一類交鏈孢菌生物鹼及其製備方法和用途的製作方法

2024-03-01 08:18:15 1

專利名稱：一類交鏈孢菌生物鹼及其製備方法和用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生物工程及製藥工程技術領域，具體涉及從密葉苔草內生真菌 (Alternariasp.)固體發酵物中提取的一類交鏈孢菌生物鹼及其製備方法與抗腫瘤作用。
背景技術：
植物內生菌是指那些在其生活史的一定或全部階段生活在健康植物的各種組織 內部，且不引起宿主明顯感染症狀的真菌和細菌(包括放線菌)。植物內生菌和宿主之間存 在著互惠共生的關係，它可促進宿主植物的生長，提高宿主抵抗逆境、病原體、以及動物危 害等方面的能力，使宿主植物比一般未感染的植株更具生存競爭力。內生菌由於其獨特的 生境，能夠產生豐富多樣的次生代謝產物，它們常具有新穎的結構和多種生物活性，在農業 和醫藥業都具有重要的應用前景，成為近年來一個研究的熱點。腫瘤是當前危害人類健康的嚴重疾病，其死亡率僅次於心血管疾病而列居第二。 抗癌藥物的研究和開發一直受到科學家們的重視。由於許多化學合成的抗癌藥在殺死腫瘤 細胞的同時對正常細胞的毒副作用非常強，而且治療過程中腫瘤細胞易產生多藥耐藥性而 常導致治療失敗。目前，從天然產物中尋找有效的抗腫瘤藥物已成為國內外重要的研究課 題。

發明內容
本發明需要解決的問題是提供一類具有抗腫瘤作用的交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)；提供一種發酵生產及提取分離交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的方法；提供一種全合成交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的製備方法；本發明的交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)在製備抗腫瘤藥物中的應用。本發明通過下述技術方案予以實現。1交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)，它具有下述結構通式
4
(+) -alternarla ctam R (-)-alt ernarla ctam S其中l，2，3，3a，4，5，5a，6，7，8，9，9a，9b，10為碳原子序數編號，4為氮原子序數編號。2交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的分離方法，它包括下述步驟1)將新鮮的從密葉苔草(Carex maubertiana Boott.)葉片中分離、純化得到的 交鏈孢屬菌菌絲體塊接種到PD培養基(土豆200g，蔗糖20g，蒸餾水1000ml)上(每瓶 300mL)，在旋轉式搖床(28°C，150rpm)振蕩培養6天，2)然後將發酵液接種於400瓶小米固體培養基中，每瓶15mL菌液。接種後的固體 培養基在28°C下靜置培養30天，所得的固體培養物乾燥、磨碎後稱重為2000克，3)將步驟2所得固體培養物用3L的氯仿/甲醇混合溶劑(1 1，V/V)提取5次， 將提取液濃縮，得粗浸膏F1，4)將粗浸膏Fl用適量的甲醇溶解，然後把溶液置於-4°C的冰箱過夜，過濾除去析 出的蠟狀固體，將濾液減壓濃縮，得浸膏F2，5)對浸膏F2進行矽膠柱層析，先用10倍體積的氯仿洗脫，得浸膏F3，6)然後用氯仿/甲醇(體積比100/1)混合溶液繼續對浸膏F2進行洗脫，合併白 色部分洗脫液得白色浸膏F4，7)對浸膏F4，用凝膠柱層析氯仿/甲醇(體積比1/1)得到左旋交鏈孢菌生物鹼 [(-)-alternarlactam]。3交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的合成方法，它包括下述步驟 1)以3，5_ 二甲氧基苯胺為原料，通過兩步反應製得中間體A(2_氨基-4，6_ 二甲 氧基苯甲酸)，2)再以3-甲基環戊酮為原料，通過鄰位氯代然後氧化兩步反應生成中間體 B (4-甲基-1，2-環戊二酮)，3)將中間體A通過重氮化反應生成相應的重氮鹽，再加入中間體B即可生成3環 的內酯C，4)在甲醯胺存在的情況下，通入氨氣，將化合物C轉化為3環內醯胺D，5)再通過對化合物D進行選擇性脫甲基，得外消旋交鏈孢菌生物鹼 [(+)-alternarlactam]，6)對外消旋交鏈孢菌生物鹼[(士)-alternarlactam]，用手性高壓液相色譜法 (手性柱=ChiralpakAD-H column ；流動相甲醇 /二乙醇胺=100/0. 