Pcr結合核酸探針斑點雜交技術檢測病料中病毒感染的製作方法

2024-04-01 05:48:05

專利名稱：：Pcr結合核酸探針斑點雜交技術檢測病料中病毒感染的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種PCR結合核酸探針斑點雜交技術檢測病料中病毒感染，屬於獸醫微生物學領域分子生物技術。
背景技術：
：目前，在規模化養禽業和養豬業，病毒的多重感染是普遍性的問題，也是臨床發病的真正原因。但是，對多種病毒的病原學檢測對養殖場來說是一個困難問題。這是因為，很難對多個個體的不同病料同時做不同病毒的分離培養。現代分子生物學技術PCR和核酸探針斑點分子雜交技術有助於解決這一問題。在一切條件完美時，PCR的靈敏度非常高。但在實際應用時，常常出現假陽性和假陰性問題。如，有時PCR產生的DNA條帶雖染大小與預期的一樣，但測序結果表明，卻是一種無關核酸。此外，由於技術性原因，PCR的可重複性也較差，特別是其靈敏度的可重複性較差，常常PCR產物在電泳時看不到核酸條帶。這是因為，PCR產物電泳時，如果加入的DNA量小於50pg，則很難看到條帶。用特異性核酸探針做斑點分子雜交，其特異性較穩定，其檢測靈敏度可達Ipg的同源核酸。但如果病毒感染量小時，在ιμg病料樣品的總DNA中，特異性病毒的核酸可能不足lpg，因而也檢測不出來。如過將PCR和斑點雜交結合起來，則既能確定PCR產物的特異性，也能提高PCR產物的檢出靈敏度。但如果再結合斑點雜交，則只要Ipg就可顯現陽性了。而且，電泳顯示的條帶，並不代表是特異的。
發明內容本發明的目的是為克服PCR在實際應用時，常常出現假陽性和假陰性問題；用特異性核酸探針做斑點分子雜交，但如果病毒感染量小時，在1μg病料樣品的總DNA中，特異性病毒的核酸可能不足lpg，因而也檢測不出來這些不足，而將PCR和斑點雜交結合起來，則既能確定PCR產物的特異性，也能提高PCR產物的檢出靈敏度。但如果再結合斑點雜交，則只要Ipg就可顯現陽性了。先將疑是病毒感染的肉雞樣品DNA用針對可疑病毒的特異性引物PCR擴增後，再對PCR的產物用該病毒的特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR產物的特異性，也大大提高了檢出率。發明的詳細描述1本發明主要步驟(1)病料的收集及樣品DNA的製備取因患病引起不同臨床表現的動物、病死動物的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。按常規方法提取組織DNA，溶解於適量TE緩衝液製備成為樣品DNA。(2)擴增樣品中可疑病毒的特異性核酸片段設計可疑病毒特異性引物(F2/R2)擴增出樣品DNA可疑病毒特異性核酸片段(樣品PCR擴增的片段大小長於探針)，如圖1所示。用於擴增樣品的引物(F2/R2)必須在探針標記用引物(F1/R1)之外，即被標記探針DNA序列之外；其擴增的產物長於標記探針DNA序列。(3)地高辛PCR法標記病毒核酸探針製備及特異性及敏感性的測定利用已知病毒基因組DNA克隆用於標記病毒核酸探針。設計引物(F1/R1)採用地高辛PCR法標記技術，進行地高辛標記製備探針，將純化的病毒的特異性DNA片段作為標記DNA探針的模板，探針標記方法按以上試劑盒操作說明書進行。(4)各樣品及其相應PCR產物用標記的病毒核酸探針進行斑點雜交檢測。2本發明的具體描述(以雞貧血病病毒為例)(1)病料的收集及樣品DNA的製備取疑似雞貧血病病毒(CAV)感染引起不同雞群臨床表現的雞、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。對組織樣品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提緩衝液(IOOmmol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.25mmol/LEDTA,ρΗ8.0,0.5%SDS)和終濃度為100yg/mL的蛋白酶K，55°C消化過夜。次日，按常規方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗裡奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學出版社，1996)提取組織DNA，溶解於適量TE緩衝液(加適量核糖核酸酶)中，即為樣品DNA。