的作用(P<0.01)。表I.發酵液上清與羧甲基纖維素作用生成葡萄糖含量測定結果
權利要求
1.生產葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法。其特徵在於通過分子生物學技術克隆木黴的葡聚糖內切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β-葡萄糖苷酶基因，構建含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和β -葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌表達載體和畢赤酵母表達載體；將枯草芽孢桿菌表達載體轉化枯草芽孢桿菌從而獲得枯草芽孢桿菌重組子、將畢赤酵母表達載體轉化畢赤酵母從而獲得畢赤酵母重組子；分別篩選高達以上所述的三種酶的枯草芽孢桿菌重組子和畢赤酵母重組子作為含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和β -葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌和畢赤酵母工程菌；用含木黴的葡聚糖內切酶基因表達框架、葡聚糖外切酶基因表達框架和β-葡萄糖苷酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌工程菌和畢赤酵母工程菌生產重組混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β -葡萄糖苷酶。
2.根據權利要求I所述的生產葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法，其特徵在於利用權利要求I所述的生產葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β_葡萄糖苷酶的方法製備重組混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β -葡萄糖苷酶產品。
全文摘要
本發明公開了生產葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的方法。屬生物技術領域。首先克隆木黴的葡聚糖內切酶基因、葡聚糖外切酶基因和β-葡萄糖苷酶基因；構建含這三種酶基因表達框架的枯草芽孢桿菌表達載體和畢赤酵母表達載體；將表達載體轉化相應的宿主菌；分別篩選高表達葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶的枯草芽孢桿菌重組子和畢赤酵母重組子作為工程菌。發酵枯草芽孢桿菌工程菌和畢赤酵母工程菌生產的重組混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶。本發明解決了用天然菌株生產混合葡聚糖內切酶、葡聚糖外切酶和β-葡萄糖苷酶中遺留的酶產量低的關鍵問題，有利於降低其酶產品的價格。
文檔編號C12N9/42GK102719459SQ20121014194
公開日2012年10月10日 申請日期2012年5月2日 優先權日2012年5月2日
發明者張澤華, 張添元, 張愛聯, 易國輝 申請人:中國熱帶農業科學院熱帶生物技術研究所