番茄潰瘍病菌快速ic-pcr檢測試劑盒和製備方法及其使用方法
2024-04-01 08:27:05 1
專利名稱：番茄潰瘍病菌快速ic-pcr檢測試劑盒和製備方法及其使用方法
技術領域：
本發明涉及一種在番茄潰瘍病菌基因水平上快速檢測的試劑盒，屬於植物檢疫和植物保護領域，專一針對番茄潰瘍病菌(JOlavibacter michiganensis subsp. michiganensis, Cmm)的檢測。本試劑盒適用於番茄潰瘍病的田間預防和植物檢疫及植物保護中番茄潰瘍病菌的快速檢測。
背景技術：
番茄潰瘍病(Bacterial canker of tomato)是影響番茄生產最重要的細菌性病害。該病分布廣泛，在世界範圍內已經廣泛流行並造成了巨大的經濟損失，在我國的東北、 華北、西北及東部沿海等地均有發生，部分地區產量減少80%以上，導致我國番茄產量銳減並造成了巨大的經濟損失，同時嚴重威脅著我國外繁種子基地的健康發展。番茄植株從幼苗到坐果期都可發病，發病的植株常表現為病苗矮化枯死、莖杆增粗潰瘍、葉片壞死萎蔫、果實皺縮畸形等症狀，嚴重影響了番茄的產量和品質，給各國番茄主要生產區造成了嚴重的經濟損失。在苗期染病，症狀初始於下部葉緣，隨後向上蔓延引起整株葉片萎蔫，造成病苗矮化或枯死。在成株期染病，主要表現為植株葉片萎蔫、下垂、捲縮，植株莖杆產生狹長稍凹陷的開裂狀條斑，莖杆增粗。病菌侵染種子時，通常表現為萎蔫， 此時維管束受到嚴重破壞；病菌通過植株表面的毛孔、水孔等自然孔口侵染後，則會出現葉片邊緣壞死、萎蔫等局部症狀；病菌侵染維管束時，則造成果實皺縮、畸形；病菌侵染果實時則出現白色圓形小點，後變黃褐色，病斑中央粗糙突起，四周有白色暈圈，呈「鳥眼狀」。 在葉片，最初的症狀是葉片出現可逆性的萎蔫，在葉片的葉脈之間產生白色隨後轉為褐色的壞死條斑，最後表現出永久性萎蔫，使整個植株乾枯死亡。在田間，最初的症狀主要是低位葉片的小葉邊緣出現捲縮、下垂、凋萎、似缺水狀，最後造成大片的缺株斷壟，危害十分嚴重。番茄潰瘍病遠距離廣泛傳播最主要的途徑是種子中攜帶的番茄潰瘍病菌，有研究表明0.01%的種子傳病率就能引起該病的大面積流行。更有研究表明，導致病害在田間流行並造成較大經濟損失的最主要原因是初侵染，而初侵染最重要的來源是種子帶菌。至今， 尚無成功防治該病害的抗病品種和有效的藥物。因此，嚴格控制帶菌種子流入市場是防止該病暴發的最重要的措施之一。但是，番茄種子的帶菌率普遍較低，一般為1%，常規的檢測方法常常導致漏檢。目前國內外對番茄潰瘍病菌檢測採用的方法主要有育苗檢測、分離培養、免疫血清學和PCR檢測等方法。育苗檢測、分離培養所需檢測時間較長，無法滿足多批次種子進出口檢測要求；免疫血清學如ELISA檢測靈敏度相對較低，且常有交叉反應，種子樣品中的雜質和其他抑制劑等因素也使得PCR的檢測靈敏度較低。而只有少量種子攜帶病原這一實際情況，更使得以上檢測方法的靈敏度和檢出率受到限制。因此，發展一種將病原富集技術和PCR高靈敏檢測有效結合的方法，是出入境商用番茄種子快速檢測急需解決的實際問題。
發明內容
本發明的目的在於避免現有技術的不足提供一種番茄潰瘍病菌快速 IC-PCR(Imunocapture-PCR, IC-PCR)檢測試劑盒，以改善現有植物病原菌檢測方法靈敏性低、特異性差、檢測周期長的缺點。本發明是將免疫血清學和分子生物學檢測技術有效結合起來，首先利用免疫血清學對病菌進行富集，然後再利用分子生物學的高檢測靈敏度，進行 PCR擴增，建立了一種將免疫學和分子生物學技術有機結合起來的檢測方法。該方法檢測靈敏度高、快速、準確，能直接對帶菌種子進行檢測，同時省去了核酸提取的過程，降低了操作過程中病原的損失，極大地提高了檢測的準確性和靈敏度，縮短了檢測周期，是一種特別適用於番茄種子等植物微量病原的檢測方法。為實現上述目的，本發明採取的技術方案為一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒，其主要特點是包括有 10XPCR Buffer 500 μ L, 2. 