同時提取無特異性病原(SPF)雞相應組織的DNA作陰性對照。(2)樣品DNA針對CAV的特異性核酸片段的擴增利用提取的樣品DNA分別用設計的一對引物CAV-vpl_F2和CAV_vpl-R2擴增出樣品DNA的特異性核酸片段(樣品1-12)，片段長度及引物序列如表1所示，樣品PCR擴增的片段大小長於探針，如圖1所示。表1樣品PCR所用的弓丨物序列tableseeoriginaldocumentpage4(3)地高辛PCR法標記病毒核酸探針1)病毒核酸探針的標記利用本發明人保存的雞貧血病毒CAV-vpl基因(李延鵬，崔治中.一株雞傳染性貧血病毒野毒株致病性及全基因組序列比較.微生物學報，2007年47卷5期)作為CAV特異性探針模板DNA用於標記CAV-vpl探針。用Primer5.0軟體設計一對引物見表1(由上海生物工程公司合成)。採用地高辛PCR法標記技術，用羅氏公司的試劑盒(PCRDIGProbeSynthesisKit,Cat.No.11636090910,VersionDecember2005)進行地高辛標記製備探針，探針標記方法按以上試劑盒操作說明書進行。表2=CAV病毒製備核酸探針所用的引物序列引物名稱序列片段長度(bp)CAV-vpl-FlGCATTCCGAGTGGTTACTATTCC842CAV-vpl-RlCGTCTTGCCATCTTACAGTCTTAT2)標記探針特異性和敏感性的測定取適當大小的尼龍膜(羅氏公司)，將上述PCR擴增的探針模板(CAV-vpl基因)DNA片段稀釋成500、50、5、0.5,0.05pg/μL系列濃度，分別取2μL在處理過的尼龍膜上點樣。按照核酸探針標記及檢測試劑盒(PCRDIGProbeSynthesisKit,Cat.No.11636090910,VersionDecember2005；DIGNucleicAcidDetectionKit,Cat.No.11175041910，VersionOctober2008)操作說明進行預雜交、雜交和顯色等步驟，以檢測所製備探針的敏感性。分別取2μLMDV-pp38基因、REV-pol基因和CAV-vpl基因(病毒特異性的DNA)作陰性對照和陽性對照，點於取適當大小的尼龍膜上，與變性的核酸探針雜交，加底物顯色，以檢測所製備探針的特異性。PCR法標記的核酸探針，均只與自身病毒核酸反應顯示棕褐色斑點，而與其它病毒的核酸均不顯顏色，特異性很強(見圖2-1)。每種核酸探針可檢測到Ipg量的特異性核酸片段，具有很高的靈敏度(見圖3-1)。(3)針對CAV病毒樣品的PCR-電泳檢測利用提取的樣品DNA擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖5-1(樣品1_12，並設分子量大小的標誌M:2000DL)。(4)各樣品及其相應PCR產物用CAV-vpl探針，進行斑點雜交檢測將提取的樣品DNA和各樣品的PCR產物分別點在NC膜上，經變性、中和、烤膜、預雜交、雜交、洗膜、鹼性磷酸酶標記的ELASA檢測後，通過斑點的有無判斷結果。具體步驟如下(本發明所用試劑購自羅氏公司PCRDIGProbeSynthesisKit,Cat.No.11636090910和DIGNucleicAcidDetectionKit,Cat.No.11175041910)1)取一張適當大小的硝酸纖維素膜(NC膜，購自羅氏公司)，劃好格子(0.7cmX0.7cm)，做好標記。2)把每個提取的樣品DNA分別點到NC膜上。3)NC膜(點樣面朝上)放於已用變性液(0.5mol/LNaOH,1.5mol/LNaCl)飽和的雙層濾紙上變性lOmin，再放於已用中和液(0.5mol/LTris-Cl，3.0mol/LNaCl,pH7.4)飽和的雙層濾紙上中和5min。4)NC膜室溫乾燥30min，然後在80°C幹烤2h固定DNA。5)將NC膜放於預雜交液(5XSSC，0.2%SDS,2%BlockingReagen,)於68°C反應2h，期間經常搖動NC膜。6)將探針於沸水中變性lOmin，取出後立即置於冰浴中冷卻5min。7)將變性的探針倒入預雜交液中，充分混勻即成雜交液，使NC膜在其中68°C(溫度可調整)雜交6h以上。