飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺及其合成方法和應用的製作方法

2024-03-04 23:49:15

專利名稱：飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺及其合成方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及飽和脂肪鏈酸三肽醯胺，尤其涉及一系列具有免疫抑制活性的飽和脂 肪鏈酸HiS-Gly-AA三肽醯胺，還涉及這些飽和脂肪鏈酸三肽醯胺的製備方法以及它們作 為免疫抑制劑的應用，屬於生物醫藥領域。
背景技術：
據統計，截至2002年底，全球共進行各種器官移植935792例次，其中腎移植 585877例次、肝臟移植112153例次、心臟移植66559例次。此外，胰、肺、小腸等器官移植 及心_肺、胰-腎、肝-腎、肝-腸等多臟器聯合移植也都獲得成功並應用於臨床。目前，腎 移植1年人/腎存活率達90 % 95 %，5年存活率超過70 %。臟器移植要形成移植耐受， 這就要求患者終身服用免疫抑制劑。器官移植的進展在很大程度上取決於免疫抑制劑的進 展。近幾十年，雖然新免疫抑制藥物使得器官移植在臨床取突飛猛進發展，但它們的毒副作 用，例如腎毒性和骨髓抑制作用仍然是器官移植造必須面對的嚴重問題。環孢菌素A是目前臨床常用的免疫抑制劑。由於環孢菌素A的水溶性極差以及腎 毒性很強，所以無論是劑型還是療效都不盡人意。提高環孢菌素A製劑的水溶性，降低環孢 菌素A的腎毒性，一直是環孢菌素A研究的熱點。尿毒素肽具有免疫抑制活性。發明人認 識到，把尿毒素肽與脂肪鏈酸綴合生成的醯胺具有自組裝性能，因而可以用作具有免疫抑 制活性的載藥材料。例如可以用來包裹環孢菌素A，達到提高環孢菌素A的水溶性和降低環 孢菌素A腎毒性的雙重目的。

發明內容
本發明的目的之一是，將尿毒素三肽與脂肪鏈酸綴合，得到具有免疫抑制活性的 飽和脂肪鏈酸三肽醯胺綴合物。本發明的目的之一是通過以下技術方案實現的通式I的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺CH3(CH2)n-CO-His-Gly-AA I其中，通式I 中的 AA 為 Glu 或 Lys，n 為 6、8、10、12、14 或 16。本發明的目的之二是，提供一種製備上述具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸 His-Gly-AA三肽醯胺的方法。本發明的目的之二是通過以下技術方案來實現的一種製備通式I的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺 的方法，該方法包括(1)按照現有液相合成技術，通過逐步接肽合成的His-Gly-AA的保護中間體，其 中AA為穀氨酸或賴氨酸；(2)脫去His-Gly-AA的保護中間體的N端保護基；(3)將C端保護基保護的His-Gly-AA中間體與飽和脂肪酸縮合，所述飽和脂肪酸為 CH3 (CH2)nCOOH, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(4)脫去C端保護基得到目標化合物。其中所述N端保護基是對多肽的N端進行保護時常用的保護基團，例如可以是叔 丁氧羰基(Boc)，苄氧羰基(Z)；所述C端保護基是對多肽的C端進行保護時常用的保護基 團，例如可以是苄氧基(OBzl)；所述液相合成技術及所述保護、縮合、脫保護的過程是本領 域的常規並公知的技術。當AA為Glu時，所述飽和脂肪酸三肽綴合物的製備方法可以用圖1的路線概括， 具體的，所述方法包括(1)在(Boc)2O和NaOH存在下將甘氨酸轉化為N-叔丁氧羰基甘氨酸；(2)在(Boc)2O和三乙胺存在下將組氨酸轉化為N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰 基_組氨酸；(3)在DCC、H0Bt、無水THF存在下將Y -苄酯-穀氨酸苄酯與N-叔丁氧羰基甘氨 酸縮合，生成N-叔丁氧羰基甘氨醯Y _苄酯-穀氨酸苄酯；(4)在氯化氫-乙酸乙酯中將N-叔丁氧羰基甘氨醯Y-苄酯-穀氨酸苄酯脫除叔 丁氧羰保護基，生成甘氨醯Y _苄酯-穀氨酸苄酯；(5)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將甘氨醯Y _苄酯-穀氨酸苄酯與N-叔 丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基_組氨酸縮合，生成N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基_組氨醯甘 氨醯Y-苄酯-穀氨酸苄酯；(6)在氯化氫-乙酸乙酯存在下將N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基_組氨醯甘氨 醯Y _苄酯_穀氨酸苄酯脫除叔丁氧羰基生成組氨醯甘氨醯Y _苄酯-穀氨酸苄酯；(7)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將組氨醯甘氨醯Y _苄酯-穀氨酸苄酯 與飽和脂肪酸縮合，生成飽和脂肪酸醯組氨醯甘氨醯Y _苄酯-穀氨酸苄酯；(8)在無水乙醇中，在Pd/C存在下將組氨醯甘氨醯Y-苄酯-穀氨酸苄酯氫解，生 成飽和脂肪酸醯組氨醯甘氨醯穀氨酸。