1 (ν/ν)；流速1. Oml/ min)分離得到一對對應異構體左旋交鏈孢菌生物鹼[(J-alternarlactam]和右旋交鏈孢 Iif^fe- [ (+) -alternarlactam]。4本發明的交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)對人類宮頸癌細胞HeLa與人類肝 癌細胞QSG-7701增殖有很強的抑制作用，因此交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)可作為 具有抗腫瘤作用的化合物，在製備抗腫瘤藥物中得到應用。與現有技術相比，本發明有益效果是1.本發明的交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)是新化合物，可以作為具有抗腫 瘤作用的新藥物或先導化合物，克服現有抗腫瘤藥物的耐藥性缺陷。
2.本發明的交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)可以利用化學合成的方法生產， 工藝簡便，周期短，成本低，來源有保證。3.本發明的化學合成交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)對環境無汙染。
具體實施例方式通過下面給出的具體實施例可以進一步了解本發明。但它們不是對本發明的限定。1 [天然交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的分離方法]^HM 1(Carex aridula V. Krecz.) 口十包M (Alternaria sp.) M 菌的分離與純化。剪下苔草葉片，用自來水洗淨後，再將葉片裁成IcmX Icm的小塊，然後用75% 乙醇消毒11^11，用2.5%次氯酸鈉lOmin，接下來用75%乙醇消毒lmin，再用無菌水衝洗 2-3次，接入WA+雙抗培養基的平板上，28°C培養3-15天。待菌體長出後，挑取菌落邊緣 菌絲純化培養，得到苔草葉片真菌。菌落深綠色至黑色，菌絲淡色，生長迅速；分生孢子梗 暗色，單枝，長短不一，頂生不分枝或偶爾分枝的孢子鏈；分生孢子暗色，有縱橫隔膜，倒棍 棒形、橢圓形或卵形，常形成鏈，頂端有喙狀的附屬絲。經宋勇春副教授鑑定為交鏈孢屬 (Alternaria sp. HGl)現保藏在中國典型培養物保藏中心(地址武漢市武昌珞珈山武漢 大學內)，專利菌種保藏編號為CCTCC N0.M2010064，保藏日期為2010年3月27日。實施例2 苔草葉片交鏈孢屬(Alternaria sp.)真菌的固體發酵在PDA平板培養基中活化的苔草葉片交鏈孢屬真菌(Alternaria sp.)的菌絲體 接種於20瓶PD培養基中(每瓶300mL)，在旋轉式搖床(28°C，150rpm)振蕩培養6天，將發 酵液接種於400瓶小米固體培養基中，每瓶15mL菌液。接種後的固體培養基在28 °C下靜置 培養30天。實施例3 交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的提取與分離實施例2中所得的固體培養物乾燥、磨碎後稱重，得2000克固體。將固體培養物 用3 L的氯仿/甲醇混合溶劑(1 1，V/V)提取5次，將提取液濃縮，得粗浸膏F1。將粗 浸膏Fl用適量的甲醇溶解，然後把溶液置於_4°C的冰箱過夜，過濾除去析出的蠟狀固體， 將濾液減壓濃縮，得浸膏F2。對浸膏F2進行矽膠柱層析，先用10倍體積的氯仿洗脫，得浸 膏F3。然後用氯仿/甲醇(體積比100/1)混合溶液洗脫繼續對浸膏F2進行洗脫，合併白 色部分洗脫液得白色浸膏F4。對浸膏F4，用凝膠柱層析氯仿/甲醇(體積比1/1)得到左 旋交鏈孢菌生物鹼[(-)-alternarlactam]。實施例4 交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的結構鑑定交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的結構是基於它的質譜、核磁共振譜等分析 而確定的。光譜學數據如下交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)，白色粉末，熔點234-236 °C ； [a]2D5 = -20.6° (c = 0.04，MeOH) ；UV λ max (MeOH) nm 255，358 ； IR υ max (cm—1) :3383， 3157,3048,1706，1650 (s)，1625，1559，1503，1466，1284，1207,969,841 ；CD λ (MeOH) (nm(A ε )) :355 (_0· 84)，255 (_1· 67) ；ESI-MS m/z 260. 1021 [M+H]+，282. 0844[M+Na]+，
