一種全人工培養冬蟲夏草的方法

2024-03-05 06:18:15

專利名稱：一種全人工培養冬蟲夏草的方法
技術領域：
本發明涉及冬蟲夏草的全人工培養領域。
背景技術：
冬蟲夏草是一種名貴的菌類中藥材，是中國被毛孢侵染只生長在3500-5000公尺 高寒灌叢草甸的蝙蝠蛾幼蟲產生的有性型。冬蟲夏草主要分布於我國西南、西北3500公尺 以上的高原，主要產區是四川、青海、西藏及雲貴高原。夏初子座出土、孢子未散發時挖取， 除去包裹在蟲體外的菌絲體乾燥。由於產區局限、產量稀少，國內外的需求量日益增大，刺 激亂採濫挖，生態破壞嚴重，致使冬蟲夏草產量急劇下降，價格直線上升，供求矛盾突出。全人工培育冬蟲夏草是解決上述問題的方法之一。目前報導的全人工培養冬蟲夏 草的文獻有申請號200410021927.X，授權公告號CN1312271C，發明名稱冬蟲夏草的全 人工培養方法，申請日2005年1月5日的發明專利中公開了一種冬蟲夏草的全人工冬蟲 夏草的方法，其步驟為a，取樣取冬蟲夏草樣本(Cordyceps sinensis (Berk.) Sacc.)；b，菌種分離分別取冬蟲夏草的菌核部分、子座部分及子囊孢子進行分離、培養得 中國被毛孢(Hiesutella Sinensis Liu, Guo, Yu et Zeng.)，保藏號 CCTCC No. M871010 ； 菌種分離是將菌核、子座部分經表面消毒、無菌水衝洗後，將菌核及子座切成小段或薄片， 或挑取子囊孢子置有分離培養基的培養皿中，在8°C 20°C進行分離、培養；所述的分離培 養基為馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蛋白腖、水或者馬鈴薯、葡萄糖、瓊脂、蠶蛹汁、水；c，寄主昆蟲採集、繁殖和飼養寄主蝠蛾H印ialus Spp.幼蟲首次採自海拔 3500 5000公尺的高寒灌叢草甸，在人工條件下經過化蛹、羽化為成蟲、交尾、產卵，孵化、 幼蟲飼養循環進行；具體步驟為①寄主昆蟲的採集寄主蝠蛾幼蟲首次採自海拔3500 5000公尺的高寒灌叢草 甸；②化蛹化蛹期溫度為10°C 18°C，溼度45% 60%，蛹的歷期20 50天；③羽化蛹的羽化溫度10°C 18°C，羽化的空氣相對溼度為80% 100% ；④成蟲、交尾羽化後的成蟲即可交尾，通過人為幫助提高交尾率；⑤產卵交尾後的雌成蟲即行產卵，收集卵粒置容器養護；⑥孵化在10 18°C，相對溼度60 90%的條件下，經20 55天即孵化；⑦幼蟲飼養幼蟲飼養溫度8 18°C，溼度40 50% ；d，侵染將b步驟所得的菌絲體、分生孢子製成混懸液，侵染c步驟繁殖的蝠蛾幼 蟲；e，繼續飼養將d步驟經侵染後的幼蟲繼續飼養至呆滯狀態，經低溫4 8°C，光 照處理，至長出子實體，即得人工培養的冬蟲夏草。該方法可以實現冬蟲夏草的全人工培育，但是，使用該培育方法仍有許多不足之處蝠蛾蛹不當死亡率高、羽化率低；用於侵染的混懸液孢子含量低，不利於侵染；侵染方 法機械化操作程度有待提高，侵染率較低，侵染後至幼蟲僵化的時間較長，僵化幼蟲長原基 的時間參差不齊，工業化效率有待進一步提高。由於平原人工飼養寄主蝠蛾幼蟲難度較大、中國被毛孢遺傳育種和侵染方法等原 因使得冬蟲夏草不能產業化，不能滿足市場對冬蟲夏草的需求。

發明內容