當AA為Lys時，所述飽和脂肪醇三肽綴合物的製備方法可以用圖2的路線概括， 具體的，所述方法包括(1)在(Boc) 20和NaOH存在下將甘氨酸轉化為N-叔丁氧羰基甘氨酸；(2)在(Boc)2O和三乙胺存在下將組氨酸轉化為N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰 基_組氨酸；(3)在DCC、H0Bt、無水THF存在下將Ne -苄氧羰基賴氨酸苄酯與N-叔丁氧羰基甘 氨酸縮合，生成N-叔丁氧羰基甘氨醯Ne -苄氧羰基賴氨酸苄酯；(4)在氯化氫_乙酸乙酯中將N-叔丁氧羰基甘氨醯Ne -苄氧羰基賴氨酸苄酯脫 除叔丁氧羰保護基，生成甘氨醯Ne -苄氧羰基賴氨酸苄酯；(5)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將甘氨醯Ne-苄氧羰基賴氨酸苄酯與 N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基-組氨酸縮合，生成N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基-組 氨醯甘氨醯Nε-苄氧羰基賴氨酸苄酯；(6)在氯化氫-乙酸乙酯存在下將N-叔丁氧羰基-Nim-叔丁氧羰基_組氨醯甘氨醯 Ne-苄氧羰基賴氨酸苄酯脫除叔丁氧羰基，生成組氨醯甘氨醯Ne-苄氧羰基賴氨酸苄酯；(7)在無水THF中，在DCC和HOBt存在下將組氨醯甘氨醯Nε -苄氧羰基賴氨酸苄酯與飽和脂肪酸縮合，生成飽和脂肪酸醯組氨醯甘氨醯N、苄氧羰基賴氨酸苄酯；(8)在無水乙醇中，在Pd/C存在下將脂肪酸醯組氨醯甘氨醯Νε _苄氧羰基賴氨酸 苄酯氫解，生成飽和脂肪酸醯組氨醯甘氨醯賴氨酸。實驗結果表明本發明的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽 醯胺具有優秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應用。並且本發明的飽和脂肪鏈 酸His-Gly-AA三肽醯胺水溶液中均能自組裝成粒經穩定在113-4720nm的納米球，可作為 製備微乳或脂質體藥物載體的製劑材料，另外可作為製備微乳、脂質體藥物載體的靶向制 劑材料。


圖1為當通式I中AA為Glu時6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸 His-Gly-Glu三肽醯胺綴合物的合成路線。i)無水THF、DCC、H0Bt和NMM ;ii) 4N氯化氫-乙 酸乙酯溶液；iii)無水乙醇、Pd/C 禾口 H2 ；6a η = 6,6b η = 8,6c η = 10，6d η = 12，6e η =14,6f η = 16。圖2為當通式I中AA為Lys時6種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸 His-Gly-Lys三肽醯胺綴合物的合成路線。i)無水THF、DCC、H0Bt和NMM ;ii) 4N氯化氫-乙 酸乙酯溶液；iii)無水乙醇、Pd/C 和 H2 ；12a η = 6,12b η = 8，12c η = 10，12d η = 12， 12e η = 14，12f η = 16。為了進一步闡述本發明，下面給出一系列實施例。這些實施例完全是例證性的，它 們僅用來對本發明進行具體描述，不應當理解為對本發明的限制。
具體實施例方式實施例1 製備 Boc-Gly-Glu (OBzl) -OBzl將3. 50g (20. OOmmo 1) Boc-Gly溶於200ml無水THF，冰浴下向得到的溶液中 加入2. 72g (20. OOmmol) N-羥基苯並三氮唑(HOBt)，並使其完全溶解。10分鐘後加 入4. 96g (24. OOmmol) 二環己基碳二亞胺(DCC)。得到反應液(I)，待用。冰浴下把 10. 38g(20. OOmmol) TosH · Glu (OBzl)-OBzl 懸浮於 20ml 無水 THF 中，然後加入 Iml N-甲 基嗎啉(NMM)JfpH 8-9。攪拌35分鐘，得到反應液(II)，待用。冰浴下把反應液(I)加 入反應液(II)中，冰浴條件下攪拌lh，再室溫攪拌12h，TLC(氯仿/甲醇，10 1)顯示 Boc-Gly-OH消失。濾除二環己基脲(D⑶)，減壓除去THF。殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。 得到的溶液依次用飽和NaHCO3水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和飽和 NaCl水溶液洗。有機相用無水Na2SO4乾燥、過濾、濾液減壓濃縮至幹，得到8.91g(92%)標 題化合物，為米黃色油狀物。ESI-MS(m/z) :485[M+H] +。實施例2 製備 HCl · Gly-Glu(OBzl)-OBzl將8. 91g(18. 38mmol)Boc-Gly-Glu(OBzl)-OBzl 溶解在 200ml 4mol/l 氯化氫-乙 酸乙酯溶液中，室溫攪拌2小時，TLC(氯仿甲醇，5 1)顯示原料點消失，減壓濃縮除去 乙酸乙酯，殘留物反覆加少量乙醚進行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最後加少量乙醚將殘留 物研磨成6. 94g(90% )標題化合物，為無色固體粉末，直接用於下一步反應。ESI-MS (m/z) 385[M+H]+。
5
實施例3 製備 Boc-His (Boc) -Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實施例1 的方法由 5. 42g (7. 63mmol) Boc-His (Boc)和 6. 94g (15. 26mmol) HCl · Gly-Glu(OBzl)-OBzl得米黃色油狀物。所得化合物經矽膠柱層析純化得無色油狀 物目標8. 24g，純化條件氯仿甲醇=100 1，收率為75%。ESI-MS(m/z) :722[M+H]+， [α ]20d = -25. 2 (c = 1· 0，CH3OH)。實施例4 製備 HCl · His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實施例2 的方法 8. 24g(ll. 42mmol)Boc-His (Boc) -Gly-Glu (OBzl) -OBzl 製得 6. 