用於防治獼猴桃細菌性潰瘍病的內生鏈黴菌及其製備方法
2024-04-01 08:10:05
專利名稱：用於防治獼猴桃細菌性潰瘍病的內生鏈黴菌及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物農藥技術領域，具體涉及一種用於防治獼猴桃細菌性潰瘍 病的內生鏈黴菌及其製備方法。
背景技術：
獼猴桃細菌性潰瘍病是由丁香假單胞桿菌獼猴桃致病變種(/^et^omonw ^h"gaepv.flc""W/ae)侵染引起的獼猴桃上的重要病害，該病一旦發生流行，不 僅影響獼猴桃的產量和果品質量，嚴重時常常造成毀園，給^猴桃產業帶來巨 大損失。獼猴桃細菌性潰瘍病於1980年在美國加利福尼亞州和日本神州景崗縣 首次發現，而我國湖南的東山峰農場在1985年發現該病，當時造成2000餘畝 果園瀕臨毀園。獼猴桃在我國陝西和安徽等省有著廣泛的種植，獼猴桃生產也 是陝西省的重要水果產業之一，但從1991年起相繼在長安、戶縣、周至以及楊 凌等獼猴桃產區發現了獼猴桃潰瘍病後，近年來該病有擴大流行的趨勢，給陝 西省的獼猴桃產業帶來嚴重危機。獼猴桃細菌性潰瘍病多發生在春季傷流期至 開花末期和秋季，可危害植株的主幹、枝蔓、嫩梢、葉片、花蕾和花等部位。 獼猴桃潰瘍病菌主要在藤蔓病枝上越冬，或隨病枝、病葉殘體在土壤中越冬， 翌年3月開始發病，通過風雨、昆蟲、農具和農事操作進行傳播，從傷口和自 然孔口侵入，3-5天後出現症狀並產生菌膿進行再侵染，4月下旬出現發病高峰 期。發病部位多從弱枝幹的皮孔、芽基、葉痕、枝條分叉處開始，低溫高溼利 於發病，農事操作和修剪時機械損傷愈多，病害發生愈重。
目前防治獼猴桃潰瘍病的藥劑主要是農用鏈黴素和石硫合劑，施納寧是陝
5西關中地區各植保站推廣的一種防治獼猴桃潰瘍病的新農藥，但田間防病效果 均不理想，因而尋找開發新型、高效及安全的生物農藥將對獼猴桃產業的穩定 和發展具有重要意義。
發明內容
針對現有技術中存在的問題與缺陷，本發明的目的旨在尋求防治獼猴桃細 菌性潰瘍病的內生鏈黴菌及活性產物的製備方法。
實現上述發明目的的技術方案具體如下
楊凌青色鏈黴菌(S/r取o，ees g/awcw >sp.朋vya"g/f"g) TIASA5菌株(以下 簡稱為TIASA5菌株)，該菌株已於2007年8月16日保藏在中國科學院微生物 所菌株保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏中心登記入冊 編號為CGMCC No. 2132;保藏單位地址北京市朝陽區大屯路中國科學院微 生物研究所，郵政編碼100101。
本發明還有一個目的是提供TIASA5菌株的製備方法，具體包括下列步驟
1) 將採自陝西楊凌的野生黃花蒿莖組織用清水洗淨後用吸水紙將水分吸 幹，在99%乙醇中浸lmin，然後在濃度為3.125%的NaClO中浸6 min，再次放 入99%乙醇中浸30 sec，最後用無菌生理鹽水衝洗5次；
2) 將表面消毒後的待分離的黃花蒿莖組織用滅菌刀片切成0.2mm長的小 段，置於高氏一號平板上，28'C培養箱培養21 28 d後統計放線菌菌落數並用 劃線法進行純化成單菌落；
3) 將純化後的單菌落經過如下發酵將在黃豆粉平板上活化培養5 7d 的菌苔平板用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，接入黃豆粉培養基中，28°C， 150r/min培養36h後，按12%的接種量將種子液接入黃豆粉培養基中，30'C，180r/min發酵72 96h，將培養好的發酵液以10000r/min離心30min，取上清液， 將製得的上清液用管碟法進行拮抗性篩選，獲得廣譜抗菌效果明顯的拮抗菌株 TIASA5。