5mmol/L dNTPs 400 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 40 μ L，5 μ mol/L 上遊引物 5，-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3，200 μ L, 5ymol/L 下遊引物 5，-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3，200 μ L，去離子水 1 管，PBST 1 管，包被了番茄潰瘍病菌特異性抗體的PCR管100個、陽性對照1管。—種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒的使用方法，其主要特點是步驟為 (1)病菌富集取檢測樣品50 1^置於本試劑盒的檢測？0 管中，371孵育411或41
過夜，此時抗原抗體充分反應，抗體將會捕捉到檢測樣品中的番茄潰瘍病病菌並富集到PCR
管壁上；
O)PCR擴增棄去檢測樣品，用PBST將PCR管洗滌1-2次，以去除檢測樣品中的種子碎片和雜質，然後加入36. 6 μ L去離子水，在PCR儀中99°C高溫裂解細菌15 min，冷卻離心後再加入 10XPCR buffer 5 μ L、2. 5mmol/L dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ mol/L 上遊引物 5，-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3，2 μ L，5 μ mol/L 下遊弓丨物 5，-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3，2 μ L,然後按下述 PCR 條件進行擴增，94°C變性 30s， 62. 5°C退火45s，72°C延伸45s，35個循環，然後72°C延伸7 min,最後4°C保存，陽性樣品擴增出大小為270bp的特異性目標條帶。一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒的抗體包被方法，其主要特點是步驟為
(1)用碳酸鹽包被緩衝液，其PH=9.6，按照1:200比例稀釋番茄潰瘍病菌特異性抗體， 抗體最終稀釋濃度為2. 5 μ g/mL，將稀釋好的抗體按照每管50 μ L加入非矽烷化的薄壁 PCR管中，放於4°C過夜；此時，免疫球蛋白在碳酸鹽包被緩衝液中可以疏水鍵結合於PCR管內壁表面，形成相對穩定的單分子抗體層，同時還保持抗體的免疫活性；
(2)碳酸鹽包被緩衝溶液為碳酸鈉1.59 g、碳酸氫鈉2. 93 g、疊氮化鈉0.2 g、溶於 IOOOmL雙蒸水中，調pH值到9. 6 ；PBST為氯化鈉 8. 0 g、無水磷酸氫二鈉1. 15 g、無水磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鉀0.2 g、吐溫-20 0.5 mL，加雙蒸水定容到1000 mL，調pH值到7. 4。一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒的植物病原抽提方法，其主要特點是步驟為
(1)植物病原抽提方法按照種子重量與病原提取液為1:4的比例(g/mL)，稱量2 g種子，置於研缽中用棒杵研磨種子至種皮破裂，然後加入8 mL普通病原抽提緩衝液，然後將病原抽提緩衝液和種子碎片一同轉移到10 mL離心管中，在混勻器中劇烈震蕩5 min;此時， 抽提緩衝液與種子的種皮內外層充分接觸，再室溫靜置Ih或4°C過夜，則種子上攜帶的植物病原的多數位於抽提緩衝液的上清部分中；