05g(95% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :522[M+H] +。實施例5 製備 CH3 (CH2) 6C0-His-Gly-Glu (OBzl)-OBzl按照實施例1 的方法由 0. 26g(l. 79mmol)CH3(CH2)6CO2H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析 純化得無色固體粉末846mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為73%。ESI-MS (m/z) 648 [M+H]+，[a J20d = -7. 2 (c = 1. O, CH3OH)，Μ. p. 65. 3-65. 8 "C。實施例6 製備 CH3 (CH2)8CO-His-Gly-Glu (OBzl)-OBzl按照實施例1 的方法由 0. 31g(l. 79mmol)CH3(CH2)8CO2H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析 純化得無色固體粉末810mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為67%。ESI_MS(m/Z) 676 [M+H]+，[a J20d = -4. 5 (c = 1. O, CH3OH)，Μ. p. 67. 2-68. 9 "C。實施例7 製備 CH3 (CH2) 10CO-HiS-Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實施例1 的方法由 0. 36g(l. 79mmol)CH3(CH2) 10C02H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl 'His-Gly-Glu (OBzl)-OBzl製得標題化合物，為淡黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析 純化得無色固體粉末868mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為69%。ESI-MS (m/z) 704 [M+H]+，[a J20d = -9. 7 (c = 1. 0, CH3OH)，Μ. p. 68. 9-70. 4 "C。實施例8 製備 CH3 (CH2) 12C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實施例1 的方法由 0. 41g(l. 79mmol)CH3(CH2) 12C02H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析 純化得無色固體粉末955mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為73%。ESI_MS(m/Z) 732 [M+H]+，[a J20d = -3. 2 (c = 1. 0, CH3OH)，Μ. p. 68. 9-69. 9°C。實施例9 製備 CH3 (CH2) 14C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實施例1 的方法由 0. 44g(l. 7ImmoDCH3(CH2)14CO2H 和 1. OOg(1. 71mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析 純化得無色固體粉末802mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為59%。ESI-MS (m/z) 760 [M+H]+，[a J20d = -12. 5 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 71. 5-72. 9 "C。實施例10 製備 CH3 (CH2) 16C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl按照實施例1 的方法由 0. 51g(l. 79mmol)CH3(CH2)16CO2H 和 1. OOg(1. 79mmol) HCl · His-Gly-Glu(OBzl)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析 純化得無色固體粉末874mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為62%。ESI-MS (m/z) 788 [M+H]+，[a J20d = -20. 9 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 71. 5-73. 4°C。實施例11 製備 CH3 (CH2)6CO-His-Gly-Glu (6a)
將700mg(l. 08mmol) CH3 (CH2) 6C0-His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置於 IOOml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加35mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得444mg(88% )標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :465[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -3. 0 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 126. 0—127. 8°C。