為了解決人工培育冬蟲夏草產量低的問題，本發明提供了一種新的全人工培育冬 蟲夏草的技術方案。本發明提供的新的全人工培育冬蟲夏草的技術方案為一種冬蟲夏草的全人工培 養方法，包括下列步驟 a、中國被毛孢混懸液的製備取保藏號為CCTCC No. M87101的中國被毛孢 Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，製備菌體和孢子的混懸液;b、寄主昆蟲的採集、繁殖和飼養首次採集不同產地的冬蟲夏草寄主蝠蛾蛹；在 人工條件下，對寄主蝠蛾進行蛹的養護、羽化、交尾、產卵、卵的養護、孵化、幼蟲飼養，且循 環進行；c、侵染取步驟b所述的蝠蛾幼蟲，用一端直徑小於0. 2mm的針狀器具沾取步驟a 的混懸液刺中蝠蛾幼蟲完成侵染；d、繼續飼養將步驟c經侵染後的幼蟲繼續飼養至僵化，經低溫4 8°C，光照處 理，長出子實體，直至子實體抽生到3 5釐米長度，收穫，乾燥處理，即得冬蟲夏草。步驟a所述的製備菌體、孢子的混懸液的方法，包括下列步驟①，取保藏號為CCTCC No. M87101 的中國被毛孢 Hirsutella Sinensis Liu,Guo, Yu et Zeng.依次進行斜面培養、液體振蕩培養和種子發酵罐液體發酵培養，得到菌液；②，將所得菌液中的菌絲體搗碎，用50-100目濾網濾過，濾液即為菌體和孢子的 混懸液，所述混懸液至少含有IO3個/ml孢子。前述步驟①的斜面培養、液體振蕩培養和種子發酵罐液體發酵培養的培養基每 IOOOml中含有碳源20g 50g,氮源IOg 45g，磷酸二氫鉀1. Og,硫酸鎂0. 5g，水IOOOml ； 所述碳源為葡萄糖、蔗糖或者葡萄糖和蔗糖，氮源為牛肉膏、蛋白腖、酵母粉、蠶蛹粉中的一 種或者兩種以上的配合。步驟b中所述蛹的養護和羽化溫度為10_18°C，相對溼度為70-95% ；步驟b中所 述蛹的養護過程採用養護床，所述養護床為透氣隔離裝置；步驟b中所述交尾過程採用交 尾帳，其由網眼布製成，體積為IM3 6M3。步驟c中的針狀器具是一端直徑小於0. 2mm的不鏽鋼實心針或空心針；步驟c中 刺中蝠蛾幼蟲的部位為蝠蛾幼蟲尾部背線或近尾部背線。與現有技術相比，本發明提供的全人工培養冬蟲夏草的方法在寄主蝠蛾蛹的養 護、中國被毛孢的培養和中國被毛孢對寄主蝠蛾侵染這三個步驟均有改進。本發明提供的 方法可以降低蝠蛾蛹的不當死亡率，提高蝠蛾蛹的羽化率，現有文獻中報導的蝠蛾蛹的不 當死亡率為60%左右，而本發明蝠蛾蛹的成活率達到80% ；提高蝠蛾交尾率，由40%左右 提高到85%以上；大幅度的提高中國被毛孢對寄主蝠蛾幼蟲的侵染率，使侵染率從60%提高到80-90%，縮短侵染後幼蟲僵化的時間。本發明提供的全人工培養冬蟲夏草的方法可以實現冬蟲夏草的大規模、產業化生產。以下通過實施例形式的具體實施方式
，對本發明的上述內容作進一步的詳細說 明。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於以下的實施例。凡基於本發明上述內 容所實現的技術均屬於本發明的範圍。
具體實施例方式實施例1冬蟲夏草的全人工培養方法一、寄主蝠蛾幼蟲飼養1)、蛹的採集寄主蝠蛾蛹首次採自海拔3500 5000公尺的草原；2)、蛹的養護和羽化採集的蝠蛾蛹置於養護床中養護，該養護床是由網眼布或者 紗網製備的裝置，其具有隔離作用，與外界通氣不密封，防止外界的寄生蜂等天敵進入，容 易控制蛹養護的溫度和溼度，防止羽化後的成蟲到處飛舞，其內部可以安裝溫度和溼度檢 測儀。