所述的高氏一號由可溶性澱粉20g， KNO3lg，K2HPO40.5g， NaCl 0.5 g， MgS04 7H20 0.5 g， FeS04 7H2O0.01g，瓊脂粉13g，蒸餾水lOOOmL組成， 且pH為7.2。
所述的黃豆粉培養基可容性澱粉5g 、蔗糖10g、蛋白腖2g、酵母膏2 g、 NaCl 2 g、 K2HPO40.5 g、 MgS04 7H20 0.5 g、 CaC03 lg 、黃豆粉20g煮 沸30min過濾、水1000mL、 pH為7.2 7.4。
本發明還有一個目的是提供TIASA5菌株的抗菌活性物質，它是按照下列 方法製備的-
1) 將TIASA5菌株接在黃豆粉平板上，3(TC活化培養5 7d，將菌苔平板 用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，先將菌餅接入種子培養基(黃豆粉20g，蔗 糖10g，可溶性澱粉5g，蛋白腖2g，酵母浸粉2g， NaCl 2g， CaC03 lg， MgS04 7H20 0.5g， KH2PO40.5g，瓊脂15 g，蒸餾水lOOOmL, pH 7.0)中， 28°C， 150r/min培養36h後，按12%的接種量將種子液接入發酵培養基(黃豆 粉15g、澱粉7.5g、蔗糖10g、玉米粉15g、酵母粉5g、硫酸銨15g、 NaC12g、 K2HPO40.5g、 CaC03 lg、蒸餾水1000mL、 pH 7.0 7.2)中，30°C， 180r/min
發酵72h;
2) 將培養好的發酵液在10000r/min下離心30min，取上清液進行提取前預 處理，即先用1M H2S04將發酵上清液調至pH值為2， 80'C水浴lh後，再用 1M的NaOH調至pH值為7，然後以10000r/min的速度離心30min，收集上清液；
3) 將按步驟2)預處理好的上清液過732#離子交換樹脂柱，動態吸附，再 用1N的氨水洗脫，根據薄層檢測和活性跟蹤的結果收集合併活性餾分；
4) 將活性餾分減壓濃縮後再冷凍乾燥即得抗菌活性物質。 本發明還有一個目的是提供TIASA5菌株及其抗菌活性物質在防治獼猴桃
細菌性潰瘍病中的應用。
本發明的TIASA5菌株具有以下特徵
A培養特徵TIASA5菌株在高氏一號平板上菌落較小，菌落為圓形，凸起， 孢子堆顏色為橄欖灰色，氣生菌絲髮達，基內菌絲前期為白色，3 5d後呈絳紅 色，不產生可溶性色素，該菌株在各培養基上都不產生可溶性色素。
B形態學特徵通過掃描電子顯微鏡對該菌株的菌絲形態觀察，其氣生菌絲
呈鬆散的螺旋狀，且菌絲表面有細長的毛髮狀突起。孢子呈橢圓形，孢子表面 亦有毛髮狀突起。菌絲和孢子的形態見附見圖1，方法見實施例l。
C生理生化特徵生理生化測試結果表明，TIASA5菌株能使石蕊牛奶變藍 但不腖化，產澱粉酶能力強，能產生卵磷脂酶和纖維素酶，不產生蛋白酶，不 產生硫化氫和黑色素，硝酸鹽反應陽性。TIASA5菌株可以利用的碳源有葡萄糖、 蔗糖、麥芽糖、D-果糖、肌醇、甘露糖、山梨醇、羧甲基纖維素、半乳糖和棉 籽糖，但是不利用甘油；該菌可以利用的氮源有甘氨酸、D，L-a-丙氨酸、L-賴氨 酸、L-酪氨酸、L-胱氨酸、L-胍氨酸、尿素和L-天門冬氨酸，但不能利用馬尿 酸鈉、L-色氨酸和D,L-酪氨酸。最適生長溫度為3(TC，對pH不敏感。
D細胞壁糖型和胺基酸分析經細胞壁胺基酸和糖分析，結果表明該菌株 細胞壁中含有L，L-DAP和甘氨酸等多種胺基酸，無特徵性糖，屬於胞壁I型。本發明的TIASA5菌株經菌落培養特徵、菌絲形態的顯微觀察、細胞化學 分析、生理生化特性以及16SrDNA序列分析，屬於青色鏈黴菌類。