實施例12 製備 CH3 (CH2)8CO-His-Gly-Glu (6b)將800mg(l. 19mmol) CH3 (CH2) 8C0-His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加40mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得462mg(79% )標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :493[Μ-ΗΓ ;[α ]20D =-8. l(cl，CH3OH) ；Μ. p. 119. 5—120. 5°C。實施例13 製備 CH3 (CH2) 10CO-His-Gly-Glu (6c)將800mg (1. 14mmol) CH3 (CH2) 10CO-His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加40mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得456mg(77% )標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :521[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -18. 0(c = 1. 0，CH3OH)，Μ· p. : 123. 6—125. 2°C。實施例14 製備 CH3 (CH2) 12C0-His_Gly-Glu (6d)將900mg (1. 23mmol) CH3 (CH2) 12C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加45mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得472mg(70% )標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :549[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -17. 7 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 131. 2—132. 3°C。實施例15 製備 CH3 (CH2) 14C0-His_Gly-Glu (6e)將800mg (1. 05mmol) CH3 (CH2) 14C0-His_Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加40mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得504mg(83%)標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :577[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -4. 2 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 158. 1—160. 0°C。實施例16 製備 CH3 (CH2) 16C0-His_Gly-Glu (6f)將900mg (1. 14mmol) CH3 (CH2) 16C0-His-Gly-Glu (OBzl) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、 用乙醇溶解、加45mgPd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得561mg(81%)標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :605[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -5. 7 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 159. 7—161. 4°C。實施例17 製備 Boc-Gly-Lys(Z)-OBzl將0. 88g(5. OmmoDBoc-Gly溶於200ml無水THF，冰浴下向得到的溶液中加入 0. 68g(5mmol)N-羥基苯並三氮唑(HOBt)，並使其完全溶解。10分鐘後加入1. 24g(6mmol) 二環己基碳二亞胺(DCC)。得到反應液(III)，待用。冰浴下把2.81g(5.0mmol) Tos · Lys(Z) -OBzl (5mmol)懸浮於20ml無水THF中，然後加入Iml N-甲基嗎啉(NMM)，調 PH 8-9。攪拌35分鐘，得到反應液(IV)，待用。冰浴下把反應液(III)加入反應液(IV) 中，冰浴條件下攪拌lh，再室溫攪拌12h，TLC (氯仿/甲醇，10 1)顯示Boc-Gly消失。濾 除二環己基脲(D⑶)，減壓除去THF。殘留物用50ml乙酸乙酯溶解。得到的溶液依次用飽 和NaHCO3水溶液洗、飽和NaCl水溶液洗、5% KHSO4水溶液洗和飽和NaCl水溶液洗。有機 相用無水Na2SO4乾燥、過濾、濾液減壓濃縮至幹，得到2. 32g(88% )標題化合物，為米黃色