控制養護溫度到10 18°C，養護床內的相對溼度調節到70 95%，養護30 60 天后蛹羽化；3)、交尾待羽化後成蟲逐漸展翅，將養護床內羽化的成蟲轉移到交尾帳內交尾， 該交尾帳由網眼布製成，且體積為IM3 6M3 ；4)、產卵交尾後的雌成蟲即行產卵，收集卵粒置容器養護；5)、卵的養護受精卵在孵化容器中保持8 15°C溫度下保溼，相對溼度為60 90% ；6)、孵化相對溼度為60 90%，溫度為8 15°C，卵期20 45天；7)、幼蟲飼養溫度為8 20°C，相對溼度60 90%。在不使用養護床的情況下，蝠蛾蛹的不當死亡率為60%左右，而使用本發明養護 床的情況下，蛹的存活率達到80%以上，成蟲交尾率由40%以下提高到85%以上。二、中國被毛孢培養1)取中國被毛孢 Hirsutella Sinensis Liu, Guo, Yu et Zeng.，保藏號為 CCTCC Νο·Μ87101。2)培養將中國被毛孢Hirsutella Sinensis Liu,Guo,Yu et Zeng.按照下述條件依次進 行斜面培養、液體振蕩培養和種子發酵罐液體發酵培養，得到菌液。a，斜面培養。培養基(每1000ml):葡萄糖10g，蔗糖30g，牛肉膏5g，蛋白腖10g， 蠶蛹汁20g，酵母粉10g，瓊脂20g，磷酸二氫鉀1. 0，硫酸鎂0. 5g，水1000ml。培養條件=PH 6. 5，溫度10 20°C，培養時間10 30天；b，液體振蕩培養。培養基(每1000ml):葡萄糖10g，蔗糖30g，牛肉膏，5g，酵母粉 10g，蠶蛹汁，20g，磷酸二氫鉀1.(^，硫酸鎂0.58，水1000ml。培養條件PH 6.0 7.0，搖 床100 200rpm，15 20°C，培養時間7 15天；c，種子發酵罐液體發酵培養。培養基每(1000ml)葡萄糖10g，蔗糖20g，麥皮汁 20g，酵母粉10g，蠶蛹汁30g，磷酸二氫鉀1. 0g，硫酸鎂0. 5g，水1000ml。培養條件:ΡΗ6· 5，培養溫度15 20°C，通氣量1 1(V/V)，接種量5 20%，培養時間7 15天。3)將所得菌液中的菌絲體搗碎，用50 100目濾網濾過，濾液即為菌體和孢子的 混懸液。用現有技術公開的方法製備得到的菌體和孢子的混懸液含有的孢子少，而用上述 方法製備得到的菌體合孢子的混懸液含有的孢子多。菌體和孢子的混懸液中含有的孢子越 多，其對蝠蛾幼蟲的侵染率越高，因此，上述製備菌體和孢子的混懸液的方法更有利於中國 被毛孢對蝠蛾幼蟲的侵染。三、中國被毛孢對蝠蛾幼蟲的侵染取培養得到的中國被毛孢混懸液，用針尖直徑小於0. 2mm的不鏽鋼空心針或者實 心針沾取混懸液針刺蝠蛾幼蟲，完成侵染。針剌蝠蛾幼蟲的尾部流出的體液少，死亡率低，侵染率和產座率高。本發明侵染方法突破表皮屏障直接把中國被毛孢菌體帶入寄主體內，大量的中國 被毛孢菌絲段，分生孢子湧入幼蟲體內，直接破壞了寄主的免疫系統，比中國被毛孢一個個 孢子和菌絲段芽管侵染表皮具有巨大的侵染優勢。大幅度的提高了侵染率，使侵染率從 60%以下提高到80 90%，使冬蟲夏草的工業化生產效率大幅度提高。四、繼續飼養將步驟三侵染後的幼蟲繼續飼養至僵化，飼養溫度8 20°C，相對溼度60 90% ；幼蟲僵化後，經低溫4 8°C，光照處理，長出子實體，直至子實體抽生到3 5釐米 長度，進行收穫，乾燥處理。綜上，本發明提供的冬蟲夏草的全人工培養方法可以實現冬蟲夏草的大規模、產 業化生產，進一步滿足市場對冬蟲夏草的需求。
權利要求