8)將NC膜放於洗液I(2XSSC，0.1%SDS)中室溫洗滌15min，2次。9)將NC膜放於洗液11(0.5XSSC,0.1%SDS)中68V洗洚15min，2次。10)置NC膜於緩衝液1(0.lmol/LTris-Cl,0.15mol/LNaCl,ρΗ7.5)中洗lmin。11)置NC膜於緩衝液II(BufferI中加入2%BlockingReagen)中反應30min,再用緩衝液I洗lmin。12)在20ml緩衝液II中加入4μ1抗狄可辛抗體的鹼性磷酸酶標記物，用之前經10000r/min離心5min，)，將膜放於其中37°C浸泡30min。13)用緩衝液I洗滌NC膜；5minX5次。14)置NC膜於緩衝液111(0.lmol/LTris-Cl,0.lmol/LNaCl，0.05mol/LMgCl2,pH9.5)中反應浸泡2min。15)在適當大小的容器中加入IOml緩衝液III和100μ1顯色液(NBT和BCIP混合物)，將NC膜放入其中顯色一定時間，加入蒸餾水終止顯色反應。探針片段的陽性PCR產物、陰性PCR產物和長於探針片段的陽性PCR產物，斑點雜交，尼龍膜上出現了明顯的褐色斑點，斑點雜交呈現陽性結果。而長於探針片段的陰性PCR產物，尼龍膜上沒有出現任何斑點，斑點雜交呈現陰性結果，如圖4-1所示。(6)樣品PCR電泳、斑點雜交、PCR產物斑點雜交結果分別用PCR-電泳、斑點雜交和PCR產物斑點雜交(PCR-斑點雜交)檢測各樣品，檢測結果見表3。PCR-電泳、斑點雜交和PCR-斑點雜交的部分結果見圖5-1，圖6-1。經PCR-電泳檢測為陰性的某些樣品，樣品DNA直接經斑點雜交檢測卻有陽性反應；相應樣品的PCR產物經斑點雜交檢測卻有較強的信號；某些經PCR-電泳檢測目的條帶模糊的樣品，相應PCR產物經斑點雜交檢測卻有很強的信號。這些現象說明，核酸探針斑點雜交方法比PCR-電泳靈敏，運用PCR產物斑點雜交方法會更靈敏，能有效地減少漏檢，充分避免PCR中的假陰性現象。表3=PCR-電泳、斑點雜交PCR-斑點雜交結果比較tableseeoriginaldocumentpage6圖1兩對引物位置及擴增片段長度圖2-1CAV探針的靈敏性檢測結果、2-2MDV-pp38探針的靈敏性檢測結果、2-3REV-pol探針的靈敏性檢測結果Al:SPF雞胚組織DNA，BlIng量的探針模板DNA，ClIOOpg量的Ing量的探針模板DNA，D1=IOpg量的探針模板DNA，E1=Ipg量的探針模板DNA，Fl0.Ipg量的探針模板DNA。圖3-1CAV探針的特異性檢測結果Bl=CAV探針模板DNA；Cl=SPF雞胚組織DNA；A2:MDV-pp38基因DNA；B2:REV_pol基因DNA。圖3-2MDV-pp38探針的特異性檢測結果Al:MD_pp38探針DNA；Bl=SPF雞胚組織DNA-M:CAV-vp3DNA；B2:REV_polDNA。圖3-3REV-pol探針的特異性檢測結果Al=SPF雞胚組織DNA；Bl:REV_pol探針模板DNA；Cl:MD-pp38DNA；Dl:CAV_vp3DNA。圖4-lCAV_vp3兩段片段的斑點雜交結果Al探針外片段陽性PCR產物；Bl探針外片段陰性PCR產物；Cl探針陽性PCR產物；Dl探針陰性PCR產物。圖4-2:MD-pp38兩段片段的斑點雜交結果Al探針陰性PCR產物，Bl探針陽性PCR產物，Cl探針外片段陰性PCR產物，Dl探針外片段陽性PCR產物。圖4-3:REV-pol兩段片段的斑點雜交結果Al=SPF雞胚組織DNA；Bl長於探針片段DNA；Cl長於探針片段陰性PCR產物；Dl探針片段DNA；El探針片段陰性PCR產物圖5-1部分樣品的CAV-vpl基因的PCR-電泳結果M:2000DL；1-12樣品PCR產物結果。圖5-2部分樣品的MDV1-PPSS基因的PCR-電泳結果M:2000DL；A陽性對照；1-7樣品PCR產物結果。圖5-3部分樣品的REV-pol基因的PCR-電泳結果M:2000DL；A陰性對照；B陽性對照；1-7樣品PCR產物結果。圖6-1部分樣品DNA和樣品PCR產物斑點雜交結果Al雙蒸水；Bl:SPF雞胚組織DNA；Cl=TEbuffer；D1/F1空白對照；El=CAV探針模板DNA；A2-F2/A4-F4樣品DNA直接斑點雜交結果；A3-F3/A5-F5相應樣品PCR產物斑點雜交結果。