7固體。ESI-MS(m/z) :528[M+H] +。實施例18 製備 HCl · Gly-Lys (Z) -OBzl將2. 32g(4. 40mmol) Boc-Gly-Lys (Z) -OBzl 溶解在 100ml 4mol/l 氯化氫-乙酸 乙酯溶液中，室溫攪拌2小時，TLC(氯仿甲醇，5 1)顯示原料點消失，減壓濃縮除去乙 酸乙酯，殘留物反覆加少量乙醚進行減壓濃縮以除去氯化氫氣。最後加少量乙醚將殘留物 研磨成1.94g(95% )標題化合物，為無色固體粉末，直接用於下一步反應。ESI-MS(m/z) 428[M+H]+。實施例I9 製備 Boc-His (Boc) -Gly-Lys (Z) -OBzl按照實施例17 的方法由 1. 49g(4. 18mmol) Boc-His (Boc)和 1. 94g(4. 18mmol) HCl 'Gly-Lys(Z)-OBzl得米黃色油狀物。所得化合物經矽膠柱層析純化得無色油狀物目標 1. 87g，收率為 58. 47%。ESI-MS (m/z) 765 [Μ+Η][ α ]2°D = 27. 4 (c = 1· 0，CH3OH)。實施例20 製備 HCl · His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實施例18 的方法由 1. 87g(2. 45mmol)Boc-His (Boc) -Gly-Lys (Z) -OBzl 製得 1.41g(95% )標題化合物，為米黃色固體。ESI-MS(m/z) :565[M+H] +。實施例21 製備 CH3 (CH2) 6C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實施例17 的方法由 0. 41g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 6C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析純 化得無色固體粉末794mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為49%。ESI_MS(m/Z) 691 [M+H]+，[a J20d = -12. 6 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 88. 5-89. 6 "C。實施例22 製備 CH3(CH2)8CO-His-Gly-Lys(Z)-OBzl按照實施例17 的方法由 0. 49g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 8C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析純 化得無色固體粉末726mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為43%。ESI_MS(m/Z) 719 [M+H]+，[a J20d = -28. O (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 89. 7-90. 1°C。實施例23 製備 CH3 (CH2) 10CO-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實施例17 的方法由 0. 57g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 10C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析純 化得無色固體粉末1.03g，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為59%。ESI-MS(m/z) 747 [M+H]+，[a J20d = -14. 6 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 89. 1-91. 0°C。實施例24 製備 CH3 (CH2) 12C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實施例17 的方法由 0. 65g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 12C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析純 化得無色固體粉末854mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為47%。ESI_MS(m/Z) 775 [M+H]+，[a J20d = -20. 8 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 88. 6-90. 4 "C。實施例25 製備 CH3 (CH2) 14C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實施例17 的方法由 0. 72g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 14C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析純 化得無色固體粉末998mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為53%。ESI_MS(m/Z) 803[M+H]+，[a J20d = -23. 4(c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 86. 4-87. 1°C。