1.一種冬蟲夏草的全人工培養方法，其特徵在於包括下列步驟a、中國被毛孢混懸液的製備取保藏號為CCTCCNO.M87101的中國被毛孢Hirsutella Sinensis Liu，Guo，Yu et Zeng.，製備菌體和孢子的混懸液;b、寄主昆蟲的採集、繁殖和飼養首次採集不同產地的冬蟲夏草寄主蝠蛾蛹；在人工 條件下，對寄主蝠蛾進行蛹的養護、羽化、交尾、產卵、卵的養護、孵化、幼蟲飼養，且循環進 行；C、侵染取步驟b所述的蝠蛾幼蟲，用一端直徑小於0. 2mm的針狀器具沾取步驟a的混 懸液刺中蝠蛾幼蟲完成侵染；d、繼續飼養將步驟c經侵染後的幼蟲繼續飼養至僵化，經低溫4 8°C，光照處理，長 出子實體，直至子實體抽生到3 5釐米長度，收穫，乾燥處理，即得冬蟲夏草。
2.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特徵在於步驟a所述的制 備菌體、孢子的混懸液的方法，包括下列步驟①，取保藏號為CCTCC No. M87101 的中國被毛孢Hirsutella Sinensis Liu,Guo, Yu et Zeng.依次進行斜面培養、液體振蕩培養和種子發酵罐液體發酵培養，得到菌液；②，將所得菌液中的菌絲體搗碎，用50-100目濾網濾過，濾液即為菌體和孢子的混懸 液，所述混懸液至少含有IO3個/ml孢子。
3.根據權利要求2所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特徵在於步驟①所述的斜 面培養、液體振蕩培養和種子發酵罐液體發酵培養的培養基每IOOOml中含有碳源20g 50g,氮源IOg 45g，磷酸二氫鉀1. Og,硫酸鎂0. 5g，水IOOOml。
4.根據權利要求3所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特徵在於所述的碳源為葡 萄糖、蔗糖或者葡萄糖和蔗糖；所述的氮源為牛肉膏、蛋白腖、酵母粉、蠶蛹粉中的一種或者 兩種以上的配合。
5.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特徵在於步驟b中所述蛹 的養護和羽化溫度為10-18°C，相對溼度為70-95%。
6.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特徵在於步驟b中所述蛹 的養護過程採用養護床，所述養護床為透氣隔離裝置。
7.根據權利要求1所述的全人工培養方法，其特徵在於，步驟b中所述交尾過程採用交 尾帳，其由網眼布製成，體積為IM3 6M3。
8.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特徵在於所述步驟c中的 針狀器具是一端直徑小於0. 2mm的不鏽鋼實心針或空心針。
9.根據權利要求1所述的冬蟲夏草的全人工培養方法，其特徵在於所述的步驟c中 刺中蝠蛾幼蟲的部位為蝠蛾幼蟲尾部背線或近尾部背線。
全文摘要
一種全人工培養冬蟲夏草的方法，本發明涉及冬蟲夏草的全人工培養領域。本發明提供了一種冬蟲夏草的全人工培養方法，包括下列步驟a，中國被毛孢混懸液的製備；b，寄主昆蟲的採集、繁殖和飼養；c，侵染取步驟b得到的蝠蛾幼蟲，用一端直徑小於0.2mm的針狀器具沾取步驟a的混懸液刺中蝠蛾幼蟲完成侵染；d，繼續飼養。本發明提供的方法可以降低蝠蛾蛹的不當死亡率，提高蝠蛾蛹的羽化率；提高蝠蛾的交尾率；大幅度的提高中國被毛孢對寄主蝠蛾幼蟲的侵染率，實現全人工冬蟲夏草的產業化生產。
文檔編號A01G1/04GK102106235SQ201010604460
公開日2011年6月29日 申請日期2010年12月24日 優先權日2010年12月24日
發明者王梅平 申請人:王梅平