本發明的TIASA5菌株來自黃花蒿的莖組織，分離篩選方法簡單；TIASA5 菌株產生的抑制獼猴桃細菌性潰瘍病的主要活性物質為鹼性水溶性的巴龍黴素 族抗生素，能夠抑制細菌細胞蛋白質的合成。該類抗生素水溶性好、性質穩定、 抗菌譜廣、對葡萄球菌和需氧革蘭氏陰性桿菌均具有良好的抗菌活性，該菌株 是產生此類抗生素菌株的新來源。該菌株分離自健康植物組織內，因而產生的 活性代謝產物對植物組織沒有明顯毒害作用，且性質穩定，噴施方便，防治獼 猴桃潰瘍病效果顯著。
圖1為TIASA5菌株的菌絲形態及孢子形態特徵圖。
圖2為TIASA5菌株活性粗提物的捷克八溶劑系統紙層析圖譜寄生物顯影 結果圖。
具體實施例方式
下面通過發明人給出的具體實驗例和試驗例來進一步詳述本發明的 TIASA5菌株及活性物質的製備方法和有益效果。
實施例一TIASA5菌株的分離和形態鑑定
1) 將採自陝西楊凌的健康野生黃花蒿莖組織用清水洗淨後用吸水紙將水 分吸乾，在99%乙醇中浸lmin，然後在濃度為3.125%的NaClO中浸6 min，再 次放入99%乙醇中浸30 sec，最後用無菌生理鹽水衝洗5次；
2) 將表面消毒後的待分離的黃花蒿莖組織用滅菌刀片切成0.2mm長的小 段，置於高氏一號平板上，28'C培養箱培養21 28 d後統計放線菌菌落數並用劃線法進行純化成單菌落；
3)將純化後的單菌落經過如下發酵將在黃豆粉平板上活化培養5 7d
的菌苔平板用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，接入黃豆粉培養基中，28°C， 150r/min培養36h後，按12%的接種量將種子液接入黃豆粉培養基中，30°C， 180r/min發酵72 96h，將培養好的發酵液以10000r/min離心30min,取上清液， 後製得的上清液用管碟法進行拮抗性篩選，獲得廣譜抗菌效果明顯的拮抗菌株 TIASA5;
實施例二 TIASA5菌株的抗菌活性物質的製備方法
將在黃豆粉平板上活化培養5d的TIASA5菌株用打孔器打成直徑為6mm 的菌餅，接入種子培養基中，28°C， 150r/min培養36h後，按12%的接種量將 種子液接入發酵培養基中，30°C， 180r/min發酵培養72h。將培養好的發酵液在 10000r/min下離心30min，取上清，即為粗發酵液。將粗發酵液用1M H2S04調 至pH2，80。C水浴lh，然後用1M的NaOH調至pH7，再離心(10000r/min，30min)， 收集上清液，初步除掉發酵液中的蛋白質和CaC03。將預處理好的發酵液上732 "離子交換樹脂，動態吸附，然後用1N的氨水洗脫，流速為3mL/min，每餾分 收集100mL。根據活性跟蹤的結果收集合併活性餾分。將活性餾分減壓濃縮後 再冷凍乾燥，得到的固體樣品即為抗菌活性物質。
試驗例1 TIASA5菌株對獼猴桃潰瘍菌皿內抑制作用以及活性粗提物田間 防治試驗
將在固體黃豆粉培養基上培養5d的TIASA5菌株平板用打孔器打成直徑為 6mm的菌餅，接入黃豆粉培養液中培養36h後作為種子液，然後分別按12%的 接種量接入黃豆粉培養液中，30°C， 180r/min條件下培養3d後10000r/min離心30min，取上清液備用。將滅菌牛津杯放入混好獼猴桃潰瘍病菌(10"mL)的NA 平板中央，杯中加入100pL製備的上清液，置30。C培養18 24h後用十字交叉 法測量抑菌圈的大小，試驗設2個重複，取其平均值。