(2)抽提緩衝液配方為硫酸鈉0.13 g/mL，聚乙烯吡咯烷酮2 g/mL，疊氮化鈉0. 02 g/ mL，吐溫-20 0. 5 mL,調 pH 值至 7. 4。一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒的模板DNA快速獲取方法，其主要特點是步驟為取檢測樣品50 4 1^置於本試劑盒的？0 管中，371孵育411或41過夜，此時管壁上的特異性抗體將捕捉到檢測樣品中的番茄潰瘍病菌並富集到PCR管壁上；然後用PBST 洗滌PCR管1-2次，以去除檢測樣品中的種子碎片和雜質，減少對PCR擴增的影響，再在PCR 管中加入36. 6 μ L去離子水，短暫離心後，在PCR儀中99°C高溫裂解15 min，然後再迅速置於冰上冷卻片刻，此時富集到PCR管壁上的細菌全部破裂，細菌破裂後釋放的DNA可以直接作為PCR擴增的模板，進行單管PCR擴增。本發明的有益效果番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒，涉及到檢測危險性植物病原菌的一種新技術，本試劑盒具有檢測靈敏度高，特異性強，檢測周期短，操作簡便快捷的優點，可以在8 h內就完成整個檢測過程。本發明提供了一種依賴免疫學富集和PCR 擴增的檢測技術，這項技術克服了現有的植物病原菌檢測方法靈敏性低、特異性差、檢測周期長的缺點，並且可以直接從番茄種子或其他植物材料檢測病原菌，大大簡化了檢測程序， 提高了我國口岸的檢疫水平，同時為病害防治策略的制定提供了依據。試劑盒特異性驗證試驗通過使用番茄潰瘍病菌亞種特異性引物Cmm Fl和Cmm Rl對番茄潰瘍病菌菌株和非番茄潰瘍病菌菌株的特異性檢測結果表明，引物Cmm Fl和Cmm Rl在優化的PCR擴增條件下在番茄潰瘍病菌株中擴增得到了大小約270 bp的特異性目標條帶，而在其他7個參試的非番茄潰瘍病菌菌株中均未見特異性目標條帶，說明本試劑盒中使用的引物對番茄潰瘍病菌具有較高的特異性。試劑盒靈敏度驗證試驗在梯度稀釋的純菌懸液中，本試劑盒的檢測靈敏度可以達到IO2 cfu/mL,也即是2. 4X IO2 cfu/mL ；在梯度稀釋的模擬帶菌種子提取液中，本試劑盒的檢測靈敏度可以達到IO4 cfu/mL,也即是2. 4X IO4 cfu/mL。而使用直接PCR在梯度稀釋的純菌液和模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度僅為IO4 cfu/mL和IO6 cfu/mL。也即是說，本試劑盒無論在純菌液中還是在模擬帶菌種子提取液的檢測靈敏度均比普通PCR高100倍， 比常規使用的ELISA方法檢測靈敏度亦高100倍。試劑盒實用性驗證選取8批可能自然感染番茄潰瘍病菌的番茄種子，按照常規的種子病原提取方法對病原進行提取，然後再按照本試劑盒的使用方法對8批可能自然感染的番茄種子進行檢測，結果從4批番茄種子中擴增出270bp的特異性目標條帶，而ELISA 方法在上述的8批種子中只有1批檢測結果為陽性。實驗結果表明，番茄潰瘍病菌快速 IC-PCR檢測試劑盒的檢測靈敏度比ELISA高，在實際的番茄種子帶菌檢測中具有較大的實用價值。使用本試劑盒對1個番茄潰瘍病菌和7個非番茄潰瘍病菌參試菌株進行檢測， 番茄潰瘍病菌菌株擴增得到270bp特異性目標條帶，其餘菌株均未見特異性目標條帶；對 ELISA檢測陽性樣品進行驗證，符合率為100%。番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒集病原富集、特異性抗體捕捉、PCR擴增於一體，是一種檢測靈敏度高、檢測周期短、結果準確、使用方便的植物病原檢測試劑盒，尤其適用於植物保護部門和出入境植物檢疫部門，對病原含量比較低的樣品進行快速番茄潰瘍病菌的檢測。
圖1番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒原理圖； 圖2試劑盒使用流程圖3試劑盒特異性驗證試驗結果；