實施例26 製備 CH3 (CH2) 16C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl按照實施例17 的方法由 0. 80g (2. 82mmol) CH3 (CH2) 16C02H 和 1. 41g (2. 35mmol) HCl · His-Gly-Lys(Z)-OBzl製得標題化合物，為黃色固體。所得化合物經矽膠柱層析純 化得無色固體粉末858mg，純化條件氯仿甲醇=50 1，收率為44%。ESI_MS(m/Z) 831 [M+H]+，[a J20d = -22. 3 (c = 1. 0，CH3OH)，Μ. p. 84. 5-86. 5 "C。實施例27 製備 CH3 (CH2) 6C0-His-Gly-Lys (12a)將691mg(Immol) CH3 (CH2)6C0-His-Gly-Lys (Z)-OBzl 置於 IOOml 茄形瓶中、用乙 醇溶解、加35mg Pd/C(約5% )、通H2(0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得376mg(79%)標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :464[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -3. 5 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 127. 1—128. 7°C。實施例28 製備 CH3 (CH2) 8C0-His-Gly-Lys (12b)將526mg(0. 73mmol) CH3 (CH2)8C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、用 乙醇溶解、加30mg Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得263mg(73%)標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :492[Μ-ΗΓ ;[α ]20D =-4. 6(cl，CH3OH) ；Μ. p. 132. 3-133. 5°C。實施例29 製備 CH3 (CH2) 10CO-His-Gly-Lys (12c)將747mg(Immol) CH3 (CH2)ltlCO-His-Gly-Lys (Z)-OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、用乙 醇溶解、加40mg Pd/C (約5 % )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得400mg(77% )標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :520[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -8. 3 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 133. 8-135. 3°C。實施例30 製備 CH3 (CH2) 12C0-His-Gly-Lys (12d)將654mg(0. 84mmol) CH3 (CH2) 12C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、用 乙醇溶解、加35mg Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得361mg(78%)標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :548[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -37. 1 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· : 146. 0—147. 2°C。實施例31 製備 CH3 (CH2) 14C0-His_Gly-Lys (12e)將700mg(0. 87mmol) CH3 (CH2) 14C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、用 乙醇溶解、加35mg Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得406mg(81% )標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :576[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -8. 4(c = 1. 0，CH3OH)，Μ· p. : 134. 5—135. 1°C。實施例32 製備 CH3 (CH2) 16C0-His-Gly-Lys(12f)將688mg(0. 83mmol) CH3 (CH2) 16C0-His-Gly-Lys (Z) -OBzl 置於 100ml 茄形瓶中、用 乙醇溶解、加35mg Pd/C(約5% )、通H2 (0. 02Mba)，室溫攪拌至原料點消失。濾除Pd/C、濾 液減壓濃縮至幹，殘留物反覆用石油醚研磨，製得350mg(70%)標題化合物，為無色固體。 ESI-MS (m/z) :604[Μ-ΗΓ，[α ]20D = -3. 6 (c = 1· 0，CH3OH)，Μ· ρ· :109· 1-110. 9°C。試驗例1飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺對小鼠脾淋巴細胞絲裂原增殖的抑 製作用脫頸處死小鼠，無菌取脾，用200目鋼網和注射器芯研磨，用HANK』 S液洗兩次， 1500轉/分條件下離心10分鐘，計數後用完全RPMI-1640培養液配成5X 106/ml個脾淋