田間防治試驗採用實施例二中活性粗提物A5，選取發病枝條上病斑大小均 勻的病斑作為處理對象，並便每個處理的病斑均勻分布在同一株獼猴桃樹的各 枝條上。試驗設4個處理，即噴施稀釋100倍粗提物(A5l00x)，稀釋500倍粗提 物(As 500x)，以稀釋150倍的施那寧(施那寧150x)(有效成分為代森銨)為對照農 藥，以清水為空白對照。
將選取的病斑用小刀刮去表皮，量取病斑面積，然後將藥劑用噴壺噴灑病 斑處，連續噴藥2次。然後每隔7天調查，並測量病斑面積， 一共調查4次。 試驗每處理為12個病斑，設3個重複。
對照防後面積—處理防後面積
相對防效(qo—對照防前面哀處理防前面積::1^ 卿雄/。) 對照防後面積 爛/0
對照防前面積
TIASA5菌株的無菌發酵濾液對供試的革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性細菌均 有很強的抑制作用，其抑菌效果見表l。
表1 TIASA5菌株發酵液對靶標細菌的抑菌作用
靶標菌 抑菌圈直徑(mm) 耙標菌 抑菌圈直徑(mm)
枯草芽孢桿菌 37.5±0.1 獼猴桃潰瘍菌 32.0±0.1
金黃色葡萄球菌35.0±0.2 白菜軟腐菌 25.5±0.2
大腸桿菌32.0±0.1 番茄青枯菌 o
田間試驗結果表明，稀釋100倍和稀釋500倍的A5粗提物菌對獼猴桃潰瘍
病表現較好的防治效果，在施藥21d後，相對防效達到最大(見表2)，其對獼
11猴桃潰瘍病的相對防效分別為61.5%和42.2%，而用施納寧處理的相對防效為 30.8%，且差異顯著。
表2 TIASA5菌株發酵液粗提物對獼猴桃潰瘍病的田間防治效果
處理7d14d相對防效C5/。) 21d28d
A5,謂x33.7a47.4a61.5a58.4a
A5, 500x16.1c31.4b42.2b49.8a
45°/。施那寧，150x21.5b27.7b30.8c28.6b
試驗例2: TIASA5菌株的活性4f質的性質預試
採用捷克八溶劑系統紙層析試驗取18x0.5cm的濾紙條，在其下端5cm處 點上適當的樣品(採用實施例二中活性粗提物A5)，分別掛在裝有展開劑的層析 缸中，使有樣品一端浸入溶劑約lcm深度。待溶劑擴展到紙條上端3cm處取下， 風乾，平鋪在混有枯草芽孢桿菌的NA平板上，置4'C冰箱滲透3h後揭開濾紙 條，然後置3(TC培養箱培養18 24h，觀察結果見(圖2a:紙層析圖譜，b:生 物顯影)，記錄抑菌圈中心距點樣原點的距離，計算各自的Rf值。Rf二樣品由 原點到抑菌圈中心的距離/溶劑由原點到溶劑前沿的距離。將各展開劑中展開的 Rf值連成的折線圖譜與標準圖譜進行比較發現，TIASA5發酵液的圖譜與標準 圖譜中的第一大類抗生素圖譜，即在第5,6種展開系統中的Rf值較大，因此推 斷TIASA5菌株發酵液中的抑菌活性物質屬於鹼性水溶性抗生素-氨基糖苷類抗 生素，進一步分離純化和結構鑑定結果表明主要抗菌活性物質為巴龍黴素。
1權利要求
1. 楊凌青色鏈黴菌(Streptomyces glaucus sp.nov yangling)TIASA5GCMCC No.2132。
2. 製備權利要求1所述的楊凌青色鏈黴菌TIASA5菌株的方法，其特徵在於，具體包括以下步驟1)將採自陝西楊凌的野生黃花蒿莖組織用清水洗淨後用吸水紙將水分吸乾，在99%乙醇中浸lmin，然後在濃度為3.125%的NaClO中浸6 min，再次放入99。/。