圖中1-8號泳道分別為Cmm、Pss、Pst、Xcv、Xcc、Xcp、Psl、Aac，目標細菌數目均為IO7 cfu/mL,M % IOObp DNA ladder。圖4梯度稀釋純菌液直接PCR結果；
圖中1-7號泳道細菌濃度分別為2. 4X107-2. 4X IO1 cfu/mL, N為陰性對照，P為陽性對照，M 為 IOObp DNA ladder。圖5梯度稀釋純菌液IC-PCR結果；
圖中1-7號泳道細菌濃度分別為2. 4X107-2. 4X IO1 cfu/mL，N為陰性對照，M為IOObp DNA ladder。圖6梯度稀釋模擬帶菌種子提取液直接PCR結果；
圖中1-7號泳道細菌濃度分別為2. 4X107-2. 4X IO1 cfu/mL，N為陰性對照，M為IOObp DNA ladder。 圖7梯度稀釋模擬帶菌種子提取液IC-PCR結果；
圖中1-7號泳道細菌濃度分別為2. 4X107-2. 4X IO1 cfu/mL的，N為陰性對照，M為 IOObp DNA ladder。圖8自然感染種子IC-PCR結果。圖中1-8號泳道分別為8批自然感染的種子，P為陽性對照，M為IOObp DNA Iadder0
具體實施例方式以下結合附圖對本發明的原理和特徵進行描述，所舉實例只用於解釋本發明，並非用於限定本發明的範圍。實施例1 :對番茄潰瘍病菌和非番茄潰瘍病菌菌株特異性性驗證試驗(見圖3) 收集 1 株番饋蕩病菌{Clavibacter michiganensis subsp. michiganensis,
Cmm)和7株非番茄潰瘍病菌菌株驗證本試劑盒的特異性，這7株病菌分別為丁香假單胞桿菌丁香致病型(/^ewOrOfflOfta1S syringae pv. syringae, Pss)，番茄細菌性葉斑病菌 iPseudomonas syringae pv. tomato, Pst)，番爺細菌性疫痂病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)，十字花禾鬥蔬菜黑腐致病變禾中{Xan thomonas campestris pv. campestris, Xcc)，大醜細菌斑疫病菌(Janthomonas campestris phaseoli, Xcp ), Stf/Riffl lifiifeBf3 :^) lif (fseudomonas syringae pv. Iachrymans, Psl), 西瓜細菌性果斑病菌(Acidovorax avenae subsp. citrulli, Aac)。取各參試菌株的純菌液50 μ L(濃度為IO7 cfu/mL)，置於本試劑盒的檢測PCR管中，37°C孵育4 h或4°C過夜，然後棄去PCR管內的檢測樣品，用PBST衝洗1-2次，然後棄去洗液，扣幹管內殘餘液體後，再在PCR管內加入36. 6 μ L去離子水，然後在PCR儀中99°C裂解10 min，再迅速放置於冰上5 min，待冷卻後高速離心片刻，然後向管內加入10XPCR buffer 5μ L,2. 5 mmol/ L dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA聚合酶0. 4 μ L、5 μ mol/L 上遊引物 2 μ L，5 μ mol/L 下遊弓丨物 2yL。擴增條件為 94°C 2min ； 94 °C 30s, 62. 5°C 45s, 72 °C 45s，；35 個循環；72°C 7min, 4°C保存。取10 μ L PCR產物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳進行分離，電泳結束後在凝膠成像系統下進行分析並拍照。實驗結果如圖3所示，圖中只有1號泳道可見特異性目標條帶，大小約為270 bp, 2-8號泳道均未見特異性目標條帶。實驗結果表明，本試劑盒特異性針對番茄潰瘍病菌，而在參試的其他7株非番茄潰瘍病菌菌株上均未擴增出特異性的目標條帶，說明本試劑盒對番茄潰瘍病菌具有較高的特異性。實施例2 梯度稀釋番茄潰瘍病菌純菌液直接PCR檢測試驗(見圖4)