7298. 0140 [M+K]+，541. 2416 [2M+Na]+，800. 3215[3M+Na]+ ；1H、13C 匪R 和 HMBC data 見表 1。表1.交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam) 1H^13C匪R和HMBC的數據(溶劑CDC13) S 單峰，d 雙重峰，dd 四重峰，m 多重峰，br 寬單峰2 [交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的合成方法]實施例6 中間體A(2_氨基-4，6_ 二甲氧基苯甲酸)與中間體B (4-甲基-1，2_環 戊二酮)的合成。12g的3，5-二甲氧基苯胺經過鹽酸酸化後，與20ml草醯氯在165°C反應半小時， 待反應混合物冷卻後加入甲醇。混合物加熱至甲醇沸騰，趁熱過濾，固體用甲醇洗滌，並在 空氣中過夜晾乾，得13g固體。將該固體用33%氫氧化鈉溶解後，在100°C下加入20ml 30% 的雙氧水加熱回流十分鐘，反應放熱並產生大量氣泡。用濃鹽酸將上述混合溶液PH值調至 7 8，醋酸調pH值到5 6，過濾，水洗，即得中間體A (2-氨基-4，6- 二甲氧基苯甲酸)。在25°C下，將4. 9g的3_甲基1，2_環戊酮溶於50ml的二氯甲烷，加入7. 5g磺醯 氯後，逐滴加入甲醇水的混合物(50mmOl/50mmOl)，滴加完畢後，溶液回流2小時，用飽和碳 酸氫鈉洗滌，無水硫酸鈉乾燥，得2-氯-4-甲基-環戊酮4. 7g。將6. 6g的2-氯-4-甲 基_環戊酮加入50ml水中並將溶液加熱至100°C，然後逐滴加入32g的FeCl3 · 6H20(溶於 8ml水)，滴加完畢後，將溶液冷卻至40°C，加入48g的(NH4) 2S04，用二氯甲烷萃取反應液並 用無水硫酸鈉乾燥，得中間體B (4-甲基-1，2-環戊二酮)4. 6g。實施例7 3環的內酯C的合成將2. 4g的中間體A (2-氨基_4，6_ 二甲氧基苯甲酸)溶於3. 6ml水和3. 6ml濃鹽 酸的混合溶液，在0°c下向溶液中緩慢滴加1. 26g的亞硝酸鈉水溶液(5ml)，繼續攪拌20分 鍾至室溫。將5g的中間體B(4-甲基-1，2-環戊二酮)加入反應體系，50°C攪拌12小時， 冷卻至室溫，加水，用二氯甲烷萃取3次後，合併有機相濃縮，所得固體經過矽膠柱(CHCl3/ MeOH, 100 1)純化後，得到1. 68g的3環的內酯C。
實施例8 交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的合成將0. 55g的3環的內酯C溶於IOml甲醯胺中，在90°C下持續通入氨氣，2小時 候，冷卻至室溫，反應液減壓濃縮後用凝膠柱(CHCl3/MeOH，l 1)純化得230mg的3環 內醯胺D。在氮氣保護環境下，將30mg的3環內醯胺D溶於2ml的二氯甲烷，在0°C向 溶液中緩慢滴加150mg的三溴化硼，攪拌1小時後，用5ml的2M的NaOH終止反應，加入 IM的HCl至反應液變黃後，用乙酸乙酯萃取，減壓濃縮，用凝膠柱(Me0H/H20，l 1)純 化得外消旋交鏈孢菌生物鹼[(士)-alternarlactam] 24mg。對外消旋交鏈孢菌生物鹼 [(士)-alternarlactam]，用手性高壓液相色譜法(手性柱ChiralpakAD_H column ；流動 相甲醇/ 二乙醇胺=100/0. 1 (ν/ν)；流速1.0mL/min)分離得到一對對應異構體左旋交 鏈孢菌生物鹼[(_)-alternarlactam]和右旋交鏈孢菌生物鹼[(+)-alternarlactam]。3MTT法測定交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)抗腫瘤活性1)抗腫瘤活性取人類宮頸癌細胞HeLa與人類肝癌細胞QSG-7701，置於盛有5mL、RPMI1640培養 基的培養皿中，使細胞進入溶液並分散成單個細胞，收集指數生長期的測試細胞，計數，調 成5 X 105cells/mL,細胞存活率大於99%。取5 X 105cells/well置96孔培養板中，培養24小時後，加入不同濃度的供試化合 物，同時設空白及陽性對照，置37°C，培養48小時。終止培養前4h加入5mg/mL 3-4,5- 二 甲基-2-噻唑-2，5- 二苯基溴化四唑(MTT) IOyL,4小時後吸去上清，每孔加入150 μ L 二 甲亞碸，震蕩，待完全溶解後在酶聯免疫測定儀上於570nm測吸光度。所有實驗均設三次重