圖6-2部分樣品DNA和樣品PCR產物斑點雜交結果Al雙蒸水；1:SPF雞胚組織DNA；Cl馬立克腫瘤組織DNA；Dl探針模板DNA；A2-D3樣品DNA直接斑點雜交結果；F3-I4樣品PCR產物斑點雜交結果。圖6-3部分樣品DNA和樣品PCR產物斑點雜交結果Al雙蒸水，Bl=SPF雞胚組織DNA,Cl:REV探針模板DNA，D1/C4空白對照，E1-B4樣品DNA直接斑點雜交結果，D4-H6相應樣品PCR產物斑點雜交結果。本發明的積極意義在於本發明涉及一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法。本發明將疑是CAV感染的肉雞樣品DNA用特異性引物通過PCR擴增後，對PCR產物再用特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR產物的特異性，也大大提高了檢出率。在22個樣品的PCR產物電泳後，只有7個呈現相應大小的DNA條帶，其餘15個樣品則不現條帶。但是，對PCR產物再用CAV特異性核酸探針做斑點雜交後，全部顯現陽性。結果表明，PCR結合核酸探針斑點雜交技術檢測病料中病毒感染，可顯著提高病毒感染檢測的靈敏度和特異性。實施例本發明提供的實施例為進一步闡述本發明，但這些實施例不構成對本發明作出限制。實施例1PCR結合斑點雜交技術檢測自然發病雞群中MDV的感染(以I型雞馬立克氏病病毒為例)。1病料的收集及樣品DNA的製備取疑似雞I型馬立克氏病病毒(MDV)感染引起不同雞群臨床表現的雞、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。對組織樣品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提緩衝液(IOOmmol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.25mmol/LEDTA，pH8.0,0.5%SDS)禾口終濃度為100yg/mL的蛋白酶K，55°C消化過夜。次日，按常規方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗裡奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學出版社，1996)提取組織DNA，溶解於適量TE緩衝液(加適量核糖核酸酶)中，即為樣品DNA。同時提取無特異性病原(SPF)雞相應組織的DNA作陰性對照。2樣品DNA針對MDV特異性核酸片段的擴增利用提取的樣品DNA分別用設計的一對引物MDV-pp38-F2和MDV-pp38_R2擴增出樣品DNA特異性核酸片段(樣品1-7)，片段長度及引物序列如表4所示，樣品PCR擴增的片段大小長於探針，如圖1所示。表4樣品PCR所用的引物序列引物名稱序列片段長度(bp)MDV-pp38^F2C^GGCATGGGAAAACAGA__________722MDV-pp38-R2CACTCCCCCAACGACAATG3地高辛PCR法標記病毒核酸探針(1)病毒核酸探針的標記利用MDVpp38基因克隆質粒(姜世金，丁家波，孟珊珊等.型馬立克氏病病毒PP38和pp24基的真核表達.中國病毒學，2005年20卷4期)，大小為981bp用於標記MDV-pp38探針。用Primer5.0軟體設計一對引物見表5(由上海生物工程公司合成)。採用地高辛PCR法標記技術，用羅氏公司的試劑盒進行地高辛標記製備探針，探針標記方法按試劑盒操作說明進行。表5=MD病毒製備核酸探針所用的引物序列tableseeoriginaldocumentpage8(2)標記探針特異性和敏感性的測定取適當大小的尼龍膜(羅氏公司)，將上述PCR擴增的探針模板(MDV-pp38基因)DNA片段稀釋成500、50、5、0.5,0.05pg/μL系列濃度，分別取2μL在處理過的尼龍膜上點樣。按照核酸探針標記及檢測試劑盒操作說明進行預雜交、雜交和顯色等步驟，以檢測所製備探針的敏感性。分別取2μLCAV-vp基因l、REV_pol基因、和MDV_pp38基因(病毒特異性的DNA)點於取適當大小的尼龍膜上，與變性的核酸探針雜交，加底物顯色，以檢測所製備探針的特異性。PCR法標記的核酸探針，均只與自身病毒核酸反應顯示棕褐色斑點，而與其它病毒的核酸均不顯顏色，特異性很強(見圖2-2)。