9巴細胞，加100 μ 1細胞懸液於96孔培養板中(每孔含5Χ106個細胞)。每孔加20 μ 1 ConA (ConA終濃度為5 μ g/ml)，該96孔培養板置於體積分數為0. 05的CO2飽和溼度的培養 箱內37°C培養4h。4h後分別加入不同濃度飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺(1X10_4M、 8X 1(Γ5Μ、5Χ 1(Γ5Μ、3Χ 1(Γ5Μ、1Χ 1(Γ5Μ、8Χ 1(Γ6Μ、5Χ ICT6M 和 IX I(T6M)，每個濃度 3 個復孔。 同時設不含化合物對照孔和只含同量培養液無ConA的細胞空白孔。各個孔均重複3次(η =3)。培養48h後用MTT法檢測化合物對脾淋巴細胞的抑制作用。按照公式「抑制率=(D對照-D含藥)/D對照X100%」計算不同濃度飽和脂肪 鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺對脾淋巴細胞增殖的抑制作用，根據細胞相對生存率和化合物 的濃度繪製細胞生長曲線，利用該生長曲線求得半數抑制率(dxIC5ci)。結果列入表1。結果 表明本發明的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺對小鼠脾淋巴細胞增殖有明確的抑制作 用。表1飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺對小鼠脾淋巴細胞絲裂原增殖的抑制作 用
試驗例2飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺對巨噬細胞吞噬的抑制作用 將生長狀態良好、處於對數生長期的Ana-I小鼠巨噬細胞以1 X IO5個/mL的密度
接種於96孔板，每孔100μ 1，37°C、5% CO2培養箱中培養4小時，按預設的濃度梯度加入 經滅菌處理的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺(1 X 10_4M、8 X 10_SM、5 X 10_5M、3 X 10_5M、 1 X 10_5M、8X 10_6M、5X ΙΟ—Μ和1 X I(T6M)，每個濃度3個復孔，對照組加入等體積的溶解樣 品的溶媒。繼續培養24小時後，吸棄上清液，每孔加入100 μ 10. 的中性紅溶液，置於 37°C孵育30分鐘。吸棄中性紅溶液，並用PBS緩衝溶液洗滌2-3次(除去未被巨噬細胞吞 噬的中性紅)，加入細胞溶解液(乙醇乙酸=1 1)100 μ 1，4°C過夜，酶標儀檢測吸光度 值，波長540nm。各個孔均重複3次(η = 3)。 按照公式「抑制率=(D對照-D含藥)/D對照Χ100%」計算不同濃度的化合物 對巨噬細胞的吞噬能力的抑制作用，根據細胞相對生存率和化合物的濃度繪製細胞生長曲 線，利用該生長曲線求得半數抑制率(dxIC5ci)。結果列入表2。結果表明本發明的飽和脂肪 鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺對Ana-I小鼠巨噬細胞吞噬有明確的抑制作用。
表2飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺對Ana-I小鼠巨噬細胞吞噬的抑制作用 化合物名稱IC5Q(IO-5M) 化合物名稱IC5G(IO-5M) 試驗例3飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺在納米水平的自組裝將飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺配置成1 μ mol/ml的水溶液，在雷射納米粒 度儀上25°C測定粒徑。連續測定8天，記錄其粒徑。結果列入表3。數據表明，本發明的飽 和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺水溶液中均能自組裝成粒經穩定在113-4720nm的納米 球。表3飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺在水中自組裝的納米球粒徑
權利要求
通式I的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His Gly AA三肽醯胺CH3(CH2)n CO His Gly AA I通式I中的AA為Glu或Lys，n＝6、8、10、12、14或16。
2. 一種製備權利要求1的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺的方法，包括(1)按照現有液相合成技術，通過逐步接肽合成的His-Gly-AA的保護中間體，其中AA 為穀氨酸或賴氨酸；(2)脫去His-Gly-AA的保護中間體的N端保護基；(3)將C端保護基保護的His-Gly-AA中間體與飽和脂肪酸縮合，所述飽和脂肪酸為 CH3(CH2)nCOOH, η = 6、8、10、12、14 或 16 ；(4)脫去C端保護基得到目標化合物。
3.權利要求1的12種飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺在製備免疫抑制劑類藥物中 的應用。
4.權利要求1的12種飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺作為製備微乳或脂質體藥物 載體的製劑材料的用途。
5.權利要求1的12種飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺作為製備微乳、脂質體藥物 載體的靶向製劑材料中的用途。
全文摘要
本發明涉及通式I的12種具有免疫抑制活性的飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺綴合物，其中AA為Glu或Lys，飽和脂肪鏈酸中n＝6、8、10、12、14或16，涉及它們的製備方法以及作為免疫抑制劑的應用。這些飽和脂肪鏈酸His-Gly-AA三肽醯胺對脾淋巴細胞絲裂原增殖反應的抑制作用，以及對巨噬細胞吞噬活性的抑制作用的實驗結果表明，本發明的化合物具有優秀的免疫抑制作用，臨床上可作為免疫抑制劑應用。CH3(CH2)n-CO-His-Gly-AA I
文檔編號A61K9/107GK101899088SQ200910085320
公開日2010年12月1日 申請日期2009年5月26日 優先權日2009年5月26日
發明者彭師奇, 趙明, 趙淑銳 申請人:首都醫科大學