Μ. ο2)細胞生長抑制率計算方法抗腫瘤活性，採用下列公式計算細胞生長抑制率。生長抑制率=(1-用藥組平均OD值/對照組平均OD值)X 100%然後根據不同藥物濃度的生長抑制率計算出藥物的半數抑制濃度(IC5tl)。抗腫瘤活性測試結果(表2)表明(_)-交鏈孢菌生物鹼[㈠-alternarlactam] 抗腫瘤活性的IC5tl均小於1. 6 μ g/mL，可與陽性對照鹽酸阿黴素相比較。表2.交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)的抗腫瘤作用 以上結果提示，交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)具有很強的抗腫瘤活性，因此 本發明的交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)可製備成抗腫瘤藥物。
權利要求
一種交鏈孢菌，其特徵是由苔草葉片分離純化獲得。菌落深綠色至黑色，菌絲淡色，生長迅速；分生孢子梗暗色，單枝，長短不一，頂生不分枝或偶爾分枝的孢子鏈；分生孢子暗色，有縱橫隔膜，倒棍棒形、橢圓形或卵形，常形成鏈，頂端有喙狀的附屬絲。經宋勇春副教授鑑定為交鏈孢屬，現保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏地址武漢市武昌珞珈山武漢大學內，專利菌種保藏編號為CCTCC NO.M 2010064，保藏日期為2010年3月27日。
2.根據權利要求1所述交鏈孢菌製備的交鏈孢菌生物鹼，其特徵是具有下述結構通式 其中1，2，3，3￡1，4，5，5￡1，6，7，8，9，9￡1，％，10為碳原子序數編號，4為氮原子序數編號。
3.根據權利要求2所述交鏈孢菌生物鹼的製備方法，其特徵是在PDA平板培養基中活化的苔草葉片交鏈孢屬真菌的菌絲體接種於20瓶PD培養基中 每瓶300mL，在28°C、150rpm旋轉式搖床上振蕩培養6天，將發酵液接種於400瓶小米固體 培養基中，每瓶15mL菌液，接種後的固體培養基在28°C下靜置培養30天；所得的固體培養 物乾燥、磨碎後稱重，得2000克固體；將固體培養物用3L的氯仿/甲醇混合溶劑，體積比 1 1，提取5次，將提取液濃縮，得粗浸膏Fl ；將粗浸膏Fl用適量的甲醇溶解，然後把溶液 置於_4°C的冰箱過夜，過濾除去析出的蠟狀固體，將濾液減壓濃縮，得浸膏F2 ；對浸膏F2進 行矽膠柱層析，先用10倍體積的氯仿洗脫，得浸膏F3 ；然後用體積比為100/1的氯仿/甲 醇混合溶液繼續對浸膏F2進行洗脫，合併白色部分洗脫液得白色浸膏F4 ；對浸膏F4，用體 積比1/1的氯仿/甲醇凝膠柱層析得到左旋交鏈孢菌生物鹼。
4.根據權利要求2所述交鏈孢菌生物鹼的化學合成方法，其特徵是由以下步驟構成1)以3，5-二甲氧基苯胺為原料，通過兩步反應製得中間體A :2_氨基-4，6- 二甲氧基 苯甲酸，2)再以3-甲基環戊酮為原料，通過鄰位氯代然後氧化兩步反應生成中間體B:4_甲 基-1，2-環戊二酮，3)將中間體A通過重氮化反應生成相應的重氮鹽，再加入中間體B即可生成3環的內酯C，4)在甲醯胺存在的情況下，通入氨氣，將化合物C轉化為3環內醯胺D，5)再通過對化合物D進行選擇性脫甲基，得外消旋化合物交鏈孢菌生物鹼 [(+)-alternarlactam]，6)對浸外消旋交鏈孢菌生物鹼[(士Palternarlactam]，用手性高壓液相色譜法，手 性柱=Chiralpak AD-H column ；流動相甲醇/ 二乙醇胺體積比為100/0. 1，流速1. OmL/ min分離得到一對對應異構體左旋交鏈孢菌生物鹼[(J-alternarlactam]和右旋交鏈孢 Iif^fe- [ (+) -alternarlactam]。
5.根據權利要求2所述的交鏈孢菌生物鹼在製備抗腫瘤藥物中的應用。
全文摘要
本發明屬於微生物工程及製藥工程技術領域，具體涉及從密葉苔草內生真菌(Alternaria sp.)固體發酵物中提取的一類交鏈孢菌生物鹼及其製備方法與抗腫瘤作用。這種交鏈孢菌生物鹼(alternarlactam)，可採用固體發酵和化學合成兩種方法製備。交鏈孢菌生物鹼對人類宮頸癌細胞HeLa與人類肝癌細胞QSG-7701增殖有很強的抑制作用，因此交鏈孢菌生物鹼可作為具有抗腫瘤作用的化合物，並在製備抗腫瘤藥物中得到應用。
文檔編號C07D221/16GK101921711SQ20101018042
公開日2010年12月22日 申請日期2010年5月24日 優先權日2010年5月24日
發明者宋勇春, 張愛華, 王玉蓉, 胥蘇海, 譚仁祥, 谷文 申請人:南京大學