乙醇中浸30sec，最後用無菌生理鹽水衝洗5次；2) 將表面消毒後的待分離的黃花蒿莖組織用滅菌刀片動成0.2mm長的小段，置於高氏一號平板上，28'C培養箱培養21 28 d後統計放線菌菌落數並用劃線法進行純化成單菌落；3) 將純化後的單菌落經過如下發酵將在黃豆粉平板上活化培養5 7d的菌苔平板用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，接入黃豆粉培養液中，28°C，150r/min培養36h後，按12%的接種量將種子液接入黃豆粉培養基中，30°C，180r/min發酵72 96h，將培養好的發酵液以10000r/min離心30min，取上清，將製得的發酵上清液用管碟法進行拮抗性篩選，獲得廣譜抗菌效果明顯的拮抗菌株TIASA5;所述的高氏一號由可溶性澱粉20g， KNO3lg，K2HPO40.5g, NaC10.5g，MgSCX 7H20 0.5 g， FeS04 7H20 O.Olg，瓊脂粉13g，蒸餾水lOOOmL組成，且pH為7.2;所述的黃豆粉培養基可容性澱粉5g 、蔗糖10g、蛋白腖2g、酵母膏2g、NaCl 2 g、 K2HPO40.5 g、 MgS04 7H20 0.5 g、 CaC03 lg 、黃豆粉20g煮沸30min過濾、蒸餾水1000ml、 pH為7.2 7.4。
3.權利要求1所述的楊凌青色鏈黴菌TIASA5菌株的抗菌活性物廣，其特徵在於，它是按照下列方法製備的1) 將楊凌青色鏈黴菌TIASA5菌株接在黃豆粉平板上，30。C活化培養5 7d，將菌苔平板用打孔器打成直徑為6mm的菌餅，先將菌餅接入種子培養基中，28°C， 150r/min培養36h後，按12%的接種量將種子液接入發酵培養基中，30。C， 180r/min發酵72h;2) 將培養好的發酵液在10000r/min下離心30min，取上清液進行提取前預處理，即先用1MH2S04將發酵上清液調至pH值為2， 8(TC水浴lh後，再用1M的NaOH調至pH值為7，然後以10000r/min的速度離心30min，收集上清液；3) 將按步驟2)預處理好的上清液過732#離子交換樹脂柱，動態吸附，再用1N的氨水洗脫，根據薄層檢測和\活性跟蹤的結果收集合併活性餾分；4) 將活性餾分減壓濃縮後再冷凍乾燥即得抗菌活性物質；所述的種子培養基由黃豆粉20g，蔗糖10g，可溶性澱粉5g，蛋白腖2g，酵母浸粉2g， NaC12g， CaC03lg， MgS04'7H20 0.5g， KH2PO40.5g，瓊脂15 g，蒸餾水1000mL組成，其pH為7.0;所述的發酵培養基由黃豆粉15g、澱粉7.5g、蔗糖10g、玉米粉15g、酵母粉5g、硫酸銨15g、 NaC12g、 K2HP04 0.5 g、 CaC03 lg、蒸餾水1000mL組成，其pH 7.0-7.2。
4.權利要求1所述的楊凌青色鏈黴菌TIASA5菌株在防治獼猴桃細菌性潰瘍病中的應用。
5.權利要求3所述的楊凌青色鏈黴菌TIASA5菌株的抗菌活性物質在防治
全文摘要
本發明屬於生物農藥技術領域，公開了一種楊凌青色鏈黴菌(Streptomyces glaucus sp.nov yangling)TIASA5菌株的鑑定及其活性物質的製備方法和應用，該菌株已於2007年8月16日保藏在中國科學院微生物所菌株保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為GCMCC No.2132。該菌株對獼猴桃細菌性潰瘍病具有較好的防治作用。該菌株分離自植物組織內，其產生的活性代謝產物對植物組織沒有毒害作用，且性質穩定，噴施方便，便於推廣應用。
文檔編號C12N1/20GK101486982SQ20091002108
公開日2009年7月22日 申請日期2009年2月10日 優先權日2009年2月10日
發明者康振生, 璇 塗, 哲 申, 高小寧, 黃麗麗 申請人:西北農林科技大學