將番茄潰瘍病菌標準菌株培養12 h後，測其在600nm處的吸光值，待A600nm值 =0.25-0.3(此時菌液濃度約為IO8 cfu/mL)，取此菌液2 mL依次10倍稀釋到無菌PBS中，並分別標記為 ο—1、10_2、10_3、 (Γ4、ιο-5、 ο—6、 ο—7，然後取 ο—5、 ο—6、 ο—7 梯度純菌液各 loo μ 進行平板菌落計數。取濃度為2. 4 X IO7-ZjXlO1CfuAiL的梯度純菌液各5 μ L於PCR管中，加入31. 6 μ L去離子水，在PCR儀上99°C裂解10 min，然後迅速置於冰上冷卻5 min，離心後加入 10XPCR buffer 5 μ L、2. 5mmol/L dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0.4 μ L、 5 μ mol/L上遊引物2 μ L，5 μ mol/L下遊引物2 μ L，PCR反應成分同實施例1，然後再進行 PCR擴增。實驗結果如圖4所示，圖中1-4號泳道均可見特異性目標條帶，片段大小約為 270bp，且亮度依次減弱；5-7號泳道未見特異性目標條帶。試驗結果表明，在純菌液中直接 PCR的檢測靈敏度為IO4 cfu/mL。實施例3 見圖5，梯度稀釋番茄潰瘍病菌純菌液IC-PCR檢測試驗，
取番茄潰瘍病菌濃度分別為2. 4X107-2. 4 X IO1 cfu/mL的梯度稀釋純菌液各50 μ L， 置於本試劑盒的檢測PCR管中，37°C孵育4 h或4°C過夜，然後棄去PCR管內梯度純菌液， 再用PBST衝洗1-2次，棄去洗液後扣幹管內殘餘液體再在PCR管內加入36. 6 μ L去離子水，然後在PCR儀中99°C裂解10 min，再迅速放置冰上5 min，待冷卻後高速離心片刻， 然後向管內加入 10XPCR buffer 5 μ L、2. 5mmol/L dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ mol/L 上遊引物 2 μ L，5 μ mo 1/L 下遊引物 2 μ L，擴增條件為 94°C 2min ；94°C 30s, 62. 5°C 45s, 72°C 45s，；35 個循環；72°C 7min，4°C保存。取 10 μ L PCR 產物用 1. 5% 瓊脂糖凝膠電泳進行分離，電泳結束後在凝膠成像系統下進行分析並照相。實驗結果如圖5所示，圖中1-6號泳道均可見特異性目標條帶，大小約為270bp，且條帶亮度依次減弱，而7號泳道未見特異性目標條帶。實驗結果表明，本試劑盒在梯度稀釋的純菌液中可以檢出濃度為IO2 cfu/mL的番茄潰瘍病菌，具有較高的檢測靈敏度，在國內外的檢測方法中也是靈敏度比較高的。實施例4 見圖6，梯度稀釋模擬帶菌種子提取液直接PCR試驗，
稱取50 g經檢測不帶Cmm的番茄種子放於研缽內，用缽杵將番茄種子在研缽內研碎後，加入200 mL普通種子病原提取液，將種子病原提取液及種子碎片全部轉移至錐形瓶中4°C放置過夜，次日取出經抽提病原後的種子病原提取液，取其上清分裝到小錐形瓶中。然後取經過計數後的上一梯度純菌液2mL依次10倍稀釋到種子病原提取液中，並分別標記為 I。-1、1(Γ2、ΙΟ-3、1(Γ4、1(Γ5、ΙΟ—6、1(Γ7。取番茄潰瘍病菌濃度為 2. 4X 107_2· 4X IO1 cfu/mL 的模擬帶菌種子提取液各5 μ L於PCR管中，再加入31.6 μ L去離子水，在PCR儀中99°C裂解 10 min，其餘方法同實施例1。實驗結果如圖6所示，圖中只有1、2號泳道可見較淡的特異性目標條帶，大小約為 270bp，其餘泳道均未見到明顯目標條帶。試驗表明直接PCR在模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度僅為IO6 cfu/mL。實施例5 見圖7，梯度稀釋模擬帶菌種子提取液IC-PCR試驗，