每種核酸探針可檢測到Ipg量的特異性核酸片段，具有很高的靈敏度(見圖3-2)。(3)針對MDV樣品的PCR-電泳檢測利用提取的樣品DNA擴增產物(樣品1-7)，並設M:2000DL和陽性對照(MDV_pp38基因DNA片段)進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖5-2。(4)各樣品及其相應PCR產物用MD-pp38探針，進行斑點雜交檢測將提取的樣品DNA和各樣品的PCR產物分別點在NC膜上，經變性、中和、烤膜、預雜交、雜交、洗膜、免疫學檢測後，通過斑點的有無判斷結果。探針片段的陽性PCR產物、陰性PCR產物和長於探針片段的陽性PCR產物，斑點雜交，尼龍膜上出現了明顯的褐色斑點，斑點雜交呈現陽性結果。而長於探針片段的陰性PCR產物，尼龍膜上沒有出現任何斑點，斑點雜交呈現陰性結果，如圖4-2所示。(5)樣品PCR電泳、斑點雜交、PCR產物斑點雜交結果分別用PCR-電泳、斑點雜交和PCR產物斑點雜交(PCR-斑點雜交)檢測各樣品，檢測結果見表3。PCR-電泳、斑點雜交和PCR-斑點雜交的部分結果見圖5-2，圖6_2。經PCR-電泳檢測為陰性的某些樣品，樣品DNA直接經斑點雜交檢測卻有陽性反應；相應樣品的PCR產物經斑點雜交檢測卻有較強的信號；某些經PCR-電泳檢測目的條帶模糊的樣品，相應PCR產物經斑點雜交檢測卻有很強的信號。這些現象說明，核酸探針斑點雜交方法比PCR-電泳靈敏，運用PCR產物斑點雜交方法會更靈敏，能有效地減少漏檢，充分避免PCR中的假陰性現象。PCR-電泳和斑點雜交和PCR-斑點雜交比較結果見表6。表6MDVJCR-電泳、斑點雜交PCR-斑點雜交結果比較—~PCR-電泳斑點雜交+-+-PCR產物斑點雜交+6211413實施例2PCR結合斑點雜交技術檢測自然發病雞群中REV病毒的感染1病料的收集及樣品DNA的製備取疑似禽網狀內皮增生病病毒(REV)感染引起不同雞群臨床表現的雞、死雞的肝臟、脾臟、心臟、腎臟、胸腺、骨髓等。對組織樣品，各取0.02g研磨，加入0.5mLDNA抽提緩衝液(IOOmmol/LNaCl,10mmol/LTris-Cl,pH8.0,0.25mmol/LEDTA，pH8.0,0.5%SDS)禾口終濃度為100yg/mL的蛋白酶K，55°C消化過夜。次日，按常規方法(J.薩姆布魯克、E.F.弗裡奇、T.曼尼阿蒂斯著.金冬雁，黎孟楓等譯.分子克隆實驗指南第二版.科學出版社，1996)提取組織DNA，溶解於適量TE緩衝液(加適量核糖核酸酶)中，即為樣品DNA。同時提取無特異性病原(SPF)雞相應組織的DNA作陰性對照。2樣品DNA針對REV特異性核酸片段的擴增利用提取的樣品DNA分別用設計的一對引物REV-pol-F2和REV-pol_R2擴增出樣品DNA特異性核酸片段(樣品1-7)，片段長度及引物序列如表7所示，樣品PCR擴增的片段大小長於探針，如圖1所示。表7樣品PCR所用的引物序列tableseeoriginaldocumentpage103地高辛PCR法標記病毒核酸探針(1)病毒核酸探針的標記利用本發明人保存的REV-pol(王玉，崔治中，姜世金.網狀內皮組織增生症病毒中國分離株HA9901全基因組核苷酸序列的測定與分析，中國科學，C輯，2005，351-9)，基因大小為3482bp，用於標記REV-pol探針。用Primer5.0軟體設計一對引物見表8(由上海生工合成)。採用地高辛PCR法標記技術，用羅氏公司的試劑盒進行地高辛標記製備探針，作為標記DNA探針的模板，探針標記方法按試劑盒操作說明進行。表8:REV病毒製備核酸探針所用的引物序列tableseeoriginaldocumentpage10(2)標記探針特異性和敏感性的測定取適當大小的尼龍膜(羅氏公司)，將上述PCR擴增的探針模板(REV-pol基因)DNA片段稀釋成500、50、5、0.5,0.05pg/μL系列濃度，分別取2μL在處理過的尼龍膜上點樣。按照核酸探針標記及檢測試劑盒操作說明進行預雜交、雜交和顯色等步驟，以檢測所製備探針的敏感性。分別取2μLCAV-vpl、MDV-pp38和REV-pol探針模板DNA點於取適當大小的尼龍膜上，與變性的核酸探針雜交，加底物顯色，以檢測所製備探針的特異性。PCR法標記的核酸探針，均只與自身病毒核酸反應顯示棕褐色斑點，而與其它病毒的核酸均不顯顏色，特異性很強(見圖2-3)。每種核酸探針可檢測到Ipg量的特異性核酸片段，具有很高的靈敏度(見圖3-3)。(3)針對REV樣品的PCR-電泳檢測利用提取的樣品DNA分別擴增REV特異性核酸片段(樣品1_7)，並設M:2000DL、陰性對照(SPF雞相應組織的DNA作為模板的PCR產物)和陽性對照(用已知REV-pol基因為模板的PCR產物)進行瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖5-3。(4)各樣品及其相應PCR產物用REV-pol探針，進行斑點雜交檢測將提取的樣品DNA和各樣品的PCR產物分別點在NC膜上，經變性、中和、烤膜、預雜交、雜交、洗膜、免疫學檢測後，通過斑點的有無判斷結果。探針片段的陽性PCR產物、陰性PCR產物和長於探針片段的陽性PCR產物，斑點雜交，尼龍膜上出現了明顯的褐色斑點，斑點雜交呈現陽性結果。而長於探針片段的陰性PCR產物，尼龍膜上沒有出現任何斑點，斑點雜交呈現陰性結果，如圖4-3所示。(5)樣品PCR電泳、斑點雜交、PCR產物斑點雜交結果分別用PCR-電泳、斑點雜交和PCR產物斑點雜交(PCR-斑點雜交)檢測各樣品，檢測結果見表9。PCR-電泳、斑點雜交和PCR-斑點雜交的部分結果見圖5-3，圖6_3。經PCR-電泳檢測為陰性的某些樣品，樣品DNA直接經斑點雜交檢測卻有陽性反應；相應樣品的PCR產物經斑點雜交檢測卻有較強的信號；某些經PCR-電泳檢測目的條帶模糊的樣品，相應PCR產物經斑點雜交檢測卻有很強的信號。這些現象說明，核酸探針斑點雜交方法比PCR-電泳靈敏，運用PCR產物斑點雜交方法會更靈敏，能有效地減少漏檢，充分避免PCR中的假陰性現象。PCR-電泳和斑點雜交和PCR-斑點雜交比較結果見表9。表9:REVPCR-電泳、斑點雜交PCR-斑點雜交結果比較tableseeoriginaldocumentpage11權利要求一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特徵在於先將疑是病毒感染的動物組織樣品DNA用針對可疑病毒的特異性引物PCR擴增後，再對PCR的產物用該病毒的特異性核酸探針做斑點雜交。2.如權利要求1所述的一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特徵在於本發明在利用PCR技術結合斑點雜交檢測樣品時，用於擴增樣品DNA的引物F2/R2必須在探針標記用引物F1/R1之外，也就是在被標記核酸探針DNA序列之外。3.如權利要求1、2所述的一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特徵在於檢測禽貧血病毒的探針標記的引物CAV-vpl-Fl/CAV-vpl-Rl為序列1/序列2，擴增樣品的引物CAV-vpl-F2/CAV-vpl-R2為序列4/序列5。4.如權利要求1、2所述的一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特徵在於檢測I型馬立克氏病病毒的探針標記的引物MDV-pp38-Fl/MDV-pp38-Rl為序列6/序列7，擴增樣品的引物MDV-vpl-F2/MDV-pp38-R2為序列9/序列10。5.如權利要求1、2所述的一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法，其特徵在於檢測禽網狀內皮增生病毒的探針標記的引物REV-pol-Fl/REV-pol-Rl為序列11/序列12，擴增樣品的引物REV-pol-F2/REV-pol-R2為序列14/序列15。全文摘要本發明涉及一種PCR結合核酸探針斑點雜交檢測病料中病毒感染的方法。本發明將疑是病毒感染的動物組織樣品DNA用針對可疑病毒的特異性引物PCR擴增後，對PCR產物再用該病毒特異性核酸探針做斑點雜交，不僅能顯示PCR產物的特異性，也大大提高了檢出率。本發明試驗結果表明，PCR結合核酸探針斑點雜交技術檢測病料中病毒感染，可顯著提高病毒感染檢測的靈敏度和特異性。文檔編號C12Q1/68GK101824487SQ20101014226公開日2010年9月8日申請日期2010年4月9日優先權日2010年4月9日發明者崔治中申請人:山東農業大學