取2. 4X107-2. 4 X IO1 cfu/mL梯度稀釋模擬帶菌種子液各50 μ L放於本試劑盒的檢測PCR管中，37°C孵育4 h，然後棄去PCR管內梯度模擬帶菌種子提取液，用PBST衝洗1_2 次，棄去洗液後扣幹管內殘餘液體再在PCR管內加入36. 6 μ L去離子水，然後在PCR儀中 99°C裂解10 min，再迅速放置冰上5 min，待PCR管冷卻後高速離心片刻，然後再向管內加入 10XPCR buffer 5 μ L、2. 5mmol/L dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA聚合酶0· 4 μ L、5 μ mol/ L上遊引物2 μ L，5 μ mol/L下遊引物2 μ L，其餘方法同實施例1。實驗結果如圖7所示，圖中可見1-4號泳道均可見特異性目標條帶，大小約為 270bp，且條帶亮度依次減弱，6、7號泳道未見特異性目標條帶。實驗結果表明，本試劑盒在模擬帶菌種子提取液中的檢測靈敏度為IO4 cfu/mL,比傳統的ELISA檢測試劑盒的檢測靈敏度提高了 100倍。實施例6 見圖8，自然感染番茄潰瘍病菌的出口番茄種子檢測試驗，
取8批可能自然感染番茄潰瘍病菌的出口番茄種子，各稱取2 g，置於研缽中用棒杵研磨至種皮破裂，然後加入8 mL普通病原抽提緩衝液，再將病原抽提緩衝液和種子碎片一同轉移到10 mL離心管中，在混勻器中劇烈震蕩5min。此時，抽提緩衝液與種皮的內外層充分接觸，再室溫靜置1 h或4°C過夜，對種皮上的病原進行抽提，則種子上攜帶的植物病原大部分被抽提到緩衝液的上清部分中。然後再取上清液50 μ L，放於本試劑盒的檢測PCR 管中，37°C孵育4 h，然後棄去PCR管內的檢測樣品，用PBST衝洗1-2次，棄去洗液後扣幹管內殘餘液體，再在PCR管內加入36. 6 μ L去離子水，然後在PCR儀中99°C裂解10 min,其餘步驟同實施例1。實驗結果如圖8所示，圖中可見1、6、7、8號泳道可見特異性目標條帶，大小約為 270bp，其中1號泳道條帶較亮，6-8號泳道條帶較淡，而2-5號泳道未見特異性目標條帶。 實驗結果表明，在可能自然感染番茄潰瘍病菌的8批出口番茄種子中，有4批能擴增出特異性的目標條帶，而採用ELISA方法時從8批種子中只有1批檢測為陽性。同時試驗表明，本試劑盒在實際的種子病原檢測中具有較高的實用價值，能直接對帶菌番茄種子進行檢測， 具有較大的推廣應用基礎。以上所述僅為本發明的較佳實施例，並不用以限制本發明，凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒，其特徵是包括有10XPCR Buffer 500 μ L, 2. 5mmol/L dNTPs 400 μ L, 5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 40 μ L，5 μ mol/L 上下遊引物各 200yL，去離子水1管，PBST 1管，包被了番茄潰瘍病菌特異性抗體的PCR管100個、陽性對照1管。
2.一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒的使用方法，其特徵是步驟為(1)病菌富集取檢測樣品50 μ L置於本試劑盒的檢測PCR管中，37°C孵育4h或4°C 過夜，此時抗原抗體充分反應，抗體將會捕捉到檢測樣品中的番茄潰瘍病病菌並富集到PCR管壁上；O)PCR擴增棄去檢測樣品，用PBST將PCR管洗滌1-2次，以去除檢測樣品中的種子碎片和雜質，然後加入36. 6 μ L去離子水，在PCR儀中99°C高溫裂解細菌15min，冷卻離心後再加入 10XPCR buffer 5μ L,2. 5 mmol/L dNTPs 4μ L,5U/y L Taq DNA 聚合酶 0. 4 μ L、5 μ mol/L 上遊引物 5，-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3，2 μ L，5 μ mol/L 下遊弓丨物 5，-TACTGAGATGTTTCACTTCCCC-3，2 μ L,然後按下述 PCR 條件進行擴增，94°C變性 30s， 62. 5°C退火45s，72°C延伸45s，;35個循環，然後72°C延伸7 min，最後4°C保存，陽性樣品擴增出大小為270bp的特異性目標條帶。
3.一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒的抗體包被方法，其特徵是步驟為(1)用碳酸鹽包被緩衝液，其PH=9.6，按照1:200比例稀釋番茄潰瘍病菌特異性抗體， 抗體最終稀釋濃度為2. 5 μ g/mL,將稀釋好的抗體按照每管50 μ L加入非矽烷化的薄壁 PCR管中，放於4°C過夜；此時，免疫球蛋白在碳酸鹽包被緩衝液中可以疏水鍵結合於PCR管內壁表面，形成相對穩定的單分子抗體層，同時還保持抗體的免疫活性；(2)碳酸鹽包被緩衝溶液為碳酸鈉1.59 g、碳酸氫鈉2. 93 g、疊氮化鈉0.2 g、溶於 1000 mL雙蒸水中，調PH值到9. 6 ;PBST為氯化鈉 8.0 g、無水磷酸氫二鈉1. 15 g、無水磷酸二氫鉀0.2 g、氯化鉀0.2 g、吐溫-20 0.5 mL，加雙蒸水定容到1000 mL，調pH值到7. 4。
4.一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒的植物病原抽提方法，其特徵是步驟為(1)植物病原抽提方法按照種子重量與病原提取液為1:4的比例，稱量2g種子，置於研缽中用棒杵研磨種子至種皮破裂，然後加入8 mL普通病原抽提緩衝液，然後將病原抽提緩衝液和種子碎片一同轉移到10 mL離心管中，在混勻器中劇烈震蕩5 min;此時，抽提緩衝液與種子的種皮內外層充分接觸，再室溫靜置1 h或4°C過夜，則種子上攜帶的植物病原的多數位於抽提緩衝液的上清部分中；(2)抽提緩衝液配方為硫酸鈉0.13g/mL，聚乙烯吡咯烷酮2 g/mL，疊氮化鈉0. 02 g/ mL,吐溫-20 0. 5 mL,調 pH 值至 7. 4。
5.一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒的模板DNA快速獲取方法，其特徵是步驟為取檢測樣品50 4 1^置於本試劑盒的？0 管中，371孵育411或41過夜，此時管壁上的特異性抗體將捕捉到檢測樣品中的番茄潰瘍病菌並富集到PCR管壁上；然後用PBST洗滌 PCR管1-2次，以去除檢測樣品中的種子碎片和雜質，減少對PCR擴增的影響，再在PCR管中加入36. 6 μ L去離子水，短暫離心後，在PCR儀中99°C高溫裂解15 min，然後再迅速置於冰上冷卻片刻，此時富集到PCR管壁上的細菌全部破裂，細菌破裂後釋放的DNA可以直接作為PCR擴增的模板，進行單管PCR擴增。
全文摘要
本發明涉及一種在番茄潰瘍病菌基因水平上快速檢測的試劑盒，屬於植物檢疫和植物保護領域。本試劑盒適用於番茄潰瘍病的田間預防和植物檢疫及植物保護中番茄潰瘍病菌的快速檢測。一種番茄潰瘍病菌快速IC-PCR檢測試劑盒，其主要特點是包括有10×PCRBuffer500μL，2.5mmol/LdNTPs400μL，5U/μLTaqDNA聚合酶40μL，5μmol/L上下遊引物各200μL，去離子水1管，PBST1管，包被了番茄潰瘍病菌特異性抗體的PCR管100個、陽性對照1管。
文檔編號C12Q1/68GK102465175SQ20101054016
公開日2012年5月23日 申請日期2010年11月11日 優先權日2010年11月11日
發明者劉箐, 閔現華 申請人:上海